ПРОИЗВОДНЫЕ БЕНЗОТИАЗОЛА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВОМ СВЯЗЫВАТЬ АМИЛОИД, И СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ОТЛОЖЕНИЙ АМИЛОИДА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО Российский патент 2012 года по МПК C07D277/66 C07B59/00 A61K51/04 A61K101/00 A61K101/02 A61P25/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области органической химии, медицины и фармакологии, конкретно к специфическим тиофлавиновым производным, которые пригодны для визуализации отложений амилоида у больных при жизни. В частности, данное изобретение относится к способу визуализации отложений амилоида в головном мозге in vivo с целью получения прижизненного диагноза болезни Альцгеймера при использовании этих тиофлавиновых производных.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера ("AD") представляет собой нейродегенеративное заболевание, характеризующееся потерей памяти и другими недостатками познавательной способности. См. статью McKhann и соавт., Neurology, 34: 939, (1984). Она является распространенной причиной деменции в Соединенных Штатах. AD может поражать людей в таком молодом возрасте, как 40-50 лет, хотя, поскольку наличие заболевания трудно установить без проведения опасной биопсии головного мозга, время его начала неизвестно. Распространенность AD с возрастом повышается, при этом по приблизительной оценке пораженная популяция достигает такого уровня, как 40-50% в возрасте 85-90 лет. См. статьи Evans и соавт., JAMA, 262: 2551, (1989); Katzman, Neurology, 43: 13, (1993).

Исследования предполагают, что отложение амилоида в головном мозге представляет собой раннее причинное событие в патогенезе болезни Альцгеймера (AD). Развитие отложения амилоида приводит в результате к образованию невритных бляшек и нейрофибриллярных клубочков в областях головного мозга, которые участвуют в обучении и памяти. Типичная невритная бляшка Альцгеймера содержит дистрофические невриты, окружающие ядро амилоидного материала. Основным компонентом амилоидного ядра является белок, называемый амилоидом-β (Аβ).

Практически окончательный диагноз AD ставят на основании исследования ткани головного мозга, обычно при аутопсии. См. статьи Khachaturian, Arch. Neurol., 42: 1097, (1985); McKhann и соавт., Neurology, 34: 939, (1984). С точки зрения невропатологии данное заболевание характеризуется присутствием невритных бляшек (NP), нейрофибриллярных клубочков (NFT) и потерей нейронов наряду с множеством других признаков. См. статью Mann, Mech. Ageing Dev., 31: 213, (1985). Посмертные срезы ткани головного мозга жертв болезни Альцгеймера демонстрируют присутствие амилоида в форме белковых экстрацеллюларных ядер невритных бляшек, характерных для AD.

Амилоидные ядра данных невритных бляшек состоят из белка, называемого β-амилоид (Аβ), который имеет в основном конфигурацию β-складчатого листа. См статьи Mori и соавт., Journal of Biological Chemistry, 267: 17082, (1992); Kirschner и соавт., PNAS, 83: 503, (1986). Невритные бляшки являются ранним и инвариантным аспектом заболевания. См. статьи Mann и соавт., J. Neurol. Sci., 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev., 31: 213, (1985); Terry и соавт., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 46: 262, (1987).

Изначальное отложение Аβ, вероятно, происходит задолго до того, как становятся заметными клинические проявления. Основой рекомендуемых в настоящее время "минимальных микроскопических критериев" для диагностики AD является число невритных бляшек, обнаруженных в головном мозге. См. статью Khachaturian, Arch. Neurol., supra, (1985). Однако оценка числа невритных бляшек должна быть отложена до смерти.

Содержащие амилоид невритные бляшки являются ведущим признаком избранных участков головного мозга при AD, а также при синдроме Дауна и у субъектов, гомозиготных по аллелю аполипопротеина Е4, у которых с большой долей вероятности разовьется AD. См. статьи Corder и соавт., Science, 261: 921 (1993); Divry P., J. Neurol. Psych., 27: 643-657 (1927); материал Wisniewski и соавт. в монографии Развитие невропатологии (Progress in neuropathology) под ред. Zimmerman H.M. (Grune and Stratton, N.Y., 1973) стр.1-26. Амилоид головного мозга легко продемонстрировать путем окрашивания срезов головного мозга тиофлавином S или Конго красным. См. статью Puchtler и соавт., J. Histochem. Cytochem., 10:35 (1962). Амилоид, окрашенный Конго красным, характеризуется дихроическим видом, демонстрируя желто-зеленое поляризационное окрашивание. Дихроическое связывание является результатом структуры β-складчатого листа белков амилоида. См. статью Glenner G.N., Eng. J. Med., 302: 1283, (1980). Детальное обсуждение биохимии и гистохимии амилоида можно найти в статье Glenner G.N., Eng. J. Med., 302: 1333, (1980).

До сих пор диагностику AD осуществляли в основном посредством оценки клинических критериев, биопсии головного мозга и посмертных исследований тканей. Усилия исследователей разработать способы диагностики болезни Альцгеймера in vivo включают (1) генетическое тестирование, (2) способы иммуноанализа и (3) методики визуализации.

Доказательство того, что аномалии в метаболизме Аβ необходимы и достаточны для развития AD, основано на обнаружении точечных мутаций в белке-предшественнике Аβ в ряде редких семей с аутосомной доминантной формой AD. См. статьи Hardy, Nature Genetics, 1: 233 (1992); Hardy и соавт., Science, 256: 184 (1992). Данные мутации присутствуют около N- и С-концевых точек расщепления, необходимых для образования Аβ из его белка-предшественника. См. статьи St. George-Hyslop и соавт., Science, 235: 885, (1987); Kang и соавт., Nature, 325: 733 (1987); патентную заявку Potter, WO 92/17152. Однако генетический анализ большого числа семей, подверженных AD, продемонстрировал генетическую гетерогенность AD. См. статью St. George-Hyslop и соавт., Nature, 347: 194 (1990). Сцепление с маркерами хромосомы 21 показано только для нескольких семей с ранним началом развития AD и не показано для семей с поздним началом развития AD. Совсем недавно ген на хромосоме 14, продукт которого, как предсказано, содержит множество трансмембранных доменов и напоминает интегральный мембранный белок, был идентифицирован Sherrington и соавт., Nature, 375: 754-760 (1995). Действием данного гена можно объяснить до 70% случаев раннего развития аутосомного доминантного AD. На основании предварительных данных предполагают, что данная мутация на хромосоме 14 вызывает повышение продукции Аβ. См. статью Scheuner и соавт., Soc. Neurosci. Abstr., 21: 1500, (1995). Мутация очень близкого гена была идентифицирована на хромосоме 1 на протяжении поколений в семьях поволжских немцев, у которых рано развивается AD. См. статью Levy-Lahad и соавт., Science, 269: 973-977, (1995).

Полагают, что скрининг генотипа аполипопротеина Е помогает в диагностике AD. См. статьи Scott, Nature, 366: 502, (1993); Roses, Ann., Neurol., 38: 6-14, (1995). Однако в данной методике возникают сложности, поскольку аллель аполипопротеина Е4 представляет собой только фактор риска развития AD, а не маркер заболевания. Он отсутствует у многих больных AD и присутствует у многих пожилых людей, не пораженных деменцией. См. статью Bird, Ann. Neurol., 38: 2-4, (1995).

Для детекции присутствия нейрохимических маркеров у больных AD и детекции связанного с AD белка амилоида в спинномозговой жидкости были разработаны способы иммуноанализа. См. статью Warner, Anal. Chem., 59: 1203А, (1987); Международная заявка 92/17152, принадлежащая Potter; Патент США NO 4666829, выданный Glenner и соавт. Данные способы диагностики AD, как было доказано, не выявляют AD у всех больных, в особенности на ранних стадиях заболевания, и они относительно инвазивны, поскольку требуют спинномозговой пункции. Были также предприняты попытки создания моноклональных антител для использования в качестве зондов для визуализации Аβ. См. статью Majocha и соавт., J. Nucl. Med., 33: 2184, (1992); патентную заявку Majocha и соавт. WO 89/06242 и Патент США 5231000, выданный Majocha и соавт. Основной недостаток зондов на основе антител состоит в трудности переноса данных крупных молекул через гематоэнцефалический барьер. Использование антител для диагностики AD in vivo потребовало бы наличия заметных аномалий в гематоэнцефалическом барьере для того, чтобы создать избыток в головном мозге. Не существует убедительных функциональных доказательств, что аномалии в гематоэнцефалическом барьере достоверно существуют при AD. См. статью Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Reviews, 4: 226, (1992).

Пептид Аβ с радиоактивной меткой использовали для мечения бляшек диффузного, компактного и невритного типа в срезах головного мозга, пораженного AD. См. заявку Maggio и соавт. WO 93/04194. Однако данные пептиды сохраняли все недостатки антител. В частности, пептиды в количествах, необходимых для визуализации, нормально не проникали через гематоэнцефалический барьер и, поскольку данные зонды реагируют с диффузными бляшками, они могут не иметь специфичности в отношении AD.

Невритные бляшки и нейрофибриллярные клубочки (NFT) представляют собой два наиболее характерных патологических признака AD. См. статью Klunk и Abraham, Psychiatric Development, 6:121-152, (1988). Бляшки ранее всего возникают в новой коре головного мозга, в которой они распределены относительно равномерно. См. статью Thal и соавт., Neurology, 58:1791-1800, (2002). Клубочки сначала появляются в лимбических областях, таких как трансенторинальная кора головного мозга, и развиваются как предсказуемый топографический тип в новой коре головного мозга. См. статью Braak и Braak, Acta Neuropathologica, 82:239-259, (1991). Arnold и соавт. картировали распределение NFT и невритных бляшек в головном мозге пациентов с AD. См. статью Arnold и соавт., Cereb. Cortex, 1:103-116, (1991). По сравнению с NFT невритные бляшки были, как правило, более равномерно распределены в коре головного мозга за исключениями заметно меньшего количества невритных бляшек в лимбическом периаллокортексе и аллокортексе (области с наибольшей плотностью NFT). При окрашивании тиофлавином-S височные и затылочные доли имели самую высокую плотность невритных бляшек, лимбические и лобные доли имели самую низкую, и теменная доля была средней. См. статью Arriagada и соавт., Neurology, 42:1681-1688, (1992). Arriagada и соавт. изучали топографическое распределение патологических изменений AD-типа в головном мозге пожилых субъектов с доказанным отсутствием деменции. Данные результаты предполагают, что у большинства субъектов в возрасте свыше 55 лет имеется по меньшей мере немного NFT и бляшек. Иммуногистохимически определенные подтипы SP имели определенные типы распределения, причем Аβ-иммунореактивные бляшки присутствуют в областях новой коры головного мозга в значительно большем количестве, чем в лимбических областях, и Alz-50-иммунореактивные бляшки встречаются реже и ограничены теми областями, которые содержат Alz-50-положительные нейроны и NFT. Данные типы предполагают наличие общности в патологических процессах, которая ведет к NFT и SP как при старении, так и при AD.

Остается обсудить вопрос, являются ли бляшки и клубочки побочными продуктами нейродегенеративного процесса, обнаруженного при AD, или они представляют собой причину гибели нервных клеток. См. статьи Ross, Current Opinion in Neurobiol., 96:644-650, (1996); Terry, J. of Neuropath. & Exp. Neurol., 55:1023-1025, (1996); Terry, J. Neural Transmission-Suppl., 53:141-145, (1998). Имеется явное доказательство того, что потеря синапсов новой коры головного мозга и гиппокампа хорошо коррелирует с преморбидным когнитивным статусом. Некоторые исследователи предполагают, что нарушение структуры и функции микротрубочек, вызываемое гиперфосфорилированием белка tau, связанного с микротрубочками, играет ключевую этиологическую роль в потере синапсов, в частности, и AD, в целом. См. статьи Terry, J. of Neuropath. & Exp. Neurol., 55:1023-1025, (1996); Terry, J. of Neural Transmission-Suppl., 53:141-145, (1998). Было сделано предположение, что окислительное повреждение и разрушение мембран играют важные роли в AD. См. статьи Perry, Free Radical Biology & Medicine, 28:831-834, (2000); Pettegrew и соавт., Annals of the New York Academy of Sciences, 826:282-306, (1997). Сосудистые факторы, включая замедленную хроническую церебральную гиперфузию, также участвуют в патогенезе AD. См. статьи De la Torre, Annals of the New York Academy of Sciences, 903:424-436, (2000); Di lorio и соавт., Aging (Milano), 11:345-352, (1999). Хотя все данные факторы, вероятно, играют определенную роль в патогенезе AD, увеличивается количество фактов, указывающее на аномалии в процессировании пептида амилоида-β (Аβ), пептида молекулярной массы 4 кД, который агрегируется с образованием фибриллярной структуры β-складчатой поверхности. См. статью Glenner и Wong, Biochemical & Biophysical Research Communications, 120:885-890, (1984). Предполагают, что Аβ играет важную роль в патогенезе AD по ряду причин: 1) отложения Аβ представляют собой самые ранние нейропатологические маркеры AD при синдроме Дауна и могут предшествовать формированию NFT за несколько десятилетий, см. статью Mann и соавт., Neurodegeneration, 1:201-215, (1992); Naslund и соавт., JAMA, 283:1571-1577, (2000). 2) β-амилоидоз относительно специфичен для AD и близкородственных нарушений; см. статью Selkoe, Trends in Neurosciences, 16:403-409, (1993); 3) Аβ токсичен для культуры нейронов, Yankner Neurobiol. Aging, 13:615-616, (1992); Mattson и соавт., J. Neuroscience, 12:376-389, (1992); Shearman и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1470-1474, (1994), причем токсичность, по-видимому, зависит от вторичной структуры β-складки и агрегации в по меньшей мере олигомеры. См. статьи Lambert и соавт., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6448-6453, (1989); Pike и соавт., J. Neuroscience 13:1676-1687, (1993); Simmons

и соавт., Molecular Pharmacology, 45:373-379, (1994). Хотя Аβ, несомненно, находится в виде равномерно распределенных мономерных, олигомерных и фибриллярных/бляшечных фракций, олигомерная форма Аβ в значительной степени действует как ключевой нейротоксический компонент. См. Selkoe в монографии Болезнь Альцгеймера (Alzheimer заболевание) под ред. R.D.Terry и соавт., с. 293-310, Lippincott Williams и Wilkins, Philadelphia (1999); статью Selkoe, Science 298, 789-91, (2002). Понимание токсических эффектов олигомерного Аβ создало основу для дискредитации ряда оппонентов "гипотезы амилоидного каскада" в развитии AD. См. статью Terry, Ann. Neurol., 49:684, (2001). Возможно, самое сильное доказательство роли Аβ в патогенезе AD исходит из обнаружения мутаций в гене белка предшественника амилоида (АРР), которые приводят к некоторым формам раннего начала семейной формы AD. См. статью Goate и соавт., Nature, 349:704-706, (1991). Кроме того, все семейные формы аутосомной доминантной AD обычно характеризуются повышенным уровнем ускоренно агрегирующейся формы Аβ из 42 аминокислот. См. статью Younkin Rinsho Shinkeigaku, Clinical Neurology, 37:1099, (1997). Напротив, показано, что никакие мутации в белке tau не вызывают AD. Вместо этого мутации в tau (хромосома 17) сцеплены с лобновисочной деменцией, связанной с Паркинсонизмом. См. статью Goedert и соавт., Neuron, 21:955-958, (1998). Недавно полученные факты показали хорошую корреляцию между уровнями Аβ в головном мозге и снижением когнитивной способности при AD, и отложение амилоида, по-видимому, представляет собой очень раннее, возможно, первое событие в патогенезе AD, предшествующее какому-либо когнитивному нарушению. См. статью Naslund и соавт., JAMA 283:1571-1577, (2000). Его наличие может модулировать ряд биохимических путей, которые приводят в результате к отложению еще других белков, активации астроглии и микроглии и в конечном счете гибели нервных клеток и последующему когнитивному расстройству.

На основании имеющихся данных можно предположить, что связывающие амилоид соединения будут обладать терапевтической активностью при AD и сахарном диабете типа 2. Все морфологические реакции, включая присутствие реактивных астроцитов, дистрофические невриты, активированные клетки микроглии, потерю синапсов и полную активацию комплемента, которые обнаруживают вокруг невритных бляшек, указывают на то, что нейротоксические и дегенеративные в отношении клеток процессы происходят на участках, прилежащих к данным отложениям Аβ. См. статьи Joachim и соавт., Am. J. Pathol., 136: 309, (1989); Masliah и соавт., loc. cit., 137: 1293 (1990); Lue и Rogers, Dementia, 3: 308, (1992). Индуцированные Аβ нейротоксичность и дегенерация клеток были показаны для ряда типов клеток in vitro. См. статьи Yankner и соавт., Science, 250: 279, (1990); Roher и соавт., BBRC, 174: 572, (1991); Frautschy и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 83362, (1991); Shearman и соавт., loc. cit., 91: 1470, (1994). Было показано, что агрегация пептида Аβ необходима для проявления нейротоксичности in vitro. См. статью Yankner, Neurobiol. Aging, 13: 615, (1992). Недавно были представлены результаты работы трех лабораторий, которые предполагают, что Конго красный ингибирует индуцируемую Аβ нейротоксичность и дегенерацию клеток in vitro. См. статьи Burgevin и соавт., NeuroReport, 5: 2429, (1994); Lorenzo и Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 12243, (1994); Pollack и соавт., Neuroscience Letters, 197: 211, (1995). По-видимому, механизм включает как ингибирование образования фибрилл, так и предупреждение нейротоксических проявлений образованных фибрилл. См. статью Lorenzo and Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 12243, (1994). Конго красный, как также было показано, защищает клетки островков поджелудочной железы от токсичности, обусловленной амилином. См. статью Lorenzo и Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 12243, (1994). Амилин представляет собой фибриллярный пептид, близкий Аβ, который накапливается в поджелудочной железе при сахарном диабете типа 2. В уровне техники известно, что некоторые азокрасители, такие как Конго красный, могут быть канцерогенными. См. статью Morgan и соавт., Enviromental Health Perspectives, 102 (допол.), 2: 63-78, (1994). Данная потенциальная канцерогенность, по-видимому, в основном базируется на том факте, что азокрасители широко метаболизируются кишечными бактериями до исходных свободных аминов. См. статью Cerniglia и соавт., Biochem. Biophys. Res. Corn., 107: 1224-1229, (1982). В случае бензидиновых красителей (и многих других замещенных бензидинов) данный свободный амин является канцерогеном. Данные факты не имеют большого значения для исследований, связанных с визуализацией амилоида, в которых очень маленькое количество красителя с радиоактивной меткой, обладающего высокоспецифической активностью, должно инъекционно вводиться непосредственно в кровоток. В данном случае введенное количество было бы незначительным, и краситель не вступал бы в контакт с кишечными бактериями.

В случае терапевтического применения данные факты имеют важное значение. Выделение известного канцерогена из терапевтического соединения является неприемлемым. Вторая проблема, касающаяся метаболизма диазокрасителей, состоит в том, что значительная часть введенного лекарственного соединения метаболизируется кишечными бактериями до всасывания. Недостаток в виде данной пониженной биодоступности сохраняется даже, когда выделяемые метаболиты являются безвредными.

Тиофлавин Т

представляет собой основной краситель, описанный как избирательный краситель для амилоида в 1959 г. Vassar и Culling (см. Arch. Pathol., 68: 487, (1959)). Schwartz и соавт. (см. Zbl. Path., 106: 320, (1964)) впервые продемонстрировали в 1964 г. применение кислого красителя Тиофлавина S (структурную формулу см. на Фиг.1) в качестве красителя для амилоида. С тех пор свойства как Тиофлавина Т, так и Тиофлавина S были детально изучены. См. статьи Kelenyi, J. Histochem. Cytochem., 15: 172, (1967); Burns и соавт., J. Path. Bact., 94:337, (1967); Guntern и соавт., Experimentia, 48: 8, (1992); LeVine, Meth. Enzymol., 309: 274, (1999).

Тиофлавин S обычно используют в посмертных исследованиях отложения амилоида в головном мозге, пораженном AD, в которых окрашивание им, как было показано, является одной из наиболее чувствительных методик для демонстрации сенильных бляшек. См. статью Vallet и соавт., Acta Neuropathol., 83:170, (1992). Тиофлавин также часто использовали в качестве реагента для изучения агрегации растворимых белков амилоида с образованием фибрилл со структурой β-складки. См. статью LeVine, Prot. Sci., 2: 404, (1993).

Производные четвертичного амина, относящиеся к Тиофлавину Т, рассматривали как агенты для визуализации амилоида, хотя не было представлено никаких доказательств поглощения данных агентов головным мозгом. См. Патент США 6001331, выданный Caprathe и соавт. (прототип).

Поскольку отложение амилоида может происходить задолго до того, как клинические симптомы AD становятся заметными, выявление и количественное определение отложений амилоида могло бы облегчить диагностику AD на ее ранних предсимптоматических стадиях. См. Патент США No. 6417178. Методики визуализации, такие как эмиссионная позитронная томография (PET) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), эффективны при мониторинге накопления отложений амилоида в головном мозге и их корреляции с развитием AD.

Однако применение данных методик требует разработки радиолигандов, которые легко проходят в головной мозг и селективно связываются с отложениями амилоида in vivo.

Отсутствие возможности оценить отложение амилоида при AD до наступления смерти затрудняет изучение данной разрушающей болезни.

Способ количественной оценки отложения амилоида до наступления смерти необходим как в качестве диагностического инструмента при умеренных проявлениях или в клинически неясных случаях, так и для мониторирования эффективности терапевтических средств, направленных на предупреждение отложения Аβ.

Несмотря на то что предпринимались различные попытки диагностировать AD in vivo, в настоящее время не имеется зондов для определения амилоида в головном мозге при жизни.

Ни в каком из способов не используют высокоаффинный зонд для амилоида, который имеет низкую токсичность, может проходить через гематоэнцефалический барьер и более эффективно связывается с головным мозгом, пораженным AD, чем с нормальным головным мозгом, с целью прижизненной идентификации отложений амилоида при AD в головном мозге больного. Ни один из способов диагностики AD in vivo не продемонстрировал соответствия данным критериям.

Таким образом, имеется потребность в амилоид-связывающих соединениях, которые нетоксичны и могут проходить через гематоэнцефалический барьер и, следовательно, могут быть использованы в диагностике, что составляет изобретательскую задачу данного изобретения.

Также имеется потребность в новых разработанных амилоид-связывающих радиолигандах, которые нетоксичны, способны селективно связываться с отложениями амилоида и могут проходить через гематоэнцефалический барьер и, следовательно, могут быть использованы в эффективных методиках визуализации, таких как эмиссионная позитронная томография (PET) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), что также составляет изобретательскую задачу данного изобретения.

Далее, разработка безопасного и специфического прижизненного (в условиях in vivo) способа диагностики путем визуализации амилоида в паренхиме головного мозга с помощью новых разработанных радиолигандов также сохраняет чрезвычайную важность и также составляет изобретательскую задачу.

Сущность изобретения

Таким образом, изобретательской задачей является поиск новых производных тиофлавина Т (производных бензотиазола), которые могли бы в силу их специфичности к связыванию амилоидных белков, нетоксичности, способности проникать через внутренние барьеры организма, быть использованы для визуализации отложений амилоида в условиях in vivo, предпочтительно в виде радиолигандов в таких эффективных методиках визуализации, как эмиссионная позитронная томография (PET) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), предпочтительно для диагностики заболеваний, при которых преобладает кумуляция невритных бляшек, таких как болезнь Альцгеймера, семейная форма болезни Альцгеймера, синдром Дауна и гомозиготы по аллелю Е4 аполипопротеина.

В этом плане авторы данного изобретения установили, что варьирование замещений в различных положениях может повышать аффинность связывания в зависимости от положения заместителя.

Кроме того, авторы данного изобретения разработали серию незаряженных производных тиофлавина Т как агентов для визуализации амилоида, которые обладают высокой аффинностью в отношении отложений амилоида и высокой способностью проникновения через гематоэнцефалический барьер.

Широкие исследования in vitro и in vivo данных агентов для визуализации амилоида показали, что они способны специфически связывать отложения амилоида в концентрациях, которые обычно используются при исследованиях с использованием эмиссионной позитронной томографии.

В сложной среде головного мозга неспецифическое связывание данных соединений для визуализации амилоида является низким, даже в контрольном мозге, не имеющим отложений амилоида. В наномолярных концентрациях данные соединения, по-видимому, не связываются с нейрофибриллярными клубочками.

Соединения, используемые для указанных выше целей, соответствуют следующей формуле:

где Z представлено S, NR', О или C(R')², в таком случае таутомерной формой гетероциклического кольца может стать индол, в котором R' означает Н или группу низшего алкила:

где Y - NR¹R², OR² или SR²;

где атом азота в азольном или тиазольном ядре не является азотом четвертичного амина ,

при этом каждое из R¹ и R² независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из Н, группы низшего алкила, (CH₂)_n2OR' (где n=1, 2 или 3), СF₃, CH₂-CH₂X, CH₂-CH₂-CH₂X (где X=F, Cl, Br или I), (C=O)-R', R_ph и (CH₂)_nR_ph (где n=1, 2, 3 или 4 и R_ph представляет собой незамещенную или замещенную фенильную группу с фенильными заместителями, выбранными из любых нефенильных заместителей, определенных ниже для R³-R¹⁰, и R' представляет собой Н или группу низшего алкила);

каждое из R³-R¹⁰ независимо выбраны из группы, состоящей из Н, F, Cl, Br, I, группы низшего алкила, (CH₂)_nOR' (где n=1, 2 или 3), СF₃, CH₂-CH₂X, О-СН₂-СН₂Х, СН₂-СН₂-СН₂X, O-CH₂-CH₂-CH₂X (где X=F, Cl, Br или I), CN, (C=O)-R', N(R')₂, NO₂, (C=O)N(R')₂, O(CO)R', OR', SR', COOR' R_ph, CR'=CR'-R_ph, CR₂'-CR₂'-R_ph (где R_ph представляет собой незамещенную или замещенную фенильную группу с фенильными заместителями, выбранными из любых нефенильных заместителей, определенных для R¹-R¹⁰, и где R' представляет собой Н или группу низшего алкила); триалкилолово и хелатирующей группы (содержащей или не содержащей хелатированную группу металла) формы W-L или V-W-L, в которой V выбрано из группы, состоящей из -СОО-, -СО-, -CH₂O- и -CH₂NH-; W представляет собой -(СН₂)_n, где n=0, 1, 2, 3, 4 или 5, и L представляет собой

, , ,

, , , или

где М выбрано из группы, состоящей из Тc и Re.

Другой вариант осуществления относится к соединениям формулы

или фармацевтически приемлемой соли, гидрату, сольвату или пролекарственной форме соединения, в которой

R¹ представляет собой водород, -ОН, -NO₂, -CN, -COOR, -OCH₂OR, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆алкоксигруппу или галоген, где один или более атомов R¹ может представлять собой радиоактивно меченный атом;

R представляет собой C₁-C₆алкил, в котором один или более атомов углерода может представлять собой радиоактивно меченный атом;

R² представляет собой водород, нерадиоактивный галоген или радиоактивный галоген;

R³ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил и

R⁴ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, где алкил, алкенил или алкинил содержит радиоактивный углерод или замещен радиоактивным галогеном, когда R² представляет собой водород или нерадиоактивный галоген,

при условии, что, когда R¹ представляет собой водород или -ОН, R² представляет собой водород и R⁴ означает -¹¹СН₃, то R³ представляет собой C₂-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, и

при дальнейшем условии, что, когда R¹ представляет собой водород, R² означает водород и R⁴ представляет собой -CH₂CH₂CH₂ ¹⁸F, то R³ представляет собой C₂-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил.

Другой вариант осуществления относится к соединениям, выбранным из группы, состоящей из структур 1-45, которые используют в описанных способах:

Еще один вариант осуществления относится к амилоид-связывающему соединению, имеющему структуру, выбранную из группы, состоящей из:

В еще одном варианте осуществления амилоид-связывающие соединения, соответствующие изобретению, связываются с Аβ с константой диссоциации (K_D) от 0,0001 до 10,0 мкМ при измерении по связыванию с синтетическим пептидом Аβ или тканью головного мозга болезни Альцгеймера.

Другой вариант осуществления изобретения относится к способу синтеза амилоид-связывающих соединений, соответствующих изобретению, имеющих по меньшей мере один из заместителей, выбранный из группы, состоящей из ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Вr, ⁷⁵Вr, ¹⁸F и ¹⁹F, который предусматривает стадию мечения амилоид-связывающего соединения, в котором по меньшей мере один из заместителей представляет собой триалкилолово, путем реакции соединения с ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F и ¹⁹F-содержащей субстанцией.

Следующий вариант осуществления данного изобретения относится к фармацевтической композиции для визуализации in vivo отложений амилоида, содержащей (а) связывающее амилоид соединение, соответствующее данному изобретению, и (b) фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретения предложен способ in vivo обнаружения отложений амилоида у субъекта, предусматривающий стадии: (а) введения определяемого количества фармацевтической композиции, содержащей меченое связывающее амилоид соединение, и (b) детекции связывания соединения с отложением амилоида в организме субъекта. В предпочтительном аспекте данного варианта осуществления отложение амилоида находится в головном мозге субъекта. В особенно предпочтительном аспекте данного варианта осуществления у субъекта предполагают наличие заболевания или синдрома, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, семейной формы болезни Альцгеймера, синдрома Дауна и гомозиготного состояния по аллелю аполипопротеина Е4. В другом особенно предпочтительном аспекте данного варианта осуществления метод детекции выбран из группы, состоящей из визуализации с помощью γ-лучей, визуализации с помощью магнитного резонанса и спектроскопии магнитного резонанса. В предпочтительном аспекте данного варианта осуществления визуализация с помощью γ-лучей представлена либо PET (эмиссионной позитронной томографией), либо SPECT (однофотонной эмиссионной компьютерной томографией). В другом предпочтительном аспекте данного варианта осуществления фармацевтическую композицию вводят посредством внутривенной инъекции. В следующем предпочтительном аспекте данного варианта осуществления соотношение (i) связывания соединения с областью головного мозга, отличной от мозжечка, и (ii) связывания соединения с мозжечком в организме субъекта сравнивают с данным соотношением у нормального субъекта.

В другом варианте осуществления выявление отложений амилоида in vivo используют в диагностике болезни Альцгеймера.

Другой вариант осуществления касается способа обнаружения отложений амилоида в биоптате или полученной посмертно ткани человека или животного, который предусматривает стадии: (а) инкубирования фиксированной в формалине или свежезамороженной ткани с раствором связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению, для образования меченого отложения с последующей стадией (b) детекции меченых отложений. В предпочтительном аспекте данного варианта осуществления раствор содержит 25-100% этанола, в котором остальную часть раствора составляет вода, при этом раствор насыщен связывающим амилоид соединением, соответствующим данному изобретению. В особенно предпочтительном аспекте данного варианта осуществления раствор состоит из водного буфера (такого как трис или фосфатный буфер), содержащего 0-50% этанола, при этом раствор содержит 0,0001-100 мкМ связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению. В особенно предпочтительном аспекте данного варианта осуществления детекцию осуществляют методами на основе микроскопии, выбранными из группы, состоящей из светлопольной, флуоресцентной, лазерно-конфокальной и поперечно-поляризационной микроскопии.

Другой вариант осуществления относится к способу определения количества амилоида в биоптате или посмертной ткани, предусматривающему стадии: а) инкубирования несущего радиоактивную метку производного связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению, с гомогенатом биоптата или посмертной ткани, b) отделения связанного с тканью от не связанного с тканью радиоактивно меченого производного связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению, с) количественное определение связанного с тканью радиоактивно меченого производного связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению, и d) превращение единиц связанного с тканью радиоактивно меченого производного связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению, в единицы, соответствующие микрограммам амилоида/100 мг ткани путем сравнения со стандартом.

Другой вариант осуществления относится к способу дифференцирования головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера, от нормального головного мозга, предусматривающему стадии: а) получения ткани из (i) мозжечка и (ii) другой области того же самого головного мозга, отличной от мозжечка, у нормальных субъектов и субъектов, предположительно пораженных болезнью Альцгеймера b) инкубирования тканей с несущим радиоактивную метку производным, связывающих амилоид, при этом амилоид в ткани связывается с несущим радиоактивную метку производным связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению; с) определения количества амилоида, связанного с несущим радиоактивную метку производным связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению, в соответствии с вышеописанным способом d) вычисления соотношения количества амилоида в области головного мозга, отличной от мозжечка, и количества амилоида в мозжечке е) сравнения соотношения количества амилоида в ткани, полученной от нормальных субъектов, с соотношением количества амилоида в ткани субъектов, предположительно пораженных болезнью Альцгеймера, и f) определения присутствия болезни Альцгеймера, если соотношение в головном мозге субъекта, предположительно пораженного болезнью Альцгеймера, на 90% выше соотношений, полученных для головного мозга нормальных субъектов.

Другой вариант осуществления данного изобретения относится к соединениям, соответствующим данному изобретению, которые используют при специфическом связывании с отложениями амилоида относительно нейрофибриллярных клубочков.

Другой вариант осуществления относится к способу селективного связывания с амилоидными бляшками, но не с нейрофибриллярными клубочками ткани головного мозга in vivo, который содержит оба компонента, путем введения эффективного количества соединения, соответствующего данному изобретению, причем концентрация введенного соединения в крови остается ниже 10 нМ in vivo.

Еще один вариант осуществления относится к новым соединениям, соответствующим данному изобретению, в которых по меньшей мере один из атомов формулы замещен радиоактивной меткой, в частности если указанная радиоактивная метка представляет собой ¹¹С.

Еще один вариант осуществления относится к новым соединениям, соответствующим данному изобретению, в которых по меньшей мере один из атомов формулы выбран из группы, состоящей из ³H, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Вr, ⁷⁵Br, ¹⁸F, CH₂-CH₂-X*, О-СН₂-СН₂-Х*, CH₂-CH₂-CH₂-X*, О-СН₂-СН₂-СН₂-Х* (где Х*=¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁶Вr, ⁷⁵Вr или ¹⁸F), ¹⁹F, ¹²⁵I, углеродсодержащий заместитель, выбранный из группы, состоящей из низшего алкила, (CH₂)_nOR', CF₃, CH₂-CH₂X, O-CH₂-CH₂X, CH₂-CH₂-CH₂X, О-СН₂-СН₂-СН₂X (где X=F, CaI, Br или I), CN, (C=O)-R', (C=O)N(R')2, O(CO)R', COOR', CR'=CR'-R_ph и CR₂'-CR₂'-R_ph, где по меньшей мере один атом углерода представляет собой ¹¹С, ¹³С или ¹⁴С, и хелатирующей группы (схелатированной группой металла) формы W-L* или V-W-L*, где V выбрано из группы, состоящей из -COO-, -CO-, -CH₂O- и -CH₂NH-; W представляет собой -(CH₂)_n, где n=0, 1, 2, 3, 4 или 5; и L* представляет собой:

, или

где М* означает ^99mТс.

Другой вариант осуществления относится к применению одного из соединений формул 1-45 или соединения формулы I для диагностики болезни Альцгеймера у нуждающегося в этом пациента.

Другой вариант осуществления относится к применению одного из соединений формул 1-45 или соединения формулы I для получения лекарственного средства для диагностики болезни Альцгеймера у нуждающегося в этом пациента.

Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны для компетентных специалистов в данной области из рассмотрения описания и практического осуществления изобретения, раскрываемого в данном контексте. Предполагается, что описание рассматривают только как иллюстративное, при том, что истинный объем и сущность изобретения представлены в последующей формуле изобретения. Кроме того, все документы, приведенные в данном контексте, специально введены в виде ссылки.

Перечень фигур чертежей и иных материалов

На Фигуре 1 представлены структуры Тиофлавина S и Тиофлавина Т;

На Фигуре 2 представлены структуры двух производных тиофлавина, соответствующих изобретению;

На Фигуре 3 представлено четыре серийных среза окрашенной флуоресцентным красителем лобной коры головного мозга пациента, пораженного AD;

На Фигуре 4 представлены предполагаемые центры связывания Хризамина G и Тиофлавина Т в фибриллах с β-складчатой конфигурацией;

На Фигуре 5 представлены результаты конкурентного анализа с использованием Хризамина G, Тиофлавина S и Тиофлавина Т, а также производных, соответствующих данному изобретению (ВТА-0, ВТА-1 и ВТА-2);

На Фигуре 6 представлено изменение с течением времени радиоактивности в лобной коре головного мозга павианов, которым инъекционным путем введены меченые ВТА-1, 6-Мео-ВТА-1 и 6-Ме-ВТА-1, и

На Фигуре 7 представлено полученное с помощью поперечной эмиссионной позитронной томографии изображение двух уровней головного мозга павиана после внутривенной инъекции [N-метил-¹¹С]ВТА-1.

На Фигуре 8 представлены посмертные срезы головного мозга человека и трансгенной мыши, окрашенные производным, соответствующим данному изобретению (ВТА-1).

На Фигуре 9 представлены результаты мечения in vivo амилоидных бляшек и сосудистого амилоида, окрашенного производным, соответствующим данному изобретению (ВТА-1), у живых трансгенных мышей при визуализации с помощью мультифотонной микроскопии.

На Фигуре 10А представлены сравнительные данные связывания [³Н] с гомогенатами, полученными из контрольного головного мозга, головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера, и головного мозга при деменции, не связанной с болезнью Альцгеймера.

На Фигуре 10В представлено соотношение данных, полученное при сравнении лобного участка коры головного мозга и мозжечка для каждого отдельного головного мозга из контрольного головного мозга, головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера, и головного мозга при деменции, не связанной с болезнью Альцгеймера.

На Фигурах 11A-F показана специфичность соединений, соответствующих изобретению, в отношении амилоидных бляшек относительно нейрофибриллярных клубочков, где А и В представляют энторинальный кору головного мозга, С и D представляют лобную кору головного мозга и Е и F представляют мозжечок контрольного головного мозга стадии II по Braak.

На Фигуре 12 представлена Таблица, показывающая связывание [³Н] ВТА-1 со специфическими областями контрольного головного мозга по Braak II и головного мозга, пораженного AD по Braak VI (AD02).

На Фигуре 13 представлен график по Стретчарду связывания [³Н] ВТА-1 c гомогенатами, полученными из лобного серого вещества, пораженного AD, и нижележащего лобного белого вещества из того же самого головного мозга, пораженного AD.

На Фигуре 14 представлена авторадиограмма и флуоресцентная микрофотография, показывающая перекрывание связывания [1-125]6-ОН-ВТА-0-3'-1 с бляшками и цереброваскулярным амилоидом и отложениями амилоида, окрашенными красителем на амилоид Х-34. Слева: авторадиограмма связывания [1-125]6-ОН-ВТА-0-3'-1 с замороженной в свежем виде тканью, взятой посмертно из головного мозга, пораженного AD. Темные участки показывают локализацию [1-125]6-ОН-ВТА-0-3'-1, и они обведены красным. Структура [1-125]6-ОН-ВТА-0-3'-1 представлена ниже слева. Справа: Тот же самый образец взятой посмертно ткани головного мозга, пораженного, окрашенный красителем на амилоид Х-34. Светлые участки показывают бляшки и цереброваскулярный амилоид. В центре: Перекрывание выделенного красным из представленной слева авторадиограммы с окрашиванием Х-34, показывающее соответствие, близкое к 1:1, связывания [1-125]6-ОН-ВТА-0-3'-1 с бляшками и цереброваскулярным амилоидом. На вставке представлен с увеличением в 2,25 раза очерченный участок в центре фигуры. Столбик означает 1000 мкм.

На Фигуре 15 представлены кривые зависимости время-активность проникновения и выведения радиоактивности из трех участков головного мозга павиана после инъекции соединения В (2-(3-[¹⁸F]-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oлa).

На Фигуре 16 представлены кривые зависимости время-активность проникновения и выведения радиоактивности из мозжечка павиана (эталонный участок, в котором отсутствует специфическое связывание) после инъекции радиолигандов [карбонил-¹¹С]WАY100635, [¹¹C](+)-McN5652 и [¹⁸F]алтансерина по сравнению с поведением Соединения В.

На Фигуре 17 представлены кривые зависимости время-активность проникновения и выведения радиоактивности из трех участков головного мозга павиана после инъекции соединения С (2-(4-(3-¹⁸F-фтop-пpoпилaминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oлa).

На Фигуре 18 представлены кривые зависимости время-активность проникновения и выведения радиоактивности из мозжечка павиана (эталонный участок, в котором отсутствует специфическое связывание) после инъекции радиолигандов [карбонил-¹¹С]WАY100635, [¹¹C](+)-McN5652 и [¹⁸F]алтансерина по сравнению с поведением Соединения С.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном изобретении используют способность тиофлавиновых соединений и их производных, несущих радиоактивные метки, проникать через гематоэнцефалический барьер in vivo и связываться с Аβ, отлагающимся в невритных (но не диффузных) бляшках, с Аβ, отлагающимся в цереброваскулярном амилоиде, и с амилоидом, состоящим из белка, откладывающегося в NFT. Данные соединения не являются производными четвертичного амина Тиофлавина S и Т, которые, как известно, окрашивают амилоид в срезах ткани и связывают синтетический Aβ in vitro. См. статьи Kelenyi, J. Histochem. Cytochem., 15: 172, (1967); Burns и соавт., J. Path. Bact., 94: 337, (1967); Guntern и соавт., Experimentia, 48: 8, (1992); LeVine, Meth. Enzymol., 309: 274, (1999).

Производные тиофлавина, соответствующие данному изобретению, обладают каждой из следующих характеристик: (1) специфическое связывание с синтетическим Aβ in vitro и (2) способность проникать через неповрежденный гематоэнцефалический барьер in vivo.

Молекулярное моделирование

Молекулярное моделирование проводили с использованием программы для компьютерного моделирования Alchemy2000Tripost, Inc. St. Louis, МО) для создания пептидных цепей Аβ в антипараллельной конформации β-складки. См. статью Kirschner и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 503, (1986). Пептиды амилоида были помещены в петли шпильки (см. статью Hilbich и соавт., J. Mol. Biol., 218: 149, (1991)) и использованы без дальнейшей обработки. При сопоставлении пептидов Аβ было получено, что чередующиеся цепи отнесены друг от друга в пространстве на 4,76 Å, что характерно для β-складчатых фибрилл. См. статью Kirschner, supra. У производных тиофлавина Т была минимизирована энергия и их сопоставили с моделью фибрилл для получения максимального контакта с Asp-23/Gln-15/His-13 пептида Аβ (1-42).

Характеризация специфического связывания синтетического пептида Aβ: аффинность, кинетика, максимальное связывание

Характеристики связывания производного тиофлавина анализировали с использованием синтетического Аβ (1-40) и 2-(4'-[¹¹C]мeтилaминoфeнил)бeнзoтиaзoлa ([N-метил-¹¹C]BTA-1) в забуференном фосфатом солевом растворе (рН 7,0) или глициновом буфере/20% этанола (рН 8,0), как ранее описано для связывания Хризамина G. См. статью Klunk и соавт., Neurobiol. Aging, 15: 691, (1994).

Последовательность аминокислот Аβ (1-40) является следующей:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Туr Glu Val                         13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val                         25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Gly Ser Asn Lys Gly Ala lle lle Gly Leu Met Val                         37 38 39 40                 Gly Gly Val Val                

Определения

Термин "алкил" относится к насыщенному углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью. Примеры включают без ограничения метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, n-пентил и n-гексил.

Термин "алкенил" относится к ненасыщенному углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, содержащему по меньшей мере одну двойную связь атома углерода с атомом углерода. Примеры включают без ограничения этенил, пропенил, изопропенил, бутенил, изобутенил, трет-бутенил, n-пентенил и n-гексенил.

Термин "алкинил" относится к ненасыщенному углеводородному радикалу с прямой или разветвленной цепью, содержащему по меньшей мере одну тройную связь атома углерода с атомом углерода. Примеры включают без ограничения этинил, пропинил, изопропинил, бутинил, изобутинил, трет-бутинил, n-пентинил и n-гексинил.

Термин "алкоксигруппа" относится калкильной группе, связанной через кислородную связь.

Термин "галогеновая группа" относится к радикалу фтора, хлора, брома и йода.

Термин "радиоактивная галогеновая группа" относится к радиоактивному галогену, т.е. радиоактивному фтору, радиоактивному хлору, радиоактивному брому или радиоактивному йоду.

Термин "эффективное количество" относится к количеству, требующемуся для получения желательного эффекта. Примеры "эффективного количества" включают количества, которые делают возможным визуализацию отложения(й) амилоида in vivo, дающие приемлемые для фармацевтического применения уровни токсичности и биодоступности, и/или препятствуют дегенерации клеток и токсичности, ассоциированной с образованием фибрилл.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или носителю, такому как жидкость или твердый инертный наполнитель, разбавитель, наполнитель или материал, инкапсулирующий наполнитель, участвующий в переносе или транспортировке данного соединения из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель является "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и пригодности для использования пациентом. Примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемого носителя, включают без ограничения: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошковый трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) наполнители, такие как масло какао и воска для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) забуферивающие агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) рН-забуференные растворы; (21) полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды и (22) другие нетоксичные совместимые субстанции, используемые в фармацевтических препаратах, как указано, например, в Справочнике Реминтгтона по фармацевтическим наукам (Remington's Pharmaceutical Sciences), 15 изд. (Mack Publishing Co., 1975), стр. 1405-1412 и 1461-1487, и Национальном формуляре (The National Formulary) XIV, 14 изд, (American Pharmaceutical Association, 1975).

Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли кислоты или основания соединения, соответствующего изобретению, которая обладает необходимой фармакологической активностью и не является ни биологически, ни иным образом нежелательной. Соль может быть образована с помощью кислот, которые включают без ограничения перечисленным ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфатбутират, цитрат, камфорат, камформульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Примеры солей оснований включают без ограничения перечисленным соли алюминия, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния, соли, образованные с помощью органических оснований, такие как соли дициклогексиламина, N-метил-D-глюкамина, и соли, образованные с помощью аминокислот, таких как аргинин и лизин. В некоторых вариантах осуществления группы, содержащие основной азот, могут быть превращены в группы четвертичного азота с помощью агентов, включающих низшие алкилгалиды, такие как метил-, этил-, пропил- и бутилхлориды, бромиды и йодиды; диалкилсульфаты, такие как диметил-, диэтил-, дибутил и диамилсульфаты; галиды с длинной цепью, такие как децил-, лаурил-, миристил- и стеарилхлориды, бромиды и йодиды, и аралкилгалиды, такие как фенетилбромиды.

Термин "пролекарственная форма (пролекарство)" относится к производному соединения, соответствующего изобретению, которое проходит биотрансформацию, такую как метаболизм, перед проявлением своего фармакологического эффекта(ов). Пролекарственную форму готовят с целью(ями) получения улучшенной химической стабильности, улучшенной переносимости пациентом и удобства приема, повышенной биодоступности, пролонгированного периода действия, улучшенной селективности в отношении органа, усовершенствованного препарата (например, повышенной растворимости в воде), и/или уменьшенных побочных эффектов (например, токсичности). Пролекарственная форма легко может быть получена из соединения, соответствующего изобретению, при использовании принятых способов, таких как описаны в справочнике Медицинская химия и химия лекарственных препаратов Бургера (Burger's Medicinal Chemistry And Drug Chemistry, 5 изд., т.1, (1995), стр.172-178 и 949-982).

Термин "животное" относится к живому организму, который обладает чувствительностью и способностью к произвольным движениям и которому для существования требуется кислород и органическая пища. Примеры включают без ограничения перечисленным представителей человека, видов лошадей, свиней, крупного рогатого скота, мышей и крыс, собак и кошек. В случае человека термин "животное" допускает также ссылку на термин "пациент (больной)".

Термин "млекопитающее" относится к теплокровному позвоночному животному.

Термин "лечение" относится к: (i) предупреждению заболевания, нарушения или состояния из встречающихся у животного, которое может быть предрасположено к заболеванию, нарушению или состоянию, но еще не диагностировано как имеющее его; (ii) подавлению заболевания, нарушения или состояния, т.е. остановки его развития и/или (iii) облегчения заболевания, нарушения или состояния, т.е. являться причиной регрессии заболевания, нарушения или состояния.

До тех пор, пока контекст ясно не обусловливает обратное, определения терминов в единственном числе могут быть экстраполированы для применения их эквивалентов во множественном числе, как они появляются в заявке, аналогично определения терминов во множественном числе могут быть экстраполированы для применения их эквивалентов в единственном числе, как они появляются в заявке.

СОЕДИНЕНИЯ

Данное изобретение представляет соединения несущих радиоактивную метку бинзотиазоловых производных в качестве агентов для визуализации амилоида.

В частности, данное изобретение представляет соединение формулы I

или фармацевтически приемлемую соль, гидрат, сольват или пролекарственную форму соединения, в котором:

R¹ представляет собой водород, -ОН, -NO₂, -CN, -COOR, -OCH₂OR, C₁-C₆алкил, С₂-С₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆алкоксигруппу или галоген, где один или более атомов R¹ может быть радиоактивно меченным атомом;

R представляет собой C₁-C₆алкил, в котором один или более атомов углерода может представлять собой радиоактивно меченный атом;

R² представляет собой водород, нерадиоактивный галоген или радиоактивный галоген;

R³ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, С₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил и

R⁴ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, где алкил, алкенил или алкинил содержит радиоактивный атом углерода или замещен радиоактивным галогеном, когда R² представляет собой водород или нерадиоактивный галоген,

при условии, что, когда R¹ представляет собой водород или -ОН, R² представляет собой водород и R⁴ означает -¹¹СН₃, то R³ представляет собой C₂-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆ и

при дальнейшем условии, что, когда R¹ представляет собой водород, R² означает водород и R⁴ представляет собой -(СН₂)₃ ¹⁸F, то R³ представляет собой C₂-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил.

Примеры радиоактивного углерода включают без ограничения перечисленным ¹¹С, ¹³С и ¹⁴С. Примеры радиоактивного галогена включают без ограничения перечисленным ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²⁴I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F.

В одном варианте осуществления радиоактивный галоген представляет собой ¹²⁵I,¹²⁴I,¹²³I или ¹⁸F. В другом варианте осуществления R¹ означает -ОН.

В еще одном варианте осуществления R¹ представляет собой водород, -ОН, -CN, C₁-C₆ алкил, C₂-C₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆алкоксигруппу или галоген; R² представляет собой водород, и R⁴ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, где алкил, алкенил или алкинил содержит радиоактивный углерод. В качестве примера данного варианта осуществления R¹ представляет собой водород, -ОН, -CN, -ОСН₃, -СН₃ или -Br; R³ представляет собой водород или -СН₃, и R⁴ представляет собой -¹¹СН₃.

В еще одном варианте осуществления R² означает нерадиоактивный галоген или радиоактивный галоген, где галоген представляет собой йод, и R⁴ представляет собой водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, где алкил, алкенил или алкинил содержит радиоактивный углерод, когда R² представляет собой нерадиоактивный галоген. В качестве примера данного варианта осуществления R представляет собой -СН₃, и радиоактивным углеродом в R⁴ является ¹¹С. В качестве другого примера R¹ представляет собой -ОН или C₁-C₆алкоксигруппу; R² представляет собой радиоактивный йод, и R³ и R⁴ независимо друг от друга означают водород или C₁-C₆алкил. В качестве следующего примера R¹ означает -ОН; R² представляет собой -¹²³I или -¹²⁵I; и каждый из R³ и R⁴ означает водород.

В еще одном варианте осуществления R² представляет собой водород, радиоактивный бром, радиоактивный хлор или радиоактивный фтор.

В еще одном варианте осуществления R² представляет собой радиоактивный фтор. В качестве примера данного варианта осуществления R¹ представляет собой -ОН или C₁-C₆алкоксигруппу; R² означает ¹⁸F, и R₃ и R₄ независимо друг от друга означают водород или C₁-C₆алкил. В качестве другого примера R¹ представляет собой -ОН; R³ представляет собой водород, и R⁴ означает -СН₃.

В еще одном варианте осуществления R⁴ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, где алкил, алкенил или алкинил замещен радиоактивным галогеном. В качестве примера данного варианта осуществления R¹ представляет собой -ОН или C₁-C₆алкоксигруппу; R² означает водород; R³ представляет собой водород или C₁-C₆алкил, и R⁴ представляет собой C₁-C₆алкил, замещенный ¹⁸F. В качестве другого примера R¹ представляет собой -ОН; R₃ представляет собой водород; и R⁴ означает -CH₂CH₂CH₂ ¹⁸F.

В еще одном варианте осуществления соединения, соответствующие изобретению, селективно связываются с амилоидом, в частности синтетическим Aβ in vitro или Аβ, отложившимся в невритных бляшках; проходят некомпромиссный гематоэнцефалический барьер in vivo; биодоступны и/или нетоксичны.

Еще один вариант осуществления относится к связывающему амилоид соединению, имеющему структуру, выбранную из группы, состоящей из:

СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

Соединения, соответствующие изобретению, могут быть использованы для определения присутствия, положения и/или количества одного или более отложения(й) амилоида в органе или области тела, включая головной мозг животного. Отложение(я) амилоида включают без ограничения перечисленным отложение(я) Аβ. Принимая во внимание, что со временем последуют результаты отложения амилоида, соединение, соответствующее изобретению, может быть далее использовано для корреляции отложения амилоида с появлением клинических симптомов, ассоциированных с заболеванием, нарушением или состоянием. Соединения, соответствующие изобретению, могут быть в конечном счете использованы для лечения и диагностики заболевания, нарушения или состояния, характеризующегося отложением амилоида, такого как AD, семейная форма AD, синдром Дауна, амилоидоз, сахарный диабет типа II и гомозиготы по аллелю аполипопротеина Е4.

Способ, соответствующий данному изобретению, определяет присутствие и положение амилоидных отложений в органе или области тела, предпочтительно в головном мозге пациента. Данный способ предусматривает введение пациенту определяемого количества фармацевтической композиции, содержащей связывающее амилоид соединение, соответствующее данному изобретению, называемое "определяемым соединением", или его фармацевтически приемлемую водорастворимую соль. Термин "определяемое количество" означает, что количество определяемого соединения, которое вводят, достаточно для обеспечения детекции связывания соединения с амилоидом. Термин "эффективное количество для визуализации" означает, что количество определяемого соединения, которое вводят, достаточно для обеспечения изображения связывания соединения с амилоидом.

В изобретении используют амилоидные зонды, которые в сочетании с неинвазивными методиками нейровизуализации, такими как спектроскопия магнитного резонанса (MRS) или изображения магнитного резонанса (MRI) либо γ-визуализация, такая как эмиссионная позитронная томография (PET), либо однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT), применяют для количественной оценки отложения амилоида in vivo. Термин "визуализация in vivo" относится к любому способу, который позволяет определять меченое производное тиофлавина, как описано в данном контексте. Для γ-визуализации радиацию, испускаемую из исследуемого органа или области, измеряют и выражают либо как тотальное связывание, либо как соотношение, в котором тотальное связывание в одной ткани нормализовано (например, путем деления) относительно тотального связывания в другой ткани того же самого субъекта во время одной и той же процедуры визуализации in vivo. Тотальное связывание in vivo определяют как полный сигнал, определяемый в ткани с помощью методики визуализации in vivo без необходимости коррекции путем второй инъекции идентичного количества меченого соединения наряду с большим избытком немеченого, но в других отношениях идентичного соединения. Термин "субъект" означает млекопитающее, предпочтительно человека и наиболее предпочтительно человека, у которого предполагают наличие деменции.

Для целей визуализации in vivo тип имеющегося инструмента для детекции является основным фактором при выборе данной метки. Например, радиоактивные изотопы и ¹⁹F особенно подходят для визуализации in vivo в способах, соответствующих данному изобретению. Тип используемого инструмента будет определять выбор радионуклида или стабильного изотопа. Например, выбранный радионуклид должен иметь тип распада, определяемый инструментом данного вида. Другое соображение относится к периоду полураспада радионуклида. Период полураспада должен быть достаточно длинным, чтобы быть еще определяемым во время максимального поглощения мишенью, но достаточно коротким, чтобы хозяин не получал вредного облучения. Несущие радиоактивную метку соединения, соответствующие данному изобретению, можно определить с использованием γ-визуализации, при которой определяют испускаемое γ-излучение соответствующей длины волны. Способы γ-визуализации включают без ограничения перечисленным SPECT и PET. Для детекции с помощью SPECT предпочтительно, когда у выбранной радиоактивной метки будет отсутствовать эмиссия частиц, но будет образовываться большое число фотонов в интервале 140-200 кэВ. Для детекции с помощью PET радиоактивная метка будет радионуклидом, испускающим позитроны, таким как ¹⁹F, который аннигилируется с образованием двух γ-лучей по 511 кэВ, которые будут определять с помощью камеры PET.

В данном изобретении получены связывающие амилоид соединения/зонды, которые используют для визуализации in vivo и количественной оценки отложения амилоида. Данные соединения предназначены для использования в сочетании с неинвазивными методиками нейровизуализации, такими как спектроскопия магнитного резонанса (MRS) или изображение магнитного резонанса (MRI), эмиссионная позитронная томография (PET) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT). В соответствии с данным изобретением производные тиофлавина могут быть помечены ¹⁹F или ¹³С для MRS/MRI с помощью методик общей органической химии, известных в области техники. См., например, монографию Успехи органической химии: реакции, механизмы и структура (Advanced organic chemistry: reactions, mechanisms, and structure), 3 изд., (1985), содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки. Производные тиофлавина могут также помечены радиоактивной меткой ¹⁸F, ¹¹С, ⁷⁵Вr или ⁷⁶Вr для PET с помощью методик, хорошо известных в области техники и описанных Fowler J. и Wolf А. в монографии "Эмиссионная позитронная томография и авторадиография" (Positron emission tomography and autoradiography), 391-450, (Raven Press, 1986), содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки. Производные тиофлавина могут быть также помечены радиоактивной меткой ¹²³I для SPECT с помощью любой из ряда методик, известных в области техники. См., например, статью Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Часть В), 18:647, (1991), содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки. Кроме того, производные тиофлавина могут быть помечены любым из подходящих радиоактивных изотопов йода, таким как, но без ограничения перечисленным, ¹³¹I, ¹²⁵I или ¹²³I, путем йодирования диазотизированного аминопроизводного непосредственно через иодид диазония, см. статью Greenbaum F., Am. J. Pharm., 108:17, (1936), или посредством превращения нестабильного диазотизированного амина в стабильный триазен либо путем превращения нерадиоактивного галогенированного предшественника в стабильное производное триалкилолова, которое затем можно превратить в соединение йода с помощью ряда способов, хорошо известных в области техники. См. статьи Satyamurthy и Barrio, J. Org. Chem., 48:4394, (1983); Goodman и соавт., J. Org. Chem., 49:2322, (1984) и Mathis и соавт., J. Labell. Соmр. and Radiopharm., 1994:905; Chumpradit и coaвт., J. Med. Chem., 34:877, (1991); Zhuang и соавт., J. Med. Chem.,37:1406, (1994); Chumpradit и соавт., J. Med. Chem., 37:4245, (1994). Например, стабильный триазен или производное триалкилолова тиофлавина или его аналогов реагирует с галогенирующим агентом, содержащим ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ⁷⁶Br, ⁷⁵Br, ¹⁸F или ¹⁹F. Таким образом стабильные производные триалкилолова тиофлавина и его аналогов представляют собой новые предшественники, используемые для синтеза многих соединений, несущих радиоактивную метку, которые входят в данное изобретение. В таком случае данные производные триалкилолова представляют собой один из вариантов осуществления данного изобретения.

Производные тиофлавина могут быть также радиоактивно помечены с помощью известных меток радиоактивными металлами, такими как Технеций-99m (^99mТс). Модификация заместителей для введения лигандов, которые связывают данные ионы металлов, может быть осуществлена без излишнего экспериментирования обычным специалистом в области введения радиоактивных меток. Затем производное тиофлавина, меченное радиоактивным металлом, может быть использовано для детекции отложений амилоида. Получение производных с радиоактивной меткой Тс^99m хорошо известно в области техники. См., например, статьи Zhuang и соавт., "Нейтральные и стереоспецифические комплексы Тс-99m: [^99mТс]N-бензил-3,4-ди-(N-2-меркаптоэтил)-амино-пирролидины (Р-ВАТ)" ("Neutral and stereospecific Tc-99m complexes: [^99mTc]N-benzyl-3,4-di-(N-2-mercaptoethyl)-амино-pyrrolidines (P-BAT)"), Nuclear Medicine & Biology, 26(2):217-24, (1998); Oya и соавт., "Маленькие и нейтральные Tc(v)O BAT, комплексы бисаминоэтантиола (N2S2) для создания новых агентов для визуализации головного мозга" ("Small and neutral Tc(v)O BAT, bisaminoethanethiol (N2S2) complexes for developing new brain imaging agents"), Nuclear Medicine & Biology, 25(2): 135-40, (1998) и Horn и соавт., "Меченные технецием-99m специфические в отношении рецептора маленькие молекулы - радиофармацевтические агенты: современные исследования и обнадеживающие результаты" ("Technetium-99m-labeled receptor-specific small-molecule radiopharmaceuticals: recent developments and encouraging results"), Nuclear Medicine & Biology, 24(6):485-98, (1997).

В способах, соответствующих данному изобретению, можно использовать изотопы, определяемые спектроскопией магнитного резонанса в целях визуализации in vivo и спектроскопии. Элементы, особенно подходящие для спектроскопии магнитного резонанса, включают ¹⁹F и ¹³С.

Подходящие радиоизотопы для целей данного изобретения включают β-излучатели, γ-излучатели, излучатели позитронов и излучатели рентгеновских лучей. Данные радиоизотопы включают ¹³¹I, ¹²³I, ¹⁸F, ¹¹С, ⁷⁵Вr и ⁷⁶Br. Подходящие стабильные изотопы для применения в визуализации с помощью магнитного резонанса (MRI) или спектроскопии магнитного резонанса (MRS) в соответствии с данным изобретением включают ¹⁹F и ¹³С. Подходящие радиоизотопы для количественной оценки in vitro амилоида в гомогенатах биоптата или взятой посмертно ткани включают ¹²⁵I, ¹⁴С и ³H. Предпочтительными радиоактивными метками для применения в визуализации in vivo с помощью PET являются ¹¹С и ¹⁸F, для визуализации с помощью SPECT - ¹²³I, для MRS/MRI - ¹⁹F и для исследований in vitro - ³H и ¹⁴C. Однако любой из принятых способов визуализации диагностических зондов можно использовать в соответствии с данным изобретением.

Согласно аспекту изобретения, который касается способа детекции отложений амилоида в биоптате или полученной посмертно ткани, способ включает инкубирование фиксированной в формалине ткани с раствором тиофлавинового связывающего амилоид соединения, соответствующего данному изобретению. Предпочтительно, когда раствор представляет собой 25-100% этанол (притом, что оставшаяся часть является водой), насыщенным тиофлавиновым связывающим амилоид соединением, соответствующим данному изобретению. При инкубировании соединение окрашивает или метит отложение амилоида в ткани, и окрашенное или меченое отложение может быть определено или визуализировано любым стандартным способом.

Данные средства детекции включают микроскопические методики, такие как светлопольная, флуоресцентная, лазерно-конфокальная и перекрестно-поляризационная микроскопия.

Способ определения количества амилоида в биоптате или взятой посмертно ткани включает инкубирование меченого производного тиофлавина, соответствующего данному изобретению, или его водорастворимой нетоксичной соли с гомогенатом биоптата или взятой посмертно ткани. Ткань получают и гомогенизируют способами, хорошо известными в области техники. Предпочтительной меткой является радиоактивная метка, хотя компетентным специалистам хорошо известны другие метки, такие как ферменты, хемолюминесцентные и иммунофлуоресцентные соединения. Предпочтительная радиоактивная метка представляет собой ¹²⁵I, ¹⁴С или ³H, которые содержатся в замещенном заместителе на одном из соединений настоящих формул, описанных в данном контексте. Ткань, содержащая отложения амилоида, будет связываться с мечеными производными тиофлавиновых связывающих амилоид соединений, соответствующих данному изобретению. Затем связанную ткань отделяют от несвязанной ткани посредством механизма, известного компетентным специалистам, например фильтрованием. Потом можно определить количество связанной ткани любыми средствами, известными компетентному исследователю. Единицы связанного тканью несущего радиоактивную метку тиофлавинового производного затем переводят в единицы мкг амилоида/100 мг ткани путем сравнения со стандартной кривой, полученной при инкубировании известных количеств амилоида с несущим радиоактивную метку производным тиофлавина.

Способ дифференцирования головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера, от нормального головного мозга включает получение ткани из (а) мозжечка и (b) другой области того же самого головного мозга, отличной от мозжечка, у нормальных субъектов и субъектов, предположительно пораженных болезнью Альцгеймера. Из данных тканей делают отдельные гомогенаты, используя способы, хорошо известные компетентным специалистам, а затем инкубируют с несущим радиоактивную метку тиофлавиновым связывающим амилоид соединением. Количество ткани, которое связывается с несущим радиоактивную метку тиофлавиновым связывающим амилоид соединением, затем вычисляют для каждого типа ткани (например, мозжечка, немозжечка, нормальной, патологической) и соотношение связывания ткани немозжечка и мозжечка вычисляют для ткани, полученной от нормального человека, и для ткани пациентов, предположительно пораженных болезнью Альцгеймера. Затем сравнивают данные соотношения. Если соотношение, полученное для головного мозга, предположительно пораженного болезнью Альцгеймера, на 90% выше соотношений, полученных для образцов нормального головного мозга, то ставят диагноз болезнь Альцгеймера. Нормальные соотношения можно взять из ранее полученных данных или, альтернативно, можно пересчитать в то же самое время, когда исследуют предположительно пораженную ткань головного мозга.

Способность данных соединений специфически связываться с нейрофибриллярными клубочками сверх амилоидных бляшек особенно достоверна при концентрациях меньше чем 10 нМ, которая включает интервал концентраций in vivo радиоактивных меток для PET. При данных низких концентрациях, когда содержатся только клубочки и отсутствуют бляшки, значительного связывания не происходит по сравнению с тканью контрольного головного мозга, не содержащей ни бляшек, ни клубочков. Однако инкубирование гомогенатов ткани головного мозга, которая содержит в основном бляшки и немного клубочков, с несущими радиоактивную метку соединениями формул, описанных в данном контексте, приводит в результате к существенному повышению связывания по сравнению с контрольной тканью без бляшек или клубочков. Эти данные предполагают наличие преимущества в том, что данные соединения специфичны в отношении отложений Аβ в концентрациях меньше чем 10 нМ. Данные низкие концентрации определяются при исследованиях с помощью PET, делая возможной детекцию PET с использованием несущих радиоактивную метку соединений формул, описанных в данном контексте, которые специфичны в отношении отложений Аβ. Применение данных соединений позволяет проводить детекцию с помощью PET в отложениях Аβ, таких как обнаруживаемые в бляшках и цереброваскулярном амилоиде. После того как было описано, что уровни Аβ в лобной коре головного мозга повышаются перед образованием клубочков, можно было бы предположить, что несущие радиоактивную метку соединения, соответствующие данному изобретению, использованные в качестве меток для PET, были бы специфическими в отношении ранних изменений в коре головного мозга, пораженного AD. Naslund и соавт., JAVA 283: 1571 (2000).

Способ детекции отложения(й) амилоида in vivo

Данное изобретение далее представляет способ детекции отложения(й) амилоида in vivo, предусматривающий:

(i) введение животному эффективного количества соединения, соответствующего изобретению, где соединение связывалось бы с любым отложением(ями) амилоида в организме животного; и

(ii) детекцию связывания соединения с отложением(ями) амилоида в организме животного.

После истечения времени, достаточного для того, чтобы соединение связалось с отложением(ями) амилоида, например от 30 минут до 48 часов после введения, связывание можно определить любыми средствами, известными в области техники. Примеры средств детекции включают без ограничения перечисленным анализы (такие как иммунометрический, калориметрический, денситометрический, спектрографический и хроматографический анализы), неинвазивные нейровизуализирующие методики (такие как спектроскопия магнитного резонанса (MRI) и методики γ-визуализации, такие как однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT) и эмиссионная позитронная томография (PET)). Для γ-визуализации радиацию, испускаемую исследуемым органом или областью, измеряют и выражают либо как тотальное связывание, либо как соотношение, в котором тотальное связывание в одной ткани нормализуют (например, делят) относительно тотального связывания в другой ткани того же самого субъекта во время одной и той же процедуры визуализации in vivo. Тотальное связывание in vivo определяют как полный сигнал, определяемый в ткани посредством методики визуализации in vivo без необходимости коррекции посредством второй инъекции идентичного количества меченого соединения вместе в большим избытком немеченого, но в других отношениях химически идентичного соединения.

Тип имеющегося инструмента для детекции может быть фактором при выборе радиоактивного изотопа галогена или углерода. Например, выбранный радиоактивный изотоп должен иметь тип распада, который определяется данным инструментом. Другое соображение относится к периоду полураспада радиоактивного изотопа. Период полураспада должен быть достаточно длинным, чтобы радиоактивный изотоп был еще определяемым во время максимального поглощения мишенью, недостаточно коротким, чтобы хозяин не получал вредного облучения. Для детекции с помощью SPECT у выбранного радиоактивного изотопа может отсутствовать эмиссия частиц, но он может образовывать большое число фотонов в интервале 140-200 кэВ. Для детекции с помощью PET выбранный радиоактивный изотоп может быть радиоактивным изотопом, испускающим позитроны, который аннигилируется с образованием двух γ-лучей по 511 кэВ, определяемым с помощью камеры PET.

Эффективные радиоактивные изотопы включают без ограничения перечисленным: ¹²⁵I, ¹⁴С и ³H для количественного определения амилоида in vitro в гомогенатах биоптатов или посмертно полученной ткани; ¹¹С и ¹⁸F для PET при визуализации in vivo; ¹²³I для визуализации с помощью SPECT; ¹⁸F для MRS/MRI; ³H или ¹⁴С для исследований in vitro и ¹⁸F и ¹³С для спектроскопии магнитного резонанса. В одном варианте осуществления детекцию осуществляют посредством γ-визуализации, получения изображения магнитного резонанса или спектроскопией магнитного резонанса. В другом варианте осуществления γ-визуализация представлена PET или SPECT.

Соединение, соответствующее изобретению, может быть введено средствами, известными обычному специалисту в области техники. Например, введение животному может быть местным или системным и осуществляться перорально, парентерально, с помощью ингаляционного спрея, наружно, ректально, назально, защечно, вагинально или через имплантированный резервуар. Термин "парентеральный", как используют в данном контексте, включает подкожную, внутривенную, внутриартериальную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интратекальную, интравентрикулярную, внутригрудинную, внутричерепную и внутрикостную инъекцию и методики инфузии. Точный протокол введения будет варьировать в зависимости от различных факторов, включая возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и питание пациента, определение конкретных процедур введения было бы рутинным для обычного специалиста в области техники.

Для способов, соответствующих изобретению, эффективны уровни доз порядка от приблизительно 0,001 мкг/кг/день до приблизительно 10000 мг/кг/день соединения, соответствующего изобретению. В одном варианте осуществления уровень доз составляет от приблизительно от 0,001 мкг/кг/день до приблизительно 10 мкг/кг/день. В другом варианте осуществления уровень доз составляет от приблизительно 0,01 мкг/кг/день до приблизительно 1,0 мкг/кг/день. В еще одном варианте осуществления уровень доз составляет от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 100 мг/кг/день.

Специфический уровень доз для любого конкретного пациента будет варьировать в зависимости от различных факторов, включая активность и возможную токсичность используемого специфического соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания пациента, времени введения, скорости выведения, комбинации лекарственных препаратов и формы введения. Как правило, результаты, полученные для зависимости доза-эффект in vitro, дают полезное указание относительно доз для введения пациенту. Помогают также исследования на моделях на животных. Соображения относительно определения правильного уровня доз хорошо известны в области техники и в среде компетентных обычных врачей.

Любая известная схема введения для регуляции времени и последовательности доставки лекарственных препаратов может быть использована и повторена, как необходимо, для проведения лечения способами, соответствующими изобретению. Схема может включать предварительное лечения и/или совместное введение с дополнительным терапевтическим агентом(ами).

В одном варианте осуществления соединения, соответствующие изобретению, вводят животному, которое предположительно имеет или которое находится в области риска развития заболевания, нарушения или состояния, характеризующегося отложением амилоида. Например, животное может представлять собой старого человека.

В другом варианте осуществления соединения, соответствующие изобретению, связываются с Аβ с константой диссоциации (K_D) приблизительно от 0,0001 мкМ до приблизительно 10,0 мкМ при измерении по связыванию с синтетическим пептидом Аβ или тканью головного мозга, пораженного AD.

Способ детекции отложения(й) амилоида in vitro

Данное изобретение далее представляет способ детекции отложения(ий) амилоида in vitro, предусматривающий:

(i) контактирование ткани тела с эффективным количеством соединения, соответствующего изобретению, где соединение связывало бы любое отложение(я) амилоида в ткани, и

(ii) детекцию связывания соединения с отложением(ями) амилоида в ткани.

Связывание можно определить любыми средствами, известными в области техники. Примеры средств детекции включают микроскопические методики, такие как светлопольная, флуоресцентная, лазерно-конфокальная и перекрестно-поляризационная микроскопия.

В одном варианте осуществления ткань представляет собой биоптат или взятую посмертно ткань, которая фиксирована формалином или заморожена в свежем виде. В другом варианте осуществления ткань гомогенизирована. В еще одном варианте осуществления соединение, соответствующее изобретению, находится в растворе, который, кроме того, содержит 25-99% этанола, при этом оставшуюся часть раствора составляет вода. В еще одном варианте осуществления раствор содержит 0-50% этанола и от 0,0001 до 100 мкМ соединения. В еще одном варианте осуществления способ далее предусматривает (iii) выделение из ткани отложения(ий) амилоида, связанных с соединением, и (iv) количественное определение отложения(ий) амилоида, связанного с соединением, соответствующим изобретению. Связанные отложение(я) амилоида могут быть выделены из ткани любыми средствами, известными в области техники, такими как фильтрование. Количество связанного отложения(ий) амилоида можно превратить в единицы мкг отложения(ий) амилоида/100 мг ткани путем сравнения со стандартной кривой, полученной при инкубировании известных количеств амилоида с соединением, соответствующим изобретению, или фармацевтически приемлемой солью, гидратом, сольватом или пролекарственной формой.

Способ дифференцирования головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера от нормального головного мозга

Изобретение далее представляет способ дифференцирования головного мозга, пораженного болезнью Альцгеймера, от нормального головного мозга, предусматривающий:

(i) получение тканей из (а) мозжечка и (b) другой области того же самого головного мозга нормального животного и животного, предположительно пораженного болезнью Альцгеймера;

(ii) контактирование тканей с соединением, соответствующим изобретению;

(iii) определение количества амилоида, связанного с соединением;

(iv) вычисление соотношения количества амилоида в области головного мозга, отличной от мозжечка, и количества амилоида в мозжечке;

(v) сравнение соотношения для нормального животного с соотношением для животного, предположительно пораженного болезнью Альцгеймера.

Диагноз болезнь Альцгеймера может быть поставлен, если соотношение для животного, предположительно пораженного болезнью Альцгеймера, составляет, например, выше 90% от соотношения для нормального животного. Для данного способа термин "нормальное животное" означает животное, которое не страдает от болезни Альцгеймера.

Фармацевтические композиции

Данное изобретение далее представляет фармацевтическую композицию, содержащую:

(i) эффективное количество по меньшей мере одного соединения, соответствующего изобретению; и

(ii) фармацевтически приемлемый носитель.

Композиция может содержать один или более дополнительный фармацевтически приемлемый ингредиент(ы), включая без ограничения перечисленным один или более смачивающий агент(ы), забуферивающий агент(ы), суспендирующий агент(ы), скользящий агент(ы), эмульгатор(ы), разрыхлитель(и), адсорбент(ы), консервант(ы), поверхностно-активное вещество(а), краситель(и), отдушку(и), подсластитель(и) и терапевтический агент(ы).

Композиция может быть приготовлена в твердой, жидкой, гелеобразной или суспензионной форме для: (1) перорального введения, как, например, микстура (водный или неводный раствор или суспензия), таблетка (например, предназначенная для защечного, подъязычного или системного всасывания), болюс, порошок, гранула, паста для нанесения на язык, твердая желатиновая капсула, мягкая желатиновая капсула, спрей для полости рта, эмульсия и микроэмульсия; (2) парентерального введения путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, как, например, стерильный раствор, суспензия и препарат с задержанным высвобождением; (3) наружного нанесения, как, например, крем, мазь, пластырь с контролируемым высвобождением и спрей для нанесения на кожу; (4) интравагинального или интраректального введения, как, например, пессарий, крем или пена; (5) подъязычного введения; (6) глазного введения; (7) чрескожного введения или (8) назального введения.

В одном варианте осуществления композицию получают для внутривенного введения, и носитель включает жидкость и/или питательную добавку. В другом варианте осуществления композиция способна специфически связываться с амилоидом in vivo, способна проходить через гематоэнцефалический барьер, нетоксична при соответствующем уровне доз и/или имеет удовлетворительную продолжительность действия. В еще одном варианте осуществления композиция содержит приблизительно 10 мг человеческого сывороточного альбумина и от приблизительно 0,5 до 500 мг соединения, соответствующего изобретению/миллилитр фосфатного буфера, содержащего NaCl.

Следующие Примеры приведены для иллюстрации данного изобретения. Однако следует понимать, что изобретение не должно ограничиваться конкретными условиями или деталями, описанными в данных примерах. В описании любая и все ссылки на имеющийся в открытом доступе документ, включая патенты США, специально включены в данную патентную заявку в виде ссылки.

Примеры

Все реагенты, используемые в синтезе, приобретают в Aldrich Chemical Company и используют без дальнейшей очистки. Температуры плавления определяют с помощью Mel-TEMP II и не корректируют. ¹H ЯМР-спектры всех соединений измеряют на Bruker 300 при использовании TMS в качестве внутреннего стандарта, и они соответствуют определенным для них структурам. ТСХ (тонкослойную хроматографию) проводят, используя Силикагель 60 F₂₅₄, приобретенный в фирме ЕМ Sciences, и определяют под УФ-лампой. Флеш-хроматографию проводят на силикагеле 60 (зерно 230-400, приобретенный в Mallinckrodt Company). Материалы для ТСХ с обращенной фазой приобретают в Whiteman Company.

Общая методология синтеза соединения формулы I:

Соединение

R¹ представляет собой водород, -ОН, -NO₂, -CN, -COOR, -OCH₂OR, C₁-C₆алкил, С₂-С₆алкенил, C₂-C₆алкинил, C₁-C₆алкоксигруппу или галоген, где один или более атомов R¹ могут быть атомом с радиоактивной меткой;

R представляет собой C₁-C₆алкил, в котором один или более атомов углерода могут быть атомом с радиоактивной меткой;

гидролизуют одним из следующих способов:

Получение 2-аминотиофенола путем гидролиза:

6-замещенный 2-аминобензотиазол (172 ммоль) суспендируют в 50% КОН (180 г КОН, растворенного в 180 мл воды) и этиленгликоле (40 мл). Суспензию нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 48 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляют толуол (300 мл) и нейтрализуют реакционную смесь уксусной кислотой (180 мл). Органический слой отделяют и водный слой экстрагируют дополнительными 200 мл толуола. Толуоловые соли объединяют и промывают водой и сушат над МgSO₄. При выпаривании растворителя получают желательный продукт.

Получение 2-аминотиофенола путем гидразинолиза:

6-замещенный-бензотиазол (6,7 ммоль) суспендируют в этаноле (11 мл, безводный) и добавляют гидразин (2,4 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 1 часа. Растворитель выпаривают и остаток растворяют в воде (10 мл) и подводят рН до 5 уксусной кислотой. Остаток собирают фильтрацией и промывают водой для получения желательного продукта.

Полученный в результате 5-замещенный-2-амино-1-тиофенол формулы

связывают с бензойной кислотой формулы:

где R² представляет собой водород, и R³ и R⁴ независимо друг от друга обозначают водород, C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил посредством следующей реакции.

Смесь 5-замещенного 2-аминотиофенола (4,0 ммоль), бензойной кислоты (4,0 ммоль) и полифосфорной кислоты (РРА) (10 г) нагревают до 220°С в течение 4 часов. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают в 10% раствор карбоната калия (~400 мл). Осадок собирают фильтрацией при пониженном давлении для получения желательного продукта, который можно очистить флеш-хроматографией или перекристаллизацией.

Водород R² может быть замещен либо нерадиоактивным галогеном, либо радиоактивным галогеном путем следующей реакции.

К раствору 6-замещенного2-(4'-аминофенил)-бензотиазола (1 мг) в 250 мкл уксусной кислоты в закрытом флаконе добавляют 40 мкл раствора хлорамина-Т (28 мг растворяют в 500 мкл уксусной кислоты) с последующим добавлением 27 мкл (приблизительно 5 мКи) йодида [¹²⁵I] натрия (специфическая активность 2,175 Ки/ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 часов и гасят насыщенным раствором гидросульфита натрия. После разбавления 20 мл воды реакционную смесь нагружают на С8 Plus SepPak и элюируют 2 мл метанола. В зависимости от природы заместителя в положении 6 может потребоваться использование защитных групп. Например, 6-гидроксигруппу защищают как метансульфонильное (мезилокси) производное. Для снятия защиты метансульфонильной группы 0,5 мл 1 М NaOH добавляют к элюированному раствору радиойодированного промежуточного продукта. Смесь нагревают при 50°С в течение 2 часов. После гашения 500 мкл 1 М уксусной кислоты реакционную смесь разводят 40 мл воды и нагружают на С8 Plus SepPak. Радиойодированный продукт, имеющий радиоактивность приблизительно 3 мКи, элюируют с SepPak 2 мл метанола. Раствор конденсируют с использованием тока азота до 300 мкл, и неочищенный продукт очищают с помощью ВЭЖХ на колонке Phenomenex ODS (буфер МеСМ/ТЕА, 35:65, рН 7,5, при скорости потока 0,5 мл/минуту в течение до 4 минут, 1,0 мл/минуту в течение 4-6 минут и 2,0 мл/минуту более 6 минут, время удерживания 23,6). Собранные фракции нагружают на С8 Plus SepPak. Элюция с помощью 1 мл этанола дает приблизительно 1 мКи конечного радиойодированного продукта.

Когда один или оба из R³ и R⁴ представляют собой водород, R³ и R⁴ можно превратить в C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил реакцией с алкил-, алкенил- или алкинилгалидом в следующих условиях.

Для диалкилирования: К раствору 6-замещенного 2-(4'-аминофенил)-бензотиазола (0,59 ммоль) в ДМСО (диметилсульфоксиде) (безводный, 2 мл) добавляют алкил-, алкенил- или алкинилгалид (2,09 ммоль) и К₂СО₃ (500 мг, 3,75 ммоль). Реакционную смесь нагревают при 140°С в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь выливают в воду и экстрагируют этилацетатом (3×10 мл). Органические слои объединяют и растворитель выпаривают. Остаток очищают с помощью флеш-колонки, получая желательный 6-замещенный (диметиламинофенил)-бензотиазол.

Для моноалкилирования: К раствору 6-замещенного 2-(4'-аминофенил)-бензотиазола (0,013 ммоль) в ДМСО (безводный, 0,5 мл) добавляют алкил-, алкенил- или алкинилгалид (0,027 ммоль) и безводный К₂СО₃ (100 мг, 0,75 ммоль). Реакционную смесь нагревают при 100°С в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь непосредственно очищают с помощью препаративной ТСХ (тонкослойной хроматографии) с нормальной фазой, получая желательные 6-замещенные-2-(4'-метиламинофенил)-бензотиазольные производные.

Когда R² представляет собой водород или нерадиоактивный галоген, R⁴ представляет собой C₁-C₆алкил, C₂-C₆алкенил или C₂-C₆алкинил, где алкил, алкенил или алкинил содержит радиоактивный углерод или замещен радиоактивным галогеном, соединение может быть синтезировано посредством одного из следующих циклов.

Для включения радиоактивного углерода:

Приблизительно 1 Ки [¹¹С] диоксида углерода получают при использовании циклотрона для ускорения отрицательных ионов CTI/Siemens RDS 112 путем облучения газообразного азота (¹⁴N₂)-мишени, содержащего 1% газообразного кислорода с помощью тока пучка 40 пА протонов 11 МэВ в течение 60 минут. [¹¹С] диоксид углерода превращают в [¹¹С] метилйодид путем сначала проведения его реакции с насыщенным раствором гидрида лития алюминия в ТГФ (тетрагидрофуране) с последующим добавлением гидройодной кислоты при температуре кипения с обратным холодильником для получения [¹¹С] метилйодида. [¹¹С] метилйодид переносят в токе газообразного азота в реакционный флакон, содержащий предшественник для введения радиоактивной метки. Предшественник, 6-замещенный 2-(4'-аминофенил)-бензотиазол (-3,7 моля) растворяют в 400 мкл ДМСО. Добавляют сухой КОН (10 мг) и взбалтывают V-образный флакон объемом 3 мл в течение 5 минут. Без добавления какого-либо носителя [¹¹С] метилйодид барботируют через раствор со скоростью 30 мл/минуту при комнатной температуре. Реакцию нагревают в течение 5 минут при 95°С, используя масляную баню. Продукт реакции очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ, используя колонку Prodigy ODS-Prep, элюируемую 60% ацетонитрилом/40% триэтиламмониевым фосфатным буфером рН 7.2 (при потоке 5 мл/минуту в течение 0-7 минут, затем повышают до 15 мл/минуту в течение 7-30 минут). Фракцию, содержащую [N-метил-¹¹С]6-замещенный 2-(4'-метиламинофенил)-бензотиазол (через приблизительно 15 минут) собирают и разводят 50 мл воды и элюируют через картридж Waters С 18 SepPak Plus. С 18 SepPak промывают 10 мл воды, и продукт элюируют 1 мл этанола (абсолютного) в стерильный флакон, а затем 14 мл солевого раствора. Радиохимическая и химическая чистота составляют >95%, как определяют аналитической ВЭЖХ (k'=4,4 при использовании аналитической колонки Prodigy ODS (3) с системой 65/35 ацетонитрил/триэтиламмоний фосфатный буфер рН 7,2). Радиохимический выход в среднем составляет 17% по EOS (электрооптическая система) на основе [¹¹С] метилйодида, и специфическая активность в среднем составляет приблизительно 160 ГБк/пмоль (4,3 Ки/мкмоль) в конце синтеза.

Для включения радиоактивного галогена:

Смесь 6-замещенного 2-(4'-аминофенил)-бензотиазола (защитные группы могут быть необходимы в зависимости от природы 6-заместителя, как указано выше) (0,22 ммоль), NaH (4,2 ммоль) и 2-(-3-бромпропокси)тетрагидро-2-Н-пиран (0,22 ммоль) в ТГФ (8 мл) нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 23 часов. Растворитель удаляют путем дистилляции и остаток растворяют в этилацетате и воде, органический слой отделяют и водный слой экстрагируют этилацетатом (10 мл × 6). Органический слой объединяют и сушат над MgSO₄ и выпаривают досуха. Остаток добавляют к раствору AcOH/THF/H₂O (5 мл, 4/2/1) и нагревают до 100°С в течение 4 часов. Растворитель удаляют выпариванием и остаток растворяют в этилацетате (~10 мл), промывают раствором NаНСО₃, сушат над MgSO₄ и выпаривают досуха для получения остатка, который очищают с помощью препаративной ТСХ (гексан:этиацетат=60:40), что дает желаемый 6-замещенный 2-(4'-(3''-гидроксипропиламино)-фенил)-бензотиазол (45%).

К раствору 6-замещенного 2-(4'-(3''-гидроксипропиламино)-фенил)-бензотиазола (0,052 ммоль) и Et₃N (0,5 мл), растворенного в ацетоне (5 мл), добавляют (Boc)₂O (50 мг, 0,22 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов с последующим добавлением тозилхлорида (20 мг, 0,11 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение еще 24 часов. Растворитель удаляют и остаток растворяют в этилацетате (10 мл), промывают раствором NаСО₃, сушат над MgSO₄, выпаривают и очищают с использованием флеш-колонки (гексан/этилацетат=4/1), получая желаемый 6-замещенный 2-(4'-(3''-толуолсульфоноксипропиламино)-фенил)-бензотиазол (13%). Затем данный 6-замещенный 2-(4'-(3''-толуол-сульфоноксипропиламино)-фенил)-бензотиазол радиофторируют стандартными способами следующим образом.

Мишень циклотрона, содержащую 0,35 мл 95% [O-18]-обогащенной воды, облучают протонами 11 МэВ при токе пучка 20 мкА в течение 60 минут и содержимое переносят в реакционный флакон объемом 5 мл, содержащий Kryptofix 222 (22,3 мг) и К₂СО₃ (7,9 мг) в ацетонитриле (57 мкл). Раствор трижды выпаривают досуха при 110°С в токе аргона с последующим добавлением аликвот ацетонитрила по 1 мл. К высушенному [F-18] фториду добавляют 3 мг 6-замещенного 2-(4'-(3''-толуолсульфонокси-пропиламино)-фенил)-бензотиазола в 1 мл ДМСО, запечатывают реакционный флакон и нагревают до 85°С в течение 30 минут. В реакционный флакон добавляют 0,5 мл МеОН/НСl (концентрированной) (2/1 об./об.) и флакон нагревают при 120°С в течение 10 минут. После нагревания к реакционной смеси добавляют 0,3 мл 2М буфера на основе ацетата натрия с последующей очисткой с помощью полупрепаративной ВЭЖХ при использовании колонки Phenomenex Prodigy ODS-prep C18 (10 мкм 250×10 мм), элюируемой 40% ацетонитрилом/60% 60 нМ триэтиламин-фосфатным буфером (об./об.) рН 7,2 при скорости потока 5 мл/минуту в течение 15 минут, затем поток увеличивают до 8 мл/минуту для оставшегося разделения. Продукт [F-18] 6-замещенный 2-(4'-(3''-фторпропиламино)-фенил)-бензотиазол элюируется на 20 минуте в объеме приблизительно 16 мл. Фракцию, содержащую [F-18] 6-замещенный 2-(4'-(3''-фторпропиламино)-фенил)-бензотиазол разводят 50 мл воды и элюируют через картридж Waters C18 SepPak Plus. Затем картридж SepPak промывают 10 мл воды и элюируют продукт при использовании 1 мл этанола (абсолютного) в стерильный флакон. Раствор разводят 10 мл стерильного физиологического раствора для внутривенной инъекции животным. Продукт [F-18] 6-замещенный 2-(4'-(3''-фторпропиламино)-фенил)-бензотиазола получают с радиохимическим выходом 2-12% в конце 120 минуты радиосинтеза (без коррекции с учетом распада) со средней специфической активностью 1500 Ки/ммоль.

Примеры синтеза

Пример 1:

[N-метил-¹¹С]2-(4'-диметиламинофенил)-6-метокси-бензотиазол синтезируют согласно Схеме I.

Схема I

Приблизительно 1 Ки [¹¹С] диоксида углерода получают при использовании циклотрона для ускорения отрицательных ионов CTI/Siemens RDS 112 путем облучения газообразного азота (14N2)-мишени, содержащего 1% газообразного кислорода, с помощью тока пучка 40 мкА протонов 11 МэВ в течение 60 минут. [¹¹С] диоксид углерода превращают в [¹¹С] метилйодид путем сначала проведения его реакции с насыщенным раствором гидрида лития алюминия в ТГФ с последующим добавлением гидройодной кислоты при температуре кипения с обратным холодильником для получения [¹¹С] метилйодида. [¹¹С] метилйодид переносят в токе газообразного азота в реакционный флакон, содержащий предшественник для введения радиоактивной метки. Предшественник, 6-CH₃O-BTA-1 (1,0 мг, 3,7 мкмоль) растворяют в 400 мкл ДМСО. Добавляют сухой КОН (10 мг) и взбалтывают V-образный флакон объемом 3 мл в течение 5 минут. Без добавления какого-либо носителя [¹¹С] метилйодид барботируют через раствор со скоростью 30 мл/минуту при комнатной температуре. Реакцию нагревают в течение 5 минут при 95°С, используя масляную баню. Продукт реакции очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ, используя колонку Prodigy ODS-Prep, элюируемую 60% ацетонитрилом/40% триэтиламмониевым фосфатным буфером рН 7,2 (при потоке 5 мл/минуту в течение 0-7 минут, затем повышаемом до 15 мл/минуту в течение 7-30 минут). Фракцию, содержащую [N-метил-¹¹С]2-(4'-диметиламинофенил)-6-метокис-бензотиазол (через приблизительно 15 минут) собирают и разводят 50 мл воды и элюируют через картридж Waters C18 SepPak Plus. С 18 SepPak промывают 10 мл воды и продукт элюируют 1 мл этанола (абсолютного) в стерильный флакон, а затем 14 мл солевого раствора. Радиохимическая и химическая чистота составляют >95%, как определяют аналитической ВЭЖХ (k'=4,4 при использовании аналитической колонки Prodigy ODS(3), элюируемой 65/35 ацетонитрилом/триэтиламмоний фосфатным буфером рН 7,2). Радиохимический выход в среднем составляет 17% по EOS на основе [¹¹С] метилйодида, и специфическая активность в среднем составляет приблизительно 160 ГБк/мкмоль (4,3 Ки/мкмоль) в конце синтеза.

Пример 2: 2-(3'-¹²⁵I-йoд-4'-aминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oл синтезируют согласно Схеме II.

Схема II

К раствору 2-(4'-аминофенил)-6-метансульфонокси-бензотиазола (1 мг) в 250 мкл уксусной кислоты в закрытом флаконе добавляют 40 мкл раствора хлорамина-Т (28 мг растворяют в 500 мкл уксусной кислоты) с последующим добавлением 27 мкл (приблизительно 5 мКи) йодида [¹²⁵I] натрия (специфическая активность 2,175 Ки/ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 часов и гасят насыщенным раствором гидросульфита натрия. После разбавления 20 мл воды реакционную смесь нагружают на С8 Plus SepPak и элюируют 2 мл метанола. Для снятия защиты метансульфонильной группы 0,5 мл 1 М NaOH добавляют к элюированному раствору радиойодированного промежуточного продукта. Смесь нагревают при 50°С в течение 2 часов. После гашения 500 мкл 1 М уксусной кислоты реакционную смесь разводят 40 мл воды и нагружают на С8 Plus SepPak. Радиойодированный продукт, имеющий радиоактивность приблизительно 3 мКи, элюируют с SepPak 2 мл метанола. Раствор конденсируют с использованием тока азота до 300 мкл и неочищенный продукт очищают с помощью ВЭЖХ на колонке Phenomenex ODS (буфер МеСМ/ТЕА, 35:65, рН 7,5, при скорости потока 0,5 мл/минуту до 4 минут, 1,0 мл/минуту в течение 4-6 минут и 2,0 мл/минуту более 6 минут, время удерживания 23,6). Собранные фракции нагружают на С8 Plus SepPak. Элюция с помощью 1 мл этанола дает приблизительно 1 мКи конечного радиойодированного продукта.

Получение производных, несущих радиоактивную метку ¹²³I, аналогичным образом предшествует вышеописанному синтезу. Например, замена [¹²⁵I] йодида натрия [¹²³I] йодидом натрия в способе синтеза привело бы к получению соединения, несущего радиоактивную метку ¹²³I. Данная замена одного атома радиоактивного галогена другим хорошо известна в области техники, см., например, работы Mathis C.A., Taylor S.E., Biegon A., Enas J.D. [¹²⁵I] 5-йод-6-нитроквипазин каксильный и селективный лиганд для комплекса I поглощения 5-гидрокситриптамина / Исследования in vitro. ([¹²⁵I] 5-lodine-6-nitroquipazine: a potent and selective ligand for the 5-Hydroxytryptamine uptake complex I. In vitro studies), Brain Research, 1993, 619:229-235; Jagust W., Eberling J.L, Roberts J.A., Brennan K.M., Hanrahan S.M., Van Brocklin H., Biegon A., Mathis C.A. Визуализация in vivo области поглощения 5-гидрокситриптамина в головном мозге приматов при использовании SPECT и [¹²³I]5-йод-6-нитроквипазина. (In vivo imaging of the 5-hydroxytryptamine reuptake site in primate brain using SPECT and [¹²³I] 5-lodine-6-nitroquipazine). European Journal of Pharmacolgy, 1993, 242:189-193; Jagust W.J., Eberling J.L, Biegon A., Taylor S.E., Van Brocklin H., Jordan S., Hanrahan S.M., Roberts J.A., Brennan K.M., Mathis C.A. [Йод-123]5-йод-6-нитроквипазин как радиометка для SPECT для визуализации серотонинового транспортера ([Iodine-123] 5-iodo-6-nitroquipazine: SPECT Radiotracer to Image the Serotonin Transporter), Journal of Nuclear Medicine, 1996, 37:1207-1214).

Пример 3: 2-(3-¹⁸F-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oл синтезируют согласно Схеме III.

Схема III

Мишень циклотрона, содержащую 0,35 мл 95% [О-18]-обогащенной воды, облучают протонами 11 МэВ при токе пучка 20 мкА в течение 60 минут и содержимое переносят в реакционный флакон объемом 5 мл, содержащий 2 мг CsCO₃ в ацетонитриле (57 мкл). Раствор трижды выпаривают досуха при 110°С в токе аргона с использованием аликвот ацетонитрила по 1 мл. К высушенному [F-18] фториду добавляют 6 мг 6-МОМО-ВТ-3'-Сl-4'-NO₂ в 1 мл ДМСО, запечатывают реакционный флакон и нагревают до 120°С в течение 20 минут (включение радиохимического агента на данной первой стадии радиосинтеза составляет приблизительно 20% солюбилизированного [F-18]фторида). К неочищенной реакционной смеси добавляют 8 мл воды и 6 мл диэтилового эфира, смесь встряхивают и дают разделиться. Фазу эфира удаляют и выпаривают досуха в токе аргона при 120°С. К высушенному образцу добавляют 0,5 мл абсолютного EtOH вместе с 3 мг ацетата меди (II) и 8 мг NaBH₄. Реакции восстановления дают протекать в течение 10 минут при комнатной температуре (выход неочищенного продукта для стадии восстановления составляет приблизительно 40%). К реакционной смеси добавляют 8 мл воды и 6 мл диэтилового эфира, смесь встряхивают и отделяют фазу эфира. Фазу диэтилового эфира сушат под током аргона при 120°С. В реакционный флакон добавляют 700 мкл ДМСО, содержащего 30 микромолей СН₃I и 20 мг сухого КОН. Реакционный флакон нагревают при 120°С в течение 10 минут. Добавляют 700 мкл 2:1 MeOH/HCl (концентрированной) и нагревают в течение 15 минут при 120°С. После нагревания к реакционной смеси добавляют 1 мл 2М буфера на основе ацетата натрия с последующей очисткой с помощью полупрепаративной ВЭЖХ при использовании колонки Phenomenex Prodigy ODS-prep C18 (10 мкм 250×10 мм), элюируемой 35% ацетонитрилом/60% 60 нМ триэтиламинфосфатным буфером (об./об.) рН 7,2 при скорости потока 5 мл/минуту в течение 2 минут, затем поток увеличивают до 15 мл/минуту для оставшегося разделения. Продукт 2-(3-¹⁸F-фтор-4-метиламино-фенил)-бензотиазол-6-ол элюируют на ~ 15 минуте в объеме приблизительно 16 мл. Фракцию, содержащую 2-(3-¹⁸F-фтор-4-метиламино-фенил)-бензотиазол-6-ол разводят 50 мл воды и элюируют через картридж Waters C18 SepPak Plus. Затем картридж SepPak промывают 10 мл воды и элюируют продукт при использовании 1 мл этанола (абсолютного) в стерильный флакон. Раствор разводят 10 мл стерильного физиологического раствора для внутривенной инъекции животным. Продукт 2-(3-¹⁸F-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бензотиазол-6-ол получают с радиохимическим выходом 0,5% (n=4) в конце 120 минуты радиосинтеза (без коррекции с учетом распада) со средней специфической активностью 1000 Ки/ммоль. Радиохимическую и химическую чиcтoтy 2-(3-¹⁸F-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oлa oцeнивaют пo радио-ВЭЖХ с УФ-детекцией при длине волны 350 нм при использовании колонки Phenomenex Prodigy ODS(3)C18 (5 мкм, 250×4,6 мм), элюируемой 40% ацетонитрила/60% 60 мМ триэтиламинфосфатного буфера (об./об.) рН 7,2. 2-(3-¹⁸F-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oл имеет время удерживания ~11 минут при скорости потока 2 мл/мин (k'=5,5). Радиохимическая чистота составляет >99% и химическая чистота составляет >90%. Радиохимическую идентичность 2-(3-¹⁸F-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бензотиазол-6-ола подтверждают радио-ВЭЖХ с обращенной фазой при использовании образца для контроля качества конечного радиохимического продукта, вводимого совместно с аутентичным (холодным) стандартом.

Пример 4: 2-[4-(3-¹⁸F-фтop-пpoпилaминo)-фeнил]-бeнзoтиaзoл-6-oл синтезируют согласно Схеме IV.

Схема IV

Мишень циклотрона, содержащую 0,35 мл 95% [0-18]-обогащенной воды, облучают протонами 11 МэВ при токе пучка 20 мкА в течение 60 минут и содержимое переносят в реакционный флакон объемом 5 мл, содержащий Kryptofix 222 (22,3 мг) и К₂СО₃ (7,9 мг) в ацетонитриле (57 мкл). Раствор трижды выпаривают досуха при 110°С в токе аргона с последующим добавлением аликвот ацетонитрила по 1 мл. К высушенному [F-18] фториду добавляют 3 мг 6-MOMO-BTA-N-Pr-OTs в 1 мл ДМСО, запечатывают реакционный флакон и нагревают до 85°С в течение 30 минут. В реакционный флакон добавляют 0,5 мл МеОН/НСl (концентрированной) (2/1 об./об.) и флакон нагревают при 120°С в течение 10 минут. После нагревания к реакционной смеси добавляют 0,3 мл 2 М буфера на основе ацетата натрия с последующей очисткой с помощью полупрепаративной ВЭЖХ при использовании колонки Phenomenex Prodigy ODS-prep C18 (10 мкм 250×10 мм), элюируемой 40% ацетонитрилом/60% 60 нМ триэтиламин-фосфатным буфером (об./об.) рН 7,2 при скорости потока 5 мл/минуту в течение 15 минут, затем поток увеличивают до 8 мл/минуту для оставшегося разделения. Продукт, [F-18]6-HO-BTA-N-PrF, элюируется на ~20 минуте в объеме приблизительно 16 мл. Фракцию, содержащую [F-18]6-HO-BTA-N-PrF, разводят 50 мл воды и элюируют через картридж Waters C18 SepPak Plus. Затем картридж SepPak промывают 10 мл воды и элюируют продукт при использовании 1 мл этанола (абсолютного) в стерильный флакон. Раствор разводят 10 мл стерильного физиологического раствора для внутривенной инъекции животным. Продукт [F-18]6-HO-BTA-N-PrF получают с радиохимическим выходом 8±4% (n=8) в конце 120 минуты радиосинтеза (без коррекции с учетом распада) со средней специфической активностью 1500 Ки/ммоль. Радиохимическую и химическую чистоту [F-18]6-HO-BTA-N-PrP оценивают по радио-ВЭЖХ с УФ-детекцией при длине волны 350 нм при использовании колонки Phenomenex Prodigy ODS(3)C18 (5 мкм, 250×4,6 мм), элюируемой 40% ацетонитрила/60% 60 мМ триэтиламин-фосфатного буфера (об./об.) рН 7,2. [F-18]6-HO-BTA-N-PrF имеет время удерживания ~12 минут при скорость потока 2 мл/минуту (k'=6,1). Радиохимическая чистота составляет >99% и химическая чистота составляет >90%. Радиохимическую идентичность [F-18]6-HO-BTA-N-PrF подтверждают радио-ВЭЖХ с обращенной фазой при использовании образца для контроля качества конечного радиохимического продукта, вводимого совместно с аутентичным (холодным) стандартом.

Пример 5: Синтез 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-гидроксибензотиазола

Получение 4-метокси-4'-нитробензанилида

п-Анизидин (1,0 г, 8,1 ммоль) растворяют в безводном пиридине (15 мл) и добавляют 4-нитробензоилхлорид (1,5 г, 8,1 ммоль). Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре на 16 час. Реакционную смесь выливают в воду и собирают осадок фильтрованием под вакуумным давлением и промывают 5% бикарбонатом натрия (2×10 мл). Продукт используют на следующей стадии без дальнейшей очистки. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ДMCO-d₆) δ: 10,46 (s, 1H, NH), 8,37 (d, J=5,5 Гц, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J=6,3 Гц, 2Н, Н-2',6'), 7,48 (d, J=6,6 Гц, 2Н), 6,97 (d, J=6,5 Гц, 2H), 3,75 (s, 3H, МеО).

Получение 4-метокси-4'-нитротиобензанилида

Смесь 4-метокси-4'-нитротиобензанилина (1,0 г, 3,7 ммоль) и реагента Лауссона (0,89 г, 2,2 ммоль, 0,6 экв.) в хлорбензине (15 мл) нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 4 час. Растворитель выпаривают и осадок очищают на колонке для флеш-хроматографии (система гексан:этилацетат=4:1), получая 820 мг (77,4%) продукта в виде твердого вещества оранжевого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ДМСО-d₆) δ: 8,29 (d, 2Н, Н-3',5'), 8,00 (d, J=8,5 Гц, 2Н, Н-2',6'), 7,76 (d, 2H), 7,03 (d, J=8,4 Гц, 2H), 3,808,37 (d, J=5,5 Гц, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J=6,3 Гц, 2Н, H-2',6'), 7,48 (d, J=6,6 Гц, 2H), 6,97 (d, J=6,5 Гц, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO), (s, 3H, MeO).

Получение 6-метокси-2-(4-нитрофенил)бензотиазола

4-Метокси-4'-нитротиобензанилиды (0,5 г, 1,74 ммоль) смачивают небольшим количеством этанола (~ 0,5 мл) и добавляют 30% водный раствор гидроксида натрия (556 мг, 13,9 ммоль, 8 экв.). Смесь разводят водой для получения конечного раствора/суспензии 10% водного гидроксида натрия. Аликвоты данной смеси добавляют с интервалами 1 мин в перемешиваемый раствор феррицианида калия (2,29 г, 6,9 ммоль, 4 экв.) в воде (5 мл) при 80-90°С. Реакционную смесь дополнительно нагревают в течение 0,5 час, а затем позволяют ей охладиться. Твердое вещество собирают фильтрацией под вакуумом, промывают водой и очищают на колонке для флеш-хроматографии (система гексан:этилацетат=4:1), получая 130 мг (26%) продукта. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ацетон-d₆) δ: 8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J=8,5 Гц, 1Н, Н-4), 7,69 (s, 1Н, Н-7), 7,22 (d, J=9,0 Гц, 1Н, Н-5), 3,90 (s, 3H, MeO).

Получение 6-метокси-2-(4-аминофенил)бензотиазола

Смесь 6-метокси-2-(4-нитрофенил)бензотиазолов (22 мг, 0,077 ммоль) и хлорида олова(II) (132 мг, 0,45 ммоль) в кипящем этаноле перемешивают под азотом в течение 4 час. Этанол выпаривают и остаток растворяют в этилацетате (10 мл), промывают 1 Н гидроксидом натрия (2 мл) и водой (5 мл) и сушат над MgSO₄. При выпаривании растворителя получают 19 мг (97%) продукта в виде твердого вещества желтого цвета.

Получение 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-метоксибензотиазола

В раствор 2-(4'-аминофенил)-6-метокси бензотиазола (22 мг, 0,09 ммоль) в ледяной уксусной кислоте (2,0 мл) вводят 1 М раствор йодохлорида в CH₂Cl₂ (0,10 мл, 0,10 ммоль, 1,2 экв.) в атмосфере N₂. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Ледяную уксусную кислоту удаляют при пониженном давлении и остаток растворяют в CH₂Cl₂. После нейтрализации раствора с помощью NаНСО₃ водный слой отделяют и экстрагируют CH₂Cl₂. Органические слои объединяют и сушат над МgSO₄. После выпаривания растворителя остаток очищают с помощью препаративной ТСХ (Гексаны:этилацетат=6:1), получая 2-(4'-амино-3'-йодфенил)-6-метокси бензотиазол (25 мг, 76%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 8,35 (d, J=2,0 Гц, 1Н), 7,87 (dd, J₂=2,0 Гц, J₂=9,0 Гц, 1Н), 7,31 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,04 (dd, J₁=2,2 Гц, J₂=9,0 Гц, 1Н), 6,76 (d, J=9,0 Гц, 1Н), 3,87 (s, 3Н).

Получение 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-гидроксибензотиазола

В раствор 2-(4'-амино-3'-йодфенил)-6-метоксибензотиазола (8,0 мг, 0,02 ммоль) в CH₂Cl₂ (2,0 мл) впрыскивают 1 М раствор ВВr₃ в CH₂Cl₂ (0,20 мл, 0,20 ммоль) в атмосфере N₂. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. После подавления реакции водой смесь нейтрализуют NаНСО₃. Водный слой экстрагируют этилацетатом (3×3 мл). Органические слои объединяют и сушат над MgSO₄. Затем растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток очищают с помощью препаративной ТСХ (Гексаны:этилацетат=7:3), получая 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-гидроксибензотиазол (4,5 мг, 58%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ацетон-d₆) δ (ppm): 8,69 (s, 1H), 8,34 (d, J=2,0 Гц, 1Н), 7,77 (dd, J₁=2,0 Гц, J₂=8,4 Гц, 1H), 7,76 (d, J=8,8 Гц, 1H), 7,40 (d, J=2,4 Гц, 1H), 7,02 (dd, J,=2, 5 Гц, J₂=8,8 Гц, 1H), 6,94 (d, J=8,5 Гц, 1H), 5,47 (br, 2H). HRMS (масс-спектрометрия высокого разрешения) m/z 367,9483 (М+ рассчитано для C₁₃H₉N₂OSI 367,9480).

Пример 6: Синтез 2-(3'-йод-4'-метиламинофенил)-6-гидрокси-бензотиазола

Получение 6-метокси-2-(4-метиламинофенил)бензотиазола

Смесь 4-метиламинобензойной кислоты (11,5 г, 76,2 ммоль) и 5-метокси-2-аминотиофенола (12,5 г, 80 ммоль) нагревают РРА (~30 г) до 170°С в атмосфере N₂ в течение 1,5 часов. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают в 10% раствор К₂СО₃. Осадок фильтруют при пониженном давлении. Неочищенный продукт дважды перекристаллизовывают из смесей ацетон/вода и ТГФ/вода с последующей обработкой активным углеродом, получая 4,6 г (21%) 6-метокси-2-(4-метиламинофенил)бензотиазола в виде твердого вещества желтого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ацетон-d₆) δ: 7,84 (d, J=8,7 Гц, 2H, Н-2'6'), 7,78 (dd, J₁=8,8 Гц, J₂=1,3 Гц, 1H, Н-4), 7,52 (d, J=2,4 Гц, 1Н, Н-7), 7,05 (dd, J₁=8,8 Гц, J₂=2,4 Гц, Н-5), 6,70 (d, J=7,6 Гц, 2Н, Н-3'5'), 5,62 (s, 1H, NH), 3,88 (s, 3Н, ОСН₃), 2,85 (d, J=6,2 Гц, 3Н, NСН₃).

Получение 2-(3'-йод-4'-метиламинофенил)-6-метоксибензотиазола.

К раствору 2-(4'-метиламинофенил)-6-метоксибензотиазола (20 мг, 0,074 ммоль), растворенного в ледяной уксусной кислоте (2 мл), добавляют Icl (90 мкл, 0,15 ммоль, 1,2 экв., 1М в CH₂Cl₂) под N₂. Реакцию проводят при перемешивании при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем ледяную уксусную кислоту удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в CH₂Cl₂ и нейтрализуют NаНСО₃. Водный слой экстрагируют CH₂Cl₂ и органические слои объединяют, сушат над MgSO₄ и выпаривают. Остаток очищают с помощью препаративной ТСХ (Гексан:ЕА=2:1), получая 2-(4'-метиламино-3'-йодфенил)-6-метоксибензотиазол (8 мг, 27%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, СDСl₃) δ (ррm): 8,39 (d, J=2,0 Гц, 1H), 7,88 (d, J=9,0 Гц, 1H), 7,33 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,06 (dd, J₁=2,2 Гц, J₂=9,0 Гц, 1H), 6,58 (d, J=9,0 Гц, 1H), 3,89 (s, 3Н, ОСН₃).

Получение 2-(3'-йод-4'-метиламино-фенил)-6-гидрокси бензотиазола

К раствору 2-(4'-метиламино-3'-йодфенил)-6-метокси бензотиазола (12 мг, 0,03 ммоль), растворенного в СН₂Сl₂ (4 мл), добавляют ВВr₃ (400 мкл, 0,4 ммоль, 1М в CH₂Cl₂) под N₂. Реакцию проводят при перемешивании при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем добавляют воду, чтобы прекратить реакцию, нейтрализуют раствор NаНСО₃, экстрагируют этилацетатом (3×5 мл). Органические слои объединяют, сушат над MgSO₄ и выпаривают. Остаток очищают с помощью препаративной ТСХ (Гексан:ЕА=7:3), получая 2-(4'-метиламино-3'-йодфенил)-6-гидроксибензотиазол (5 мг, 43%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 8,37 (d, Н=2,0 Гц, 1Н), 7,88 (dd, J₁=2,0 Гц, J₂=8,4 Гц, 1Н), 7,83 (d, J=8,8 Гц, 1Н), 7,28 (d, J=2,4 Гц, 1Н), 6,96 (dd, J=2,5 Гц, J₂=8,8 Гц, 1Н), 6,58 (d, J=8,5 Гц, 1Н), 2,96 (s, 3H, СН₃).

Пример 7: Радиосинтез [¹²⁵I]6-ОН-ВТА-0-3'-1

Получение 2-(4'-нитрофенил)-6-гидроксибензотиазола

К суспензии 2-(4'-нитрофенил)-6-метокси бензотиазола (400 мг, 1,5 ммоль) в CH₂Cl₂ (10 мл) добавляют ВВr₃ (1М в СН₂Сl₂, 10 мл, 10 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем реакцию гасят водой и экстрагируют этилацетатом (3×20 мл). Органические слои объединяют и промывают водой, сушат над MgSO₄ и выпаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией (силикагель, гексаны:этилацетат=1:1), продукт в виде твердого вещества желтого цвета (210 мг, 55%). Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, Ацетон-d₆) δ (ppm): 9,02 (s, ОН), 8,41 (d, J=9,1 Гц, 1H), 8,33 (d, J=9,1 Гц, 1H), 7,96 (d, J=8,6 Гц, 1Н), 7,53 (d, J=2,4 Гц, 1H), 7,15 (dd, J₁=8,6 Гц, J₂=2,4 Гц, 1H).

Получение 2-(4'-нитрофенил)-6-метилсульфоксибензотиазола

К раствору 2-(4'-нитрофенил)-6-гидроксибензотиазола (50 мг, 0,18 ммоль), растворенного в ацетоне (7 мл, безводный), добавляют K₂CO₃ 100 мг, 0,72 ммоль, в виде порошка и MsCl (200 мкл). После перемешивания в течение 2 часов реакционную смесь фильтруют. Фильтрат концентрируют и остаток очищают на колонке для флеш-хроматографии (силикагель, гексан:этилацетат=4:1), получая 2-(4'-нитрофенил)-6-метилсульфокси-бензотиазол (44 мг, 68%) в виде твердого вещества светло-желтого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, Ацетон-d₆) δ (ppm): 8,50-8,40 (m, 4H), 8,29 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 8,23 (d, J=8,91 Гц, 1H), 7,61 (dd, J₁=2,3 Гц, J₂=8,9 Гц, 1Н). Получение 2-(4'-аминофенил)-6-метилсульфоксибензотиазола

К раствору 2-(4'-нитрофенил)-6-метилсульфоксибензотиазола (35 мг, 0,10 ммоль), растворенного в этаноле (10 мл), добавляют SnCl₂×2H₂O (50 мг). Реакционную смесь нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 1,5 часов. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в этилацетате (10 мл), промывают 1H NaOH, водой, сушат над МgSO₄. Выпаривание растворителя приводит к получению 2-(4'-аминофенил)-6-метилсульфоксибензотиазола (21 мг, 65%) в виде твердого вещества светло-коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 8,02 (d, J=6,2 Гц, 1H), 7,92 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7,84 (d, J=2,4 Гц, 1H), 7,38 (dd, J=2,4 Гц, J₂=6,2 Гц, 1H), 6,78 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 2,21 (s, 3Н, СН₃).

Пример 8: Радиосинтез [¹²⁵I]6-OH-BTA (производных бензотиазолов)

К раствору 2-(4'-метиламинофенил)-6-гидроксибензотиазола (300 мг, 1,17 ммоль), растворенного в CH₂Cl₂ (20 мл), добавляют Еt₃N (2 мл) и трифторуксусную кислоту (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток растворяют в этилацетате (30 мл), промывают раствором NаНСО₃, солевым раствором, водой и сушат над МgSO₄. После выпаривания растворителя остаток растворяют в ацетоне (20 мл, предварительно высушенным над К₂СО₃, добавляют К₂СО₃ (1,0 г, в виде порошка), а затем MsCl (400 мг, 3,49 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре и мониторируют с помощью ТСХ, когда пропадает исходный материал. Затем остаток фильтруют. Фильтрат выпаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в этилацетате (30 мл), промывают раствором NаНСО₃, солевым раствором, водой и сушат над MgSO₄. После выпаривания растворителя остаток растворяют в ЕtOН и добавляют NaBH₄. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель выпаривают и остаток растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом (20 мл × 3), экстракты объединяют и сушат над МgSO₄. После выпаривания растворителя остаток очищают на колонке для флеш-хроматографии (гексаны/этилацетат=8:1), получая продукт (184 мг, 47,0%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, CDCl₃) δ (ppm): 7,94 (d, J=8,8 Гц, 1Н), 7,87 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 7,77 (d, J=2,3 Гц, 1Н), 7,30 (dd, J₁=8,8 Гц, J₂=2,31 Гц, 1Н), 6,63 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 3,16 (s, СН₃), 2,89 (s, NСН₃).

Основные способы введения радиоактивной метки.

К раствору 2-(4'-аминофенил)-6-метансульфоноксибензотиазол или 2-(4'-метиламинофенил)-6-метилсульфоксибензотиазола (1 мг) в 250 мкл уксусной кислоты в закрытом флаконе добавляют 40 мкл раствора хлораминов Т (28 мг растворяют в 500 мкл уксусной кислоты) с последующим добавлением 27 мкл (приблизительно 5 мКи) йодида [¹²⁵I] натрия (удельная активность 2,175 Ки/ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 часов и реакцию прекращают насыщенным раствором гидросульфита натрия. После разбавления 20 мл воды реакционную смесь нагружают на С8 Plus SepPak и элюируют 2 мл метанола. Для снятия защиты метансульфонильной группы 0,5 мл 1 М NaOH добавляют к элюированному раствору радиойодированного промежуточного продукта. Смесь нагревают при 50°С в течение 2 часов. После гашения 500 мкл 1 М уксусной кислоты реакционную смесь разводят 40 мл воды и нагружают на С8 Plus SepPak. Радиойодированный продукт, имеющий радиоактивность приблизительно 3 мКи, элюируют с SepPak 2 мл метанола. Раствор конденсируют с использованием тока азота до 300 мкл и неочищенный продукт очищают с помощью ВЭЖХ на колонке Phenomenex ODS (буфер MeCN/TEA, 35:65, рН 7,5, при скорости потока 0,5 мл/минуту в течение до 4 минут, 1,0 мл/минуту в течение 4-6 минут и 2,0 мл/минуту более 6 минут, время удерживания 23,6). Собранные фракции нагружают на С8 Plus SepPak. Элюция с помощью 1 мл этанола дает приблизительно 1 мКи конечного радиойодированного продукта.

Пример 9: Синтез производных 2-(4'-аминофенил)-бензотиазола

Способ 1: Пример синтеза 6-МеО-ВТА-0, -1, -2, который является представителем группы тиофлавиновых соединений (см. статью Shi и соавт. "Противоопухолевые бензотиазолы. 3. Синтез 2-(4-аминофенил)бензотиазолов и оценка их активностей в отношении клеточных линий рака молочной железы in vitro и in vivo" ("Antitumor Benzothiazoles. 3. Synthesis of 2-(4-Aminophenyl)benzothiazoles and Evaluation of Their Activities against Breast Cancer Cell Lines in Vitro и in Vivo") J. Med. Chem., 39:3375-3384, 1996).

Получение 4-метокси-4'-нитробензанилида

п-Анизидин (1,0 г, 8,1 ммоль) растворяют в безводном пиридине (15 мл) и добавляют 4-нитробензоилхлорид (1,5 г, 8,1 ммоль). Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре на 16 час. Реакционную смесь выливают в воду и собирают осадок фильтрованием под вакуумом и промывают 5% бикарбонатом натрия (2×10 мл). Продукт используют на следующей стадии без дальнейшей очистки. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ДМСО-d⁶) δ: 10,46 (s, 1Н, NH), 8,37 (d, J=5,5 Гц, 2Н, Н-3',5'), 8,17 (d, J=6,3 Гц, 2Н, Н-2',6'), 7,48 (d, J=6,6 Гц, 2Н), 6,97 (d, J=6,5 Гц, 2Н), 3,75 (s, 3Н, МеО).

Получение 4-метокси-4'-нитротиобензанилида

Смесь 4-метокси-4'-нитробензанилида (1,0 г, 3,7 ммоль) и реагента Лауссона (0,89 г, 2,2 ммоль, 0,6 экв.) в хлорбензине (15 мл) нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 4 час. Растворитель выпаривают и осадок очищают на колонке для флеш-хроматографии (система гексан:этилацетат=4:1), получая 820 мг (77,4%) продукта в виде твердого вещества оранжевого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ДМСО-d₆) δ: 8,29 (d, 2Н, Н-3',5'), 8,00 (d, J=8,5 Гц, 2Н, Н-2',6'), 7,76 (d, 2H), 7,03 (d, J=8,4 Гц, 2H), 3,808,37 (d, J=5,5 Гц, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J=6,3 Гц, 2Н, H-2',6'), 7,48 (d, J=6,6 Гц, 2H), 6,97 (d, J=6,5 Гц, 2H), 3,75 (s, 3Н, МеО), (s, 3Н, МеО).

Получение 6-метокси-2-(4-нитрофенил)бензотиазола

4-Метокси-4'-нитротиобензанилид (0,5 г, 1,74 ммоль) смачивают небольшим количеством этанола (~ 0,5 мл) и добавляют 30% водный раствор гидроксида натрия (556 мг, 13,9 ммоль, 8 экв.). Смесь разводят водой для получения конечного раствора/суспензии 10% водного гидроксида натрия. Аликвоты данной смеси добавляют с интервалами 1 мин в перемешиваемый раствор феррицианида калия (2,29 г, 6,9 ммоль, 4 экв.) в воде (5 мл) при 80-90°С. Реакционную смесь дополнительно нагревают в течение 0,5 час, а затем позволяют ей охладиться. Твердое вещество собирают фильтрацией под вакуумом, промывают водой и очищают на колонке для флеш-хроматографии (система гексан:этилацетат=4:1), получая 130 мг(26%) продукта. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ацетон-d₆) δ: 8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J=8,5 Гц, 1Н, Н-4), 7,69 (s, 1Н, Н-7), 7,22 (d, J=9,0 Гц, 1Н, Н-5), 3,90 (s, 3Н, МеО).

Получение 6-метокси-2-(4-аминофенил)бензотиазола

Смесь 6-метокси-2-(4-нитрофенил)бензотиазола (22 мг, 0,077 ммоль) и хлорида олова(II) (132 мг, 0,45 ммоль) в кипящем этаноле перемешивают под азотом в течение 4 час. Этанол выпаривают и остаток растворяют в этилацетате (10 мл), промывают 1 Н гидроксидом натрия (2 мл) и водой (5 мл) и сушат над МgSO₄. При выпаривании растворителя получают 19 мг (97%) продукта в виде твердого вещества желтого цвета.

Получение 6-метокси-2-(4-метиламинофенил)бензотиазола и 6-метокси-2-(4-диметиламинофенил)бензотиазола

Смесь 6-метокси-2-(4-аминофенил)бензотиазола (15 мг, 0,059 ммоль), Mel (8,3 мг, 0,060 ммоль) и К₂СО₃ (100 мг, 0,72 ммоль) в ДМСО (безводный, 0,5 мл) нагревают при 100°С в течение 16 час. Реакционную смесь очищают ТСХ с обращенной фазой (МеОН:Н₂О=7:1), получая 2,0 мг (13,3%) 6-метокси-2-(4-метиламинофенил)бензотиазола и 6 мг (40%) 6-метокси-2-(4-диметиламинофенил)бензотиазола. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии 6-метокси-2-(4-метиламинофенил)бензотиазола (300 МГц, ацетон-d₆) δ: 7,85 (d, J=8,7 Гц, 2Н, Н-2'6'), 7,75 (dd, J=8,8 Гц, J=1,3 Гц, 1Н, Н-4), 7,49 (d, J=2,4 Гц, 1 Н, Н-7), 7,01 (dd, J=8,8Гц, J=2,4 Гц, Н-5), 6,78 (d, J=7,6 Гц, 2Н, Н-3'5'), 3,84 (s, 3Н, МеО), 2,91 (s, 3H, NMe). Данные ¹H ЯМР-спектроскопии 6-метокси-2-(4-диметиламинофенил)бензотиазола (300 МГц, ацетон-d₆) δ: 7,85 (d, J=8,7 Гц, 2Н, Н-2'6'), 7,75 (dd, J=8,8 Гц, J=1,3 Гц, 1Н, Н-4), 7,49 (d, J=2,4 Гц, 1Н, Н-7), 7,01 (dd, J=8,8 Гц, J=2,4 Гц, Н-5), 6,78 (d, J=7,6 Гц, 2Н, Н-3'5'), 3,84 (s, 3Н, МеО), 3,01 (s, 6H, NMe₂).

Следуя той же стратегии, как описано выше, можно синтезировать другие производные 2-(4'-аминофенил)-бензотиазола путем замещения соответствующего замещенного анилинового производного (например, 2-, 3-или 4-метиланилина) и соответствующего производного 4-нитро-бензоилхлорида (например, 2- или 3-метил-4-нитро-бензоилхлорид).

Пример 10: Синтез производных ВТА (бензотиазолов) без замещения (по схеме 2)

Пример синтеза соединений ВТА-0, -1, -2, которые являются представителями группы тиофлавиновых соединений (см. статью Garmaise и соавт. Антигельминтные четвертичные соли. III. Соли бензотиазолия ("Anthelmintic Quaternary Salts. III. Benzothiazolium Salts"), J. Med. Chem., 12:30-36, 1969) (референс-номера названий соединений ниже относятся к представленной схеме синтеза):

Получение 2-(4-нитрофенил)бензотиазола

Раствор 4-нитробензоилхлорида (1,49 г, 8,0 ммоль) в бензоле (безводный, 10 мл) добавляют по каплям к 2-аминотиофенолу (1,0 г, 8,0 ммоль в 10 мл бензола) при комнатной температуре. Реакционную смесь оставляют для перемешивания на 16 час. Реакцию гасят водой (20 мл). Водный слой отделяют и экстрагируют этилацетатом (3×10 мл). Объединенные органические слои сушат и выпаривают. Неочищенный продукт очищают на колонке для флеш-хроматографии (система гексан:этилацетат=85:15), получая 1,5 г (73,2%) продукта в виде твердого вещества желтого цвета.

Получение 2-(4-аминофенил)бензотиазола

Смесь 2-(4-нитрофенил)бензотиазола (105 мг, 0,40 ммоль) и хлорида олова(II) (205 мг, 0,91 ммоль) в этаноле (20 мл) нагревают с обратным холодильником под N₂ в течение 4 час. Затем удаляют этанол выпариванием под вакуумом. Остаток растворяют в этилацетате (20 мл) и промывают раствором NaOH (1N, 3×20 мл) и водой (3×20 мл), сушат и выпаривают досуха, получая 102 мг (97%) продукта.

Получение 2-(4-метиламинофенил) бензотиазола и 2-(4-диметиламинофенил)бензотиазола

Смесь 2-(4-аминофенил)бензотиазола (15 мг, 0,066 ммоль), Mel (9,4 мг, 0,066 мг) и К₂СО₃ (135 мг, 0,81 ммоль) в ДМСО (безводный 0,5 мл) нагревают при 100°С в течение 16 час. Реакционную смесь очищают ТСХ с обращенной фазой (система МеОН:Н₂О=6:1), получая 1,5 мг (10%) 2-(4метиламинофенил)бензотиазола и 2,5 мг (16,7%) 2-(4-диметиламинофенил)бензотиазола.

Получение 2-(4-диметиламинофенил)бензотиазола

Смесь 2-аминотиофенола (0,5 г, 4,0 ммоль), 4-диметиламинобензойной кислоты 22 (0,66 г, 4,0 ммоль) и РРА (10 г) нагревают при 220°С в течение часа. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают в 10% раствор карбоната калия (~ 400 мл). Остаток собирают фильтрацией под вакуумом, получая 964 мг продукта 23, который имеет чистоту приблизительно 90% по данным ¹H ЯМР-спектроскопии. При перекристаллизации 100 мг в МеОН получают 80 мг очищенного продукта. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ацетон-d₆) δ: 7,12 (d, J=7,7 Гц, 1Н, Н-7), 7,01 (d, J=9,0 Гц, 1Н, Н-4), 6,98 (d, J=9,1 Гц, 2Н, Н-2',6'), 6,56 (t, J=7,8 Гц, J=7,3 Гц, 1Н, Н-5 или Н-6), 5,92 (d, J=8,9 Гц, 1Н, Н-3',5'), 2,50 (s, 6H, NMe₂).

Следуя той же стратегии, что описана выше, другие производные 2-(4'-аминофенил)бензотиазола могут быть синтезированы замещением соответствующего производного 4-нитро-бензоилхлорида (например, 2- или 3-метил-4-нитро-бензоилхлорида) или соответствующего производного 4-диметиламино-бензойной кислоты (например, 2- или 3-метил-4-диметиламинобензойной кислоты).

Пример 11. Синтез йодированных соединений

Схема 3: Пример синтеза 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-гидроксибензотиазола, который является репрезентативным соединением для синтеза других йодированных соединений (референс-номера названий соединений ниже относятся к представленной схеме синтеза).

Получение 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-метоксибензотиазола

В раствор 2-(4'-аминофенил)-6-метокси бензотиазола (22 мг, 0,09 ммоль) в ледяной уксусной кислоте (2,0 мл) вводят 1 М раствор йодохлорида в CH₂Cl₂ (0,10 мл, 0,10 ммоль, 1,2 экв.) в атмосфере N₂. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Ледяную уксусную кислоту удаляют при пониженном давлении и остаток растворяют в CH₂Cl₂. После нейтрализации раствора с помощью NаНСО₃ водный слой отделяют и экстрагируют СН₂Сl₂. Органические слои объединяют и сушат над МgSO₄. После выпаривания растворителя остаток очищают с помощью препаративной ТСХ (Гексаны:этилацетат=6:1), получая 2-(4'-амино-3'-йодфенил)-6-метокси бензотиазол (25 мг, 76%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, CDCl₃ δ (ppm): 8,35 (d, J=2,0 Гц, 1H), 7,87 (dd, J₂=2,0 Гц, J₂=9,0 Гц, 1Н), 7,31 (d, J=2,2 Гц, 1H), 7,04 (dd, J₁=2,2 Гц, J₂=9,0 Гц, 1H), 6,76 (d, J=9,0 Гц, 1H), 3,87 (s, 3H).

Получение 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-гидроксибензотиазола

В раствор 2-(4'-амино-3'-йодфенил)-6-метоксибензотиазола (8,0 мг, 0,02 ммоль) в CH₂Cl₂ (2,0 мл) впрыскивают 1 М раствор ВВr₃ в CH₂Cl₂ (0,20 мл, 0,20 ммоль) в атмосфере N₂. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 часов. После гашения реакции водой смесь нейтрализуют NаНСО₃. Водный слой экстрагируют этилацетатом (3×3 мл). Органические слои объединяют и сушат над MgSO₄. Затем растворитель выпаривают при пониженном давлении и остаток очищают с помощью препаративной ТСХ (Гексаны:этилацетат=7:3), получая 2-(3'-йод-4'-аминофенил)-6-гидроксибензотиазол (4,5 мг, 58%) в виде твердого вещества коричневого цвета. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (300 МГц, ацетон-d₆) δ (ppm): 8,69 (s, 1H), 8, 34 (d, J=2,0 Гц, 1Н), 7,77 (dd, J₁=2,0 Гц, J₂=8,4 Гц, 1H), 7,76 (d, J=8,8 Гц, 1H), 7,40 (d, J=2,4 Гц, 1H), 7,02 (dd, J₁=2,5 Гц, J₂=8, 8 Гц, 1H), 6,94 (d, J=8,5 Гц, 1H), 5,47 (br, 2H). HRMS (масс-спектрометрия высокого разрешения) m/z 367,9483 (М+ рассчитано для C₁₃H₉N₂OSI 367,9480).

Биологические примеры

Пример 1: Определение аффинности к Аβ и поглощение тиофлавиновых производных головным мозгом

Исследования исходного связывания при использовании синтетического Аβ (1-40) проводят для определения, связываются ли четыре ниже представленных соединения существенным образом с центрами отложении амилоида в головном мозге.

Таблица Структуры Ki (нМ) logP 2 мин (% ID*/r) 30 мин (% ID/r) соотнош. 2:30 мин 8,32 3,17 9,08 3,4 2,7 4,94 3,90 4,40 2,68 1,6 11,1 1,65 5,64 0,36 15,7 3,22 2,35 7,76 2,66 2,91 * ID - инъецированная доза

Данные, представленные в Таблице 1, показывают, что эти соединения проявляют относительно высокую аффинность в отношении Аβ при значениях Ki<10 нМ и легко проходят в мышиный головной мозг при значениях поглощения >0,4% ID/г*кг (или >13% ID/г для животных массой 30 г). Более того, через 30 минут значения концентрации радиоактивности в головном мозге составляют меньше чем 0,1% ID/г*кг, приводя в результате к соотношениям концентраций 2 мин - до - 30 мин >4.

Пример 2: Окрашивание отложений амилоида в посмертном образце головного мозга, пораженного AD и Тg

Посмертно полученные срезы тканголовного мозга, пораженного AD, и трансгенных (Тg) мышей в возрасте 8 месяцев PS1/APP [объяснение того, что обычно демонстрирует данная модель] окрашивают немеченым ВТА-1. Модель на мышах PS1/APP сочетает две мутации человеческих генов, которые, как известно, вызывают болезнь Альцгеймера у двойных трансгенных мышей, у которых фибриллы Аβ откладываются в амилоидных бляшках в головном мозге, начиная с такого раннего возраста, как 3 месяца. Типичные микрофотографии флуоресценции представляют на Фигуре 8, где хорошо видно окрашивание амилоидных бляшек ВТА-1 в полученной посмертно ткани головного мозга, пораженного AD и PS1/APP. Цереброваскулярный амилоид также ярко окрашивается (см. Фигуру 8, справа). Другой характерный нейропатологический признак головного мозга, пораженного AD, нейрофибриллярные клубочки (NFT), более слабо окрашиваются ВТА-1 в головном мозге, пораженном AD (см. Фигуру 8, слева). NFT не наблюдают в моделях отложения амилоида на трансгенных мышах.

Пример 3. Получение изотопов in vivo и детекция отложений амилоида у трансгенных мышей

Трем трансгенным мышам PS1/APP в возрасте 17 месяцев внутрибрюшинно инъецируют одну дозу 10 мг/кг ВТА-1 в растворе ДМСО, пропиленгликоля и PBS (забуференный фосфатом солевой раствор) рН 7,5 (об./об./об., 10/45/45). Через двадцать четыре часа используют мультифотонную флуоресцентную микроскопию для получения изображений высокого разрешения головного мозга живых мышей с помощью методики "черепного окна". Типичные изображения in vivo BTA-1 у живой мыши PS1/APP представляют на Фигуре 9, при этом бляшки и цереброваскулярный амилоид хорошо различимы. Исследования с помощью мультифотонной микроскопии демонстрируют специфичность in vivo BTA-1 в отношении Аβ у живых трансгенных мышей PS1/APP.

Пример 4. Специфичность соединений, соответствующих изобретению, в отношении бляшек Альцгеймера относительно клубочков Альцгеймера

Для того чтобы обратиться к относительному участию связывания [³Н] BTA-1 с отложениями Аβ и tau в лобном сером веществе головного мозга, пораженного AD, связывание [³Н] BTA-1 сравнивают на гомогенатах из энторинальной коры головного мозга (ЕС), лобного серого вещества и мозжечка из типичного головного мозга, пораженного AD, и контрольного головного мозга по Braak II. Данный контрольный головной мозг имеет обычные числа NFT в энторинальной коре головного мозга (см. Фиг.5А), но при отсутствии невритных или диффузных бляшек в любой области головного мозга (см. Фиг.11С). Числа NFT в ЕС Cntl 04 аналогичны числам, обнаруживаемым во многих случаях AD (см. Фиг.11В). Связывание [³H]BTA-1 в области ЕС, богатой NFT, данного головного мозга Cntl 04 не выше, чем связывание [³Н]BTA-1 в свободных от бляшек и NFT мозжечке и лобном сером веществе из данного головного мозга (см. Фигуру 11, Таблица). Аналогичное исследование тех же самых областей головного мозга в пораженном AD головном мозг по Braak (см. Фигуру 11, Таблица) показывает низкий уровень связывания в мозжечке и ЕС и уровни в 10 раз, где имеются обычные числа невритных бляшек (см. Фиг.11D). Обширная патология NFT в ЕС головного мозга CntI и AD, обусловленная низким уровнем связывания [³Н] BTA-1 в ЕС, предполагает, что либо связывание ВТА-1 с NFT, наблюдаемое при концентрациях 100 нМ ВТА-1, не происходит при 1,2 нМ, либо при низких наномолярных концентрациях общее абсолютное количество связывания [³Н]ВТА-1 с отложениями NFT невелико по сравнению с количеством [³H]ВТА-1, связанного с отложениями Aβ в бляшках и цереброваскулярном амилоиде лобного серого вещества при AD. Головной мозг, пораженный AD, демонстрирует диффузные отложения амилоидных бляшек в ЕС (см. Фиг.11В), которые, по-видимому, не дают существенного связывания [³Н]ВТА-1. Лобная кора головного мозга имеет обширные амилоидные бляшки, которые являются как компактными, так и диффузными и ассоциированы с высокими уровнями связывания [³H]BTA-1 (см. Фиг.11D и Таблицу).

Пример 5: Исследования проникновения соединений в головной мозг мыши in vivo

Эксперименты по оценке проникновения в головной мозг 2-(3'-¹²⁵I-йод-4'-амино-фенил)-бензотиазол-6-ола (Соединение А), 2-(3-[¹⁸F]-фтop-4-мeтилaминo-фeнил)-бeнзoтиaзoл-6-oлa (Соединение В) и 2-[4-(3-¹⁸F-фтор-пропиламино)-фенил]бензотиазол-6-ола (Соединение С) проводят на молодых мышах дикого типа, у которых отсутствуют в головном мозге отложения амилоида. Данное исследование отражает проникновение в головной мозг и выведение из нормальной ткани головного мозга. Необходимым критерием для хорошего агента для визуализации с помощью PET является быстрое выведение из областей головного мозга, которые не содержат целевой центр связывания. Измерение выведения неспецифического связывания представлено в виде соотношения величин на 2 минуты-30 минут (% ID-кг)/г.

Исследования проводят на самках мышей Swiss-Webster (массой 23-35 г) в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, принятых NIH (Национальный институт здравоохранения США) при одобрении местного Институционного комитета по уходу и использованию животных. Мышам делают инъекцию в боковую хвостовую вену 0,37-3,7 МВк (10-100 мкКи) Соединения А, Соединения В или Соединения С с высокой специфической активностью (~2,0/мкмоль), содержащихся в <0,10 мл раствора 95% физиологического раствора и 5% этанола. Мышей анестезируют и умерщвляют посредством удаления сердца после пункции сердца для получения образцов крови из сердца через 2 минуты или 30 минут после инъекции. Головной мозг мышей быстро удаляют и делят на фракции мозжечка и оставшейся части целого головного мозга (включая ствол головного мозга). Образцы головного мозга подсчитывают в счетчике γ-излучения и результаты подсчета корректируют по распаду со временем инъекции относительно стандартов ¹²⁵I или ¹⁸F, полученных из инъекционного раствора, для определения процента инъецированной дозы (% ID) в образцах. Образцы головного мозга взвешивают, чтобы определить процент инъецированной дозы/грамм ткани (% ID/г), и данное количество умножают на массу целого тела (в кг) для определения нормализованной концентрации радиоактивности относительно массы тела [(% ID - кг)/г] каждого образца ткани. Соединение А, Соединение В и Соединение С проявляют относительно высокий уровень проникновения в головной мозг в ранние моменты времени и быстрое выведение в более поздние моменты времени. Концентрации радиоактивности (% ID - кг/г) на 2 минуты и 30 минут и соотношения 2 минуты - 30 минут представлены в Таблице 2.

Таблица 2   Конц. радиоактивности в момент 2 мин (% ID - кг/г) Конц. радиоактивности в момент 30 мин (% ID - кг/г) Соотношение 2 мин/30 мин Соединение А 0,141 0,009 16 Соединение В 0,29 0,030 10 Соединение С 0,17 0,011 16

Пример 7: Исследования визуализации на павианах in vivo

Исследования визуализации с помощью PET на взрослых павианах (Papio anubis) (массой 15-35 кг, возраст 6-12 лет) проводят с Соединением В и Соединением С в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, принятых NIH (Национальный институт здравоохранения США) при одобрении местного Институционного комитета по уходу и использованию животных. Перед визуализацией PET животным сначала дают седативный препарат кетамин (10-15 мг/кг, внутримышечно), вводят атропин (0,5 мг, внутримышечно) для контроля слюноотделения и сердечного ритма и интубируют. Павианов далее поддерживают на вентиляционном режиме с анестезией изофлуораном (0,5-1,25%) и медицинском воздухе. Бромид панкурония вводят при необходимости (внутривенно, до 0,06 мг/кг/час, титруют до получения эффекта), чтобы поддерживать животных иммобилизованными во время исследования. Вводят катетер в бедренную артерию для мониторирования кровяного давления и отбора образцов артериальной крови и помещают внутривенный катетер в локтевую вену для инъекции радиоактивной метки и для введения жидкостей при необходимости на протяжении исследования визуализации. Кровяное давление, сердечный и дыхательный ритмы и выдыхаемый СО₂ и уровни насыщения кислородом мониторируют постоянно во время исследований с помощью PET. Базовую ректальную температуру тела (~37°С) поддерживают при использовании одеяла с подогревом (Gaymar, Orchard Park, NY) и регулятора температуры (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH). Перед сканированием голову павиана фиксируют, чтобы плоскости изображения получались приблизительно параллельными линии глазного канала.

Данные PET получают при использовании сканнера ЕСАТ HR+PET (CTI PET Systems, Knoxville, TN) в трехмерном варианте изображения (63 параллельных среза; 15,2 см аксиально полю зрения; полная ширина 4,1 мм при полумаксимальном разрешении в плоскости). Используют Neuro-Insert (устройство для введения в нервную ткань) (CTI PET Systems) для уменьшения роли событий, связанных с рассеянными фотонами. После того как павианов помещают в сканнер PET, получают результат сканирования трансмиссии окна (10-15 минут) для ослабляющей коррекции данных по эмиссии PET при использовании вращения стержней ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga. Соединение В и соединение С вводят внутривенно в течение 20 секунд и получают динамическую серию результатов сканирования PET в течение 90 минут при использовании 26 кадров увеличивающейся длины (6×20 секунд; 4×30 секунд; 6×60 секунд; 4×5 минут; 6×10 минут). Павиану инъецируют приблизительно 185 МБк (~5 мКи) соединения В или соединения С с высокоспецифической активностью (>14,8 ГБк/мкмоль). В других исследованиях инъецируют 148-296 МБк (4-8 мКи) референс-радиоактивной метки для PET (>18,5 ГБк/мкмоль), включая либо [¹¹C](+)-McN5652, [карбонил-¹¹С]WАY100635, либо [¹⁸F]алтансерин. Данные PET реконструируют при использовании фильтра Manning (Nyquist cut-off) и корректируют с учетом распада, ослабления фотонов и рассеяния.

Результаты сканирования MRI получают для каждого павиана, используя сканнер 1.5Т GE Signa (GE Medical Systems, Milwaukee, WI), оборудованный стандартной головной спиралью. Волюметрический нарушенный градиент, вызывающий последовательность (SPGR) MR с параметрами для получения высокой контрастности в сером веществе, белом веществе и спинно-мозговой жидкости, получают в венечной плоскости (ТЕ=5, TR=24, перевернутый угол=40°, толщина срезов=1,5 mm, NEX=2, поле зрения 12 см, размер элемента изображения (воксел)=0,94×1,25×1,5 мм). Изображение MR для каждого отдельного павиана регистрируют совместно с данными PET, используя автоматизированный алгоритм регистрации изображений (AIR) для последовательности перекрестных изображений и повтора слоев. Исходные 16 кадров (0-9 минут после инъекции) динамических изображений PET

суммируют вместе в изображения, составляющие один кадр. Перед совместной регистрацией, оба изображения, MR и суммированное PET, редактируют с использованием программного пакета ANALYZE (Mayo Clinic, Rochester, ММ) для удаления экстрацеребральных тканей, которые, возможно, могли бы помешать процессу совместной регистрации. Отредактированные изображения MR затем совместно регистрируют с суммированным изображением PET и делают повторные срезы для получения изображений MR в той же пространственной ориентации и с тем же разрешением, что суммированные изображения PET. Показано, что совместная регистрация наборов данных MR и PET у павиана представляет собой надежное и трудоемкое применение способа AIR.

На совместно зарегистрированном изображении MR определяют области, представляющие интерес (ROIs), и применяют их относительно наборов данных динамических PET с целью определения региональных данных по зависимости время-активность для белого вещества (церебрального белого вещества, находящегося позади предлобной коры головного мозга и впереди боковых желудочков), височной коры головного мозга, мозжечка (коры мозжечка) и других областей головного мозга (данные не приведены). Данные зависимости время-активность, полученные с помощью PET, превращают в единицы микрокюри/миллилитр при использовании фантомного калибровочного фактора и впоследствии нормализуют относительно веденной дозы и массы тела животного ((% ID-кг)/г).

На Фигуре 15 представлена репрезентативная кривая зависимости время-активность для PET (TAC) радиоактивности трех областей головного мозга павиана после внутривенной инъекции Соединения В. TAC показывают отличное проникновение в головной мозг радиоактивности в ранние моменты времени (приблизительно 0,40% ID-кг/г, находящееся в приемлемом соответствии с проникновением в головной мозг Соединения В у мышей в момент времени: 2 минуты после инъекции) во всех трех областях и относительно быстрое выведение региональной радиоактивности от 0 до 90 минут после инъекции в головном мозге данного контрольного павиана. Области головного мозга, содержащие более высокие уровни белого вещества, демонстрируют несколько более высокие (~30%) концентрации радиоактивности в момент времени: 90 минут, чем участки, в которых преобладает серое вещество, такие как височная кора. Концентрация радиоактивности в коре головного мозга павиана почти идентична концентрации в коре мозжечка во все моменты времени. Скорость выведения радиоактивности из головного мозга павиана значительно ниже, чем из головного мозга мыши, причем соединение В демонстрирует период полувыведения из серого вещества головного мозга павиана приблизительно 17 минут. Несущее радиоактивную метку соединение В дает соотношение ранней к поздней концентрации радиоактивности в головном мозге павиана приблизительно 4, показывая, что только приблизительно 25% пика максимума радиоактивности остается в головном мозге в более поздние моменты времени. Данные результаты согласуются с ожидаемым отсутствием амилоидных бляшек в головном мозге данных контрольных животных и показывает, что в нормальном головном мозге павиана сохраняется очень низкая радиоактивность. Сравнение поведения in vivo соединения В в головном мозге павиана с поведением при входе и выведении других эффективных радиолигандов для PET в референс-области головного мозга, свободной от центров специфического связывания (т.е. мозжечке), оказывается полезным.

На Фигуре 16 приведено сравнение ТАС мозжечка у павианов [карбонил-¹¹С]WАY100635, [¹¹C](+)-McN5652, [¹⁸F]алтансерина и соединения В. Относительно высокие скорости выведения неспецифического связывания [карбонил-¹¹С]WАY100635 и [¹⁸F]алтансерина важны для успешного применения данных радиолигандов для PET для визуализации рецепторных систем серотонин 5-НТ_1A и серотонин 6-НТ_2A. Напротив, относительно медленное выведение in vivo [¹¹C](+)-McN5652 ограничивает применение данного радиолиганда для визуализации системы транспортеров серотонина. Характеристики выведения из головного мозга Соединения В показывают, что относительно высокая скорость неспецифического выведения данной радиометки (t_1/2=17 минут) близка скорости других эффективных агентов для визуализации нейрорецепторов с помощью PET.

На Фигуре 17 представляют репрезентативный ТАС PET радиоактивности в трех областях головного мозга павиана после внутривенной инъекции Соединения С. ТАС показывают отличное проникновение в головной мозг радиоактивности в ранние моменты времени (приблизительно 0,22% ID-кг/г, что хорошо согласуется с проникновением в головной мозг Соединения С у мышей в момент времени 2 минуты после инъекции) во всех областях и относительно быстрое выведение региональной радиоактивности в минуты 0-90 после инъекции в головном мозге данного контрольного павиана. Области головного мозга, имеющие более высокие уровни белого вещества, демонстрируют немного более высокие (<10%) концентрации радиоактивности в 90 минут, чем области, в которых преобладает серое вещество, такие как височная кора. Концентрация радиоактивности в коре головного мозга павиана почти идентична концентрации в коре мозжечка во все моменты времени. Скорость выведения радиоактивности из головного мозга павиана значительно ниже, чем из головного мозга мыши, причем соединение С демонстрирует полупериод выведения приблизительно 10 минута из серого вещества головного мозга павиана. Несущее радиоактивную метку соединение С дает соотношение ранней к поздней концентрации радиоактивности в головном мозге павиана приблизительно 6, показывая, что только приблизительно 15% пика максимума радиоактивности остается в головном мозге в более поздние моменты времени. Данные результаты согласуются с ожидаемым отсутствием амилоидных бляшек в головном мозге данных контрольных животных и показывают, что в нормальном головном мозге павиана сохраняется очень низкая радиоактивность. Сравнение поведения in vivo соединения С в головном мозге павиана с поведением при входе и выведении других эффективных радиолигандов для PET в референс-области головного мозга, свободной от центров специфического связывания (т.е. мозжечке), оказывается полезным.

На Фигуре 18 приведено сравнение ТАС мозжечка у павианов [карбонил-¹¹С]WAY100635, [¹¹C](+)-McN5652, [¹⁸F]алтансерина и соединения С. Относительно высокие скорости выведения неспецифического связывания [карбонил-¹¹С]WАY100635 и [¹⁸F]алтансерина важны для успешного применения данных радиолигандов для PET для визуализации рецепторных систем серотонин 5-НТ_1A и серотонин 5-НТ_2A. Напротив, относительно медленное выведение in vivo [¹¹C](+)-McN5652 ограничивает применение данного радиолиганда для визуализации системы транспортеров серотонина. Характеристики выведения из головного мозга соединения С показывают, что относительно высокая скорость неспецифического выведения данной радиометки (t_1/2=10 минут) близка скорости других эффективных агентов для визуализации нейрорецепторов с помощью PET.

Все публикации, патенты и патентные заявки, представленные выше, включены в данном контексте в виде ссылки.

23Когда изобретение описано таким образом, специалистам в данной области будет очевидно, что оно может варьировать по многим направлениям, не выходя за рамки сущности и объема изобретения. Данные варианты включены в объем заявляемого изобретения.

Изобретение относится к производным бензотиазола общей формулы (I), в которой R¹ представляет собой -ОН; R² представляет собой радиоактивный фтор; R³ представляет собой водород и R⁴ представляет собой C₁-С₆ алкил; и к их фармацевтически приемлемым солям. Также изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей свойством связывать амилоид, для детекции отложений амилоида, содержащей в эффективном количестве производное бензотиазола формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель, и к способу детекции отложений амилоида у млекопитающего путем введения определяемого количества производного бензотиазола формулы (I), способного к специфическому связыванию с амилоидными отложениями, с последующей детекцией его связанного количества. Технический результат - производные бензотиазола для визуализации отложений амилоида у больных при жизни. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 18 ил., 2 табл.

1. Производные бензотиазола общей формулы (I)

в которой R¹ представляет собой -ОН;
R² представляет собой радиоактивный фтор;
R³ представляет собой водород, и
R⁴ представляет собой С₁-С₆ алкил,
или их фармацевтически приемлемые соли.

2. Производные по п.1, отличающиеся тем, что R² представляет собой ¹⁸F.

3. Производное по п.2, отличающееся тем, что имеет следующую формулу:

4. Фармацевтическая композиция, обладающая свойством связывать амилоид, для детекции отложений амилоида, содержащая производное бензотиазола, отличающаяся тем, что в качестве последнего она содержит эффективное количество соединения по пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Способ детекции отложений амилоида у млекопитающего путем введения производного бензотиазола, способного к специфическому связыванию с амилоидными отложениями, с последующей детекцией его связанного количества, отличающийся тем, что в качестве производного бензотиазола вводят соединение по пп.1-3 в определяемом количестве.