СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ САХАРНЫХ ЦЕПЕЙ С GlcNAc, СИНТЕЗИРОВАННЫХ GnT-V Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 C12Q1/48 

Область использования

[0001] Настоящее изобретение описывает способ определения сахарных цепей, синтезированных N-ацетилглюкозамин-трансферазой-V (далее - GnT-V), и, в частности, способ, используемый для точного определения сахарных цепей, характерных для метастатического рака.

Предшествующий уровень техники

[0002] В числе примеров гликозилтрансфераз для определения структуры N-связанного белка с разветвленной цепью можно назвать N-ацетилглюкозамин-трансферазу-III (GnT-lll), -IV (GnT-IV), -V (GnT-V), -VI (GnT-VI) и т.п. Как показано на Фиг.5, такие N-ацетилглюкозамин-трансферазы играют роль переноса и присоединения невосстанавливаемого конечного N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) к каждой из специфично разветвленных цепей. Присоединенные сахарные цепи участвуют в выполнении различных жизненно важных функций.

[0003] Например, GnT-III синтезирует делящийся пополам остаток GlcNAc на N-связанной сахарной цепи сложных или гибридных типов. Кандидат наук Двек и др. в Великобритании обнаружили, что прионовый белок BSE имеет меньше сахарных цепей, которые присоединяются GnT-III, чем обычный прионовый белок. Пониженная экспрессия гена GnT-III может увеличить количество связанных с болезнью прионовых белков. Также предполагается, что GnT-III имеет эффект подавления раковых метастазов меланомы, эффект подавления пролиферации вирусов гепатита Б, эффект подавления секреции белков, связанных с вирусом гепатита Б, и эффект увеличения активности IgG.

[0004] GnT-V синтезирует ветку GlcNAcβ1-6Manα1-6 Manβ1-4 на N-связанной сахарной цепи. Хотя количество разветвленных боковых цепей в N-связанной сахарной цепи обычно составляет от 3 до 4, это количество увеличится, так как орган становится раковым или так как активируются Т-лимфоциты. Увеличение количества боковых цепей приводит к увеличению количества поли-N-ацетиллактозамина, которое, как известно, вызвано раком. Известно, что раковый метастаз подавляется у мыши, у которой разрушен ген N-ацетилглюкозамин-трансферазы-V, и что активность GnT-V увеличивается при высокометастатическом раке.

Кроме того, отмечается, что GnT-V участвует не только в образовании ракового метастаза, но и в канцерогенезе, поскольку экспрессия GnT-V увеличивается на ранней стадии развития раковой опухоли в процессе канцерогенеза печени.

Раскрытие изобретения

[0005] Сахарная цепь, синтезированная GnT-V, наряду с N-ацетилглюкозаминовыми трансферазами, в частности, используется для изучения жизненного механизма и лечения болезни, поскольку она содержит основную информацию о жизни ракового метастаза. Соответственно, необходимо точно идентифицировать сахарную цепь, содержащую GlcNAc, синтезированную GnT-V.

[0006] Лектин - это белок, который определенным образом связывается с сахарной цепью, содержащейся в гликопротеине или гликолипидах на поверхности клеточной мембраны. Воздействие лектина следующее: когда лектин распознает сахарную цепь в гликопротеине и связывается с сахарной цепью, это вызывает гемагглютинацию в случае, когда клетка - это клетка крови, и агглютинацию клетки, когда клетка - это бактерия. Разработаны клинические диагностические средства, реагенты, лечебные средства и т.п., использующие определенный эффект распознавания и эффект агглютинации лектина.

[0007] Агглютинин зародыша пшеницы, агглютинин phaseolus vulgaris и т.п. известны как лектины, которые определенным образом распознают сахарные цепи, к которым присоединен N-ацетилглюкозамин (GlcNAc). Обычно считается, что лектины обладают способностью связываться с определенными сахарными цепями. Однако известные в настоящее время GlcNAc-специфические лектины не удовлетворяют вышеуказанной потребности в точной идентификации сахарных цепей, синтезированных GnT-V, поскольку известные в настоящее время GlcNAc-специфические лектины распознают не только сахарные цепи, синтезированные GnT-V, но и сахарные цепи, синтезированные GnT-III и GnT-VI. Поэтому точно идентифицировать сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, с использованием одного лектина в текущих обстоятельствах сложно.

[0008] Настоящее изобретение предлагает способы для надежного и очень точного определения, очистки и отделения сахарной цепи, содержащей GlcNAc, синтезированной GnT-V.

[0009] Авторы настоящего изобретения посвятили себя изучению описанной выше проблемы. В результате исследования они обнаружили, что имеются два типа GlcNAc-специфических лектинов: тип лектина, который распознает сахарную цепь, содержащую GlcNAc, синтезированную GnT-V, и тип лектина, который не распознает такую сахарную цепь, и комбинированное использование этих двух типов лектинов может решить вышеуказанную проблему. Т.е. способ определения сахарной цепи, содержащей GlcNAc, синтезированной GnT-V, в соответствии с настоящим изобретением характеризуется тем, что, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарной цепи, содержащей GlcNAc, синтезированной GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарной цепи, содержащей GlcNAc, синтезированной GnT-V, используются в сочетании. В способе определения, описанном в настоящем изобретении, важно использовать два типа различных GlcNAc-специфических лектинов. Эти лектины могут использоваться одновременно или они могут использоваться с временным рядом, другими словами - в двухступенчатой операции. В случае двухступенчатой операции любой один из лектинов может предшествовать.

[0010] В настоящем описании используемый термин «сахарная цепь» включает все свободные олигосахариды, сахарные цепи, меченные флуоресцином с Су3, аминопиридином и т.п., гликаминовыми кислотами, гликопептидами, гликопротеинами, протеогликанами, клетками и т.п., до тех пор, пока сахарные цепи являются N-связанными сахарными цепями. Гликопротеины включают их высокоманнозный тип, гибридный тип, сложный тип и т.п. Кроме того, полученная субстанция, частично разрушающая вышеуказанную сахарную цепь, может использоваться с одноразовым использованием, комбинированным использованием или последовательным использованием сиалидазы, галактозидазы, N-ацетилгексозаминидазы и фукозидазы.

[0011] Вышеуказанный GlcNAc-специфический лектин, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, предпочтительно имеет аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-I и/или GnT-II. Вышеуказанный GlcNAc-специфический лектин, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, - это, по крайней мере, один тип лектинов, выбранный из группы, состоящей, например, из GSL-II, DSA, EVA, ECA, LEA, PWM, STA, WGA, PVL, РНА и CEL-I, и вышеуказанный GlcNAc-специфический лектин, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, - это, по крайней мере, один лектин, выбранный из BLL и АВА.

[0012] Вышеуказанная сахарная цепь, содержащая GlcNAc, синтезированная GnT-V, - это, например, сахарная цепь, характерная для метастатического рака.

[0013] Изобретение далее предлагает способ очистки сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, используются в сочетании. Настоящее изобретение далее предлагает сахарные цепи, очищенные с использованием способа очистки сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V.

[0014] Изобретение далее предлагает способ фильтрации сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, используются в сочетании.

[0015] Изобретение далее предлагает набор реактивов для определения сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, причем набор реактивов содержит, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V.

[0016] Изобретение далее предлагает набор средств диагностики болезни, развившейся из-за сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, или болезни, для которой сахарная цепь играет роль маркера, причем набор средств диагностики включает набор реактивов для определения сахарных цепей, содержащий, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V.

[0017] Настоящее изобретение далее предлагает способ определения аффинитета GlcNAc-специфического лектина к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, с использованием сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, обнаруженных с помощью вышеуказанного способа. Способ используется для выбора лектинов, не имеющих аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, из так называемых GlcNAc-специфических лектинов.

[0018] Изобретение позволяет точно обнаружить, отфильтровать и очистить сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, с комбинированным использованием двух типов лектинов на основе четкого различия специфичности GlcNAc.

[0019] Вышеуказанные сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, также характерны для метастатического рака. Соответственно, изобретение позволяет легко и точно выполнить диагностику метастатических свойств рака и повышает точность результатов диагностики. Изобретение также может использоваться для определения воздействия и прогнозирования лечения рака.

Краткое описание чертежей

[0020] Фиг.1 - это схема процессов определения (I) и (II) в соответствии с представленным изобретением.

Фиг.2А - это структурная визуализация РА-олигосахарида, используемого для определения сахарных цепей в соответствии с методом, представленным в изобретении. Восстанавливающаяся концевая группа была пиридил-аминирована.

Фиг.2В - это структурная визуализация РА-олигосахарида (продолжение Фиг.2А), используемого для определения сахарных цепей в соответствии с методом, представленным в изобретении. Восстанавливающаяся концевая группа была пиридил-аминирована. Символы, используемые для обозначения моносахарид-пиранозного кольца, и символы для обозначения типа связи - α или β, показаны в рамке под схемой.

Фиг.3 - это гистограмма, на которой показаны константы связывания (K_a) (A) pNP-caxap и (В) РА-сахар для GSL-II (слева) и BLL (справа).

Фиг.4 - это гистограмма, на которой показаны константы связывания (K_a) (А) GSL-11 и (В) BLL с частично или полностью агалакто-N-связанными сахарными цепями. На схеме сахарные цепи расположены в порядке убывания константы связывания.

Фиг.5 - принципиальная схема, на которой показаны точки, в которых GlcNAc переносится различными N-ацетилглюкозаминовыми трансферазами.

Лучший вариант осуществления изобретения

[0021] Далее описывается вариант осуществления изобретения со ссылкой на прилагающиеся чертежи. Сахарная цепь, содержащая GlcNAc, синтезированная GnT-V, должна обнаруживаться с использованием способа определения сахарных цепей, описанного в изобретении, например, в следующей химической формуле:

где R' - это ОН или α-L-фукоза; каждый R₁, R₂, R₃, R₄ и R₆ - это независимая группа ОН или сахарная группа, например, GlcNAcβ1, Galβ1-3GlcNAcβ1, Galβ1-4GlcNAcβ1, Siaα2-3 Galβ1-3GlcNAcβ1, Siaα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1, Siaα2-6Galβ1-3GlcNAcβ1, Siaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1, или ее частичное повторение, сахарные цепи, присоединенные с фукозой, такие как Siaα2-6Galβ1-4GlcNAc β1-6Galβ1, Fucα1-2Galβ1 и т.п.; и R₅ - это группа ОН или сахарная группа, такая как Galβ1, Siaα2-3Galβ1, Siaα2-6Galβ1 в общем, сахарные цепи с повторяющейся лактоаминной структурой за пределами Gal, или сахарные цепи, частично присоединенные с α-L-фукозой, такие как Siaα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1. Кроме того, сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, также включают сахарную цепь, в которой α-L-фукоза присоединена к любой из гидроксильных групп в положении 2,3,4,6 на GlcNAc, переносимом посредством GnT-V.

[0022] Способ определения сахарных цепей, описанный в изобретении, требует комбинированного использования, по крайней мере, одного типа GlcNAc-специфических лектинов, имеющего аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, одного типа GlcNAc-специфических лектинов, не имеющего аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V.

[0023] Во-первых, GlcNAc-специфические лектины, имеющие аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, могут быть любого происхождения - животного, растительного, грибы, бактерии и вирусы, если GlcNAc-специфические лектины имеют специфический аффинитет. Кроме того, GlcNAc-специфические лектины могут быть вариантом полипептида, достаточно гомологичного природному лектину, имеющему отличную от природного лектина аминокислотную последовательность, вызванную удалением, добавлением или заменой, или это может быть искусственный полипептид, если GlcNAc-специфические лектины сохраняют описанные выше свойства.

[0024] В числе конкретных примеров лектинов природных ингредиентов можно назвать лектин Griffonia simplicifolia II (GSL-II), агглютинин Datura stramonium (DSA), агглютинин Erythrina variegate (EVA) и агглютинин Erythrina cristagalli (ECA), агглютинин Lycopersicon esculentum (LEA), лектин митогена фитолакки американской (PWM), агглютинин Solanum tuberosum (STA), агглютинин зародыша пшеницы (WGA), лектин Psathyrella velutina (PVL), агглютинин фасоли Phaseolus vulgaris (PHA) и лектин Cucumaria echinata (CEL-1).

[0025] Что касается аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, константа связывания (K_a) лектинов обычно составляет 1.0×10³ M^-1 или более, предпочтительно 1.0×10⁴ M^-1 или более, и особенно предпочтительно 1.0×10⁵ М^-1 или более.

[0026] Во-вторых, GlcNAc-специфические лектины, не имеющие аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, могут быть любого происхождения - животного, растительного, грибы, бактерии и вирусы. Кроме того, GlcNAc-специфические лектины могут быть вариантом полипептида, достаточно гомологичного природному лектину, имеющему отличную от природного лектина аминокислотную последовательность, вызванную удалением, добавлением или заменой, или это может быть искусственный полипептид, если GlcNAc-специфические лектины сохраняют описанные выше свойства.

[0027] Лектин получается, например, при выборе лектина, имеющего аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V и/или GnT-II из так называемых GlcNAc-специфических лектинов. В числе примеров лектинов естественного происхождения - лектин Boletopsis leucomelas (BLL) и агглютинин Agaricus bisporus (ABA).

[0028] Что касается отсутствия аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V, константа связывания (K_a) лектинов обычно составляет менее 1.0×10³ М^-1, предпочтительно менее 1.0×10² М^-1 и особенно предпочтительно менее 1.0×10¹ М^-1.

[0029] Способ определения сахарных цепей, описанный в настоящем изобретении, описывается далее со ссылкой на Фиг.1(I). Во-первых, изготавливается образец сахарной цепи, которая будет адсорбирована при использовании лектина, распознающего сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, и впоследствии адсорбированные сахарные цепи отфильтровываются вновь при использовании лектина, не распознающего сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V. Сахарная цепь, содержащая GlcNAc, синтезированная GnT-V, точно обнаруживается во второй неадсорбированной фракции.

[0030] В вышеуказанном способе определения сахарных цепей, показанном на Фиг.1(II), образец сахарной цепи может пройти через колонку, в которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарной цепи, содержащей GlcNAc, синтезированной GnT-V, а его неадсорбированная фракция может пройти через колонку, в которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет. В последнем случае неадсорбированная фракция в первой колонке переходит во вторую колонку, и сахарная цепь, содержащая GlcNAc, синтезированная GnT-V, точно обнаруживается из ее адсорбированной фракции.

[0031] Для операции обнаружения на различных этапах можно использовать лектиновую хроматографию. Лектиновая хроматография - это аффинная хроматография (хроматография по сродству), в которой используются свойства лектина, такие как его специфическая связь с сахарными цепями. При сочетании лектиновой хроматографии с жидкостной хроматографией высокого разрешения ожидается высокая эффективность. Обычно переносчиками выступают гелеобразные материалы, такие как агароза, декстран, целлюлоза, крахмал и полиакриламид. Что касается переносчиков, имеющиеся в продаже продукты можно использовать без особых ограничений, в числе примеров этого - Сефароза 4В и Сефароза 6В (производства GE Healthcare Bioscience). Кроме того, колонки, используемые для лектиновой хроматографии, включают колонку, в которой лектин иммобилизуется на микропланшет и наноячейку.

[0032] Концентрация иммобилизуемого лектина обычно составляет от 0,001 до 20 мг/мл, желательно от 0,01 до 10 мг/мл. В случае, когда агарозный гель используется в качестве переносчика, агарозный гель связывается с лектином после его активации CNBr. Лектин может иммобилизоваться в гель, в который введен активированный спейсер. К тому же, лектин может быть восстановлен с NaCNBH, после того как лектин иммобилизовался в гель, в который была введена формиловая группа. Кроме того, можно использовать имеющийся в продаже активированный гель, такой как NHS-Сефароза (производства GE Healthcare Bioscience).

[0033] После того как образец сахарной цепи пропущен через колонку, туда заливается буферный раствор с целью промывки и доведения до равновесного состояния. Примеры буферных растворов включают буферы с молярной концентрацией от 5 до 500 ммоль, предпочтительно от 10 до 100 ммоль, с уровнем рН от 4,0 до 10,0, предпочтительно от 6,0 до 9,0, с содержанием NaCl от 0 до 0,5 моль, предпочтительно от 0,1 до 0,2 моль, с содержанием CaCl₂, MgCl₂ или MnCl₂ от 0 до 10 ммоль, предпочтительно от 1,0 до 5 ммоль.

[0034] После промывки аффинной колонки сахарные цепи элюируются с использованием десорбента в нейтральном неденатурирующем буферном растворе, обеспечивающем эффективное элюирование сахарных цепей. Буферным раствором может быть тот же раствор, что описывался выше. В качестве десорбента можно использовать N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) или (GlcNAc)_n. Десорбентом является GlcNAc с предпочтительной концентрацией от 1 до 500 ммоль, особенно предпочтительно - от 10 до 200 ммоль.

[0035] В случае одновременного использования двух типов лектинов в качестве альтернативного способа определения сахарных цепей, описанного в изобретении, один из лектинов маркируется Су3 (зеленый), а другой лектин маркируется Су5 (красный). Проверка, какой цвет появится на чипе (микропанели) или какой цвет более глубокий, позволяет судить о степени злокачественности раковой опухоли.

[0036] Предпочтительнее использовать метод фронтальной аффинной хроматографии, измеряющий константу связывания между лектином и сахарной цепью. Метод фронтальной аффинной хроматографии основывается на следующем принципе: когда разбавленный раствор с флуоресцентно-окрашенными сахарными цепями при определенной концентрации пропускается через колонку, на которой иммобилизован лектин, если лектин не взаимодействует с сахарными цепями, сахарные цепи вытекут из колонки за короткий период времени, и, таким образом, незамедлительно наблюдается начальный этап элюирования; с другой стороны, если сахарная цепь имеет аффинитет к лектину, элюирование сахарной цепи будет замедлено.

[0037] Лектиновая колонка, которая будет использоваться для аппарата, подготавливается следующим образом:

1. Растворите очищенный лектин в 0,1-0,2 моль буферного раствора NaHCO₃ (рН 8,3-8,5);

2. Иммобилизуйте лектин на носителе, таком как NHS-активированная сефароза, посредством первичной аминогруппы в белке;

3. Суспендируйте лектин-сефарозу в 10 ммоль буферного раствора Tris-HCl (рН 7,4, TBS), содержащем 0,8% NaCl, и подготовьте смолу таким образом, чтобы концентрация иммобилизуемого лектина достигла 2-9 мг/мл;

4. Заполните лектин-иммобилизованной смолой миниатюрную колонку (ϕ 2 мм × 10 мм, 31,4 мкл);

5. Поместите внутрь капсулу с фильтрами за переднюю и заднюю часть капсулы; и

6. Защитите капсулу, заполненную двумя типами иммобилизованных смол, держателем, и подсоедините лектиновую колонку к системе FAC-1.

[0038] 300 мкл каждой из пиридил-аминированных сахарных цепей (РА-сахарных цепей) непрерывно заливаются в две лектиновые колонки с буферным раствором со скоростью потока 0,125 мл/мин. РА-сахарная цепь разбавляется до концентрации (2,5 нM), что существенно ниже константы связывания (K_d) лектина в буферном растворе для анализа (10 ммоль буферного раствора Tris-HCl (pH 7,4) с содержанием 0,8% NaCl). Элюирование РА-сахарной цепи из колонки обнаруживается при использовании флуоресцентного детектора (с длиной волны возбуждения/флуоресценции 310 нм / 380 нм).

[0039] Задержка (V-V₀) начального этапа элюирования (V) каждой сахарной цепи, взаимодействующей с лектином, рассчитывается из обнаруженных данных на основе начального этапа элюирования (V₀) сахарной цепи (РА-рамнозы), которая не взаимодействует с лектином, как контроль. В этом случае константа связывания (K_a) между сахарной цепью и лектином определяется из V-V₀ и B_t на основании стандартного уравнения фронтальной аффинной хроматографии.

[0040] Кроме вышеуказанного метода хроматографии, также можно использовать лектиновый чип, иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), метод агглютинации и систему BiaCore (товарный знак) для определения сахарной цепи известным специалистам методом.

[0041] Изобретение далее предлагает способ очистки сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, используются в сочетании.

[0042] В случае очистки гликопротеина с использованием лектиновой колонки подготавливается аффинная колонка, ковалентно-связывающая, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, с носителем колонки из агарозы и целлюлозы через функциональную группу, и образец сахарной цепи проводится через колонку. Если в образце сахарной цепи существует субстанция, взаимодействующая с GlcNAc-специфическим лектином, можно выполнить сырое отделение гликопротеина для очистки. Затем подготавливается аффинная колонка, ковалентно-связывающая, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, с носителем колонки из агарозы и целлюлозы через функциональную группу, и элюат пропускается через колонку, при этом сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, могут быть очищены.

[0043] В вышеуказанном способе очистки образец сахарной цепи можно пропускать через колонку, на которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарной цепи, содержащей GlcNAc, синтезированной GnT-V, и затем его неадсорбированная фракция может быть пропущена через колонку, в которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет.

[0044] Настоящее изобретение далее предлагает сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, полученные с использованием вышеуказанного способа очистки. Чистота сахарных цепей (т.е. соотношение сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, и сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных всеми GnTs) обычно составляет 70% или более, предпочтительно 80% или более, еще более предпочтительно 90% или более, и еще более предпочтительно 95% или более.

[0045] Изобретение далее предлагает способ фильтрации сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, используются в сочетании.

[0046] В вышеуказанном способе очистки образец сахарной цепи пропускается через колонку, на которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и затем его элюат пропускается через колонку, в которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета.

[0047] В вышеуказанном способе образец сахарной цепи сначала пропускается через колонку, на которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, не имеющий аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, и его элюат можно пропустить через колонку, в которой иммобилизуется, по крайней мере, один тип GlcNAc-специфических лектинов, имеющий аффинитет.

[0048] Диагностические средства

Изобретение далее предлагает набор диагностических средств для диагностики болезни, развившейся из сахарных цепей, при обнаружении сахарных цепей, синтезированных GnT-V трансферазой. В числе болезней, развившихся из сахарных цепей, синтезированных GnT-V, можно назвать, например, канцерогенез, раковый метастаз, инфильтрацию и злокачественную альтерацию. Конкретные примеры раковых заболеваний - рак предстательной железы, рак груди, рак желудка, рак тонкой кишки, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак поджелудочной железы, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак, рак матки, рак яичников, тиреоидный рак, саркома мягких тканей, саркома кости, меланома, глиобластома, астроцитома, гранулобластома, острая лимфома, лимфобластома, болезнь Ходжкина, не-ходжкинская болезнь (non-Hodgkin), острая миелоцитовая лейкемия, хронический лимфолейкоз и т.п. Изобретение имеет практическое применение для выявления рака слабо дифференцированного типа.

[0049] Способ использования диагностических средств описывается далее. Сначала у пациента берется раковая ткань или жидкость тела, такая как кровь, сыворотка крови, плазма крови, моча, слюна. Собранная раковая ткань разрушается обычным способом. Органический растворитель добавляется к каждому образцу для удаления липидов. Затем экстрагируется гликопротеин при солюбилизации мембранного белка и гликопротеина с использованием поверхностно-активного вещества. Например, хлороформ-метанол, гексан-изопропан и т.п. используются в качестве вышеуказанного органического растворителя. Например, октил-β-гликозид, октилтио-β-гликозид, n-октил-β-D-гликопиранозид, n-гептил-β-D-тиогликопиранозид, 3-[(3-хлорамидпропил)-диметиламмоний]-1-пропансульфонат, 3-[(3-хлорамидпропил)-диметиламмоний]-2-гидрокси-1-пропансульфонат, додециловый сульфат натрия, додециловый сульфат лития, холат натрия и т.п. используются в качестве вышеуказанных поверхностно-активных веществ.

[0050] Соответствующее количество ацетона или сульфата аммония можно добавить в вышеуказанный растворенный гликопротеин, так что гликопротеин в осадке можно восстановить после разделения центрифугированием. Экстракт, содержащий таким образом полученный гликопротеин, подвергается хроматографии на аффинной колонне, которая проводится в два этапа с использованием диагностических средств, описанных в изобретении. Определение сахарных цепей, содержащих GlcNAc, с использованием данного набора средств обозначает существование сахарной цепи, в которую GlcNAc переносится посредством GnT-V. Следовательно, весьма вероятно, что раковая ткань является метастатической.

[0051] Диагностические средства также позволяют делать диагностический прогноз лечения рака в качественном и количественном отношении. Кроме того, диагностические средства также применяются для поиска субстанции, подавляющей экспрессию гена, кодирующего GnT-V.

[0052] При привитии млекопитающего и т.п. гликопротеином, концентрированным и очищенным с использованием указанной выше хроматографии, получается антитело, распознающее сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V. Соответственно может быть получено моноклональное антитело. Использование антитела также позволяет с высокой чувствительностью обнаруживать метастатический рак, имеющийся в сыворотке крови и т.п. пациента. В результате антитело используется для диагностики ракового метастаза и т.п. Антитело также может использоваться иммуноглобулин - лекарственное средство для лечения рака.

[0053] Способ определения GlcNAc-специфических лектинов

Изобретение далее предлагает способ определения аффинитета лектина к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, с использованием сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V. Способ используется для выбора лектинов, не имеющих аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, из так называемых GlcNAc-специфических лектинов.

[0054] В частности, подготавливается тестовый лектин, о котором известно, что он GlcNAc-специфичен, но об этом не известны подробности. Подготавливается аффинная колонка, на которой гликопротеин иммобилизуется к носителю в качестве лиганда. Подтверждается, что гликопротеин имеет N-связанные сахарные цепи (такие как 107, 315, 411, 414, 108, 205, 318, 320, 316, 413) с ответвлением V, используемые в Примере 1, который будет описан далее, и сахарные цепи, синтезированные GnT-V. Вышеуказанный тестовый лектин пропускается через колонку, и адсорбированный компонент элюируется с использованием гаптенового сахара, такого как GlcNAc, в качестве десорбента.

[0055] Неадсорбированная фракция в хроматографии и элюированная фракция, демонстрирующая слабое взаимодействие с лигандом, - это лектины, не имеющие аффинитета к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V. С другой стороны, фракция, демонстрирующая сильное взаимодействие, оценивается как лектин, имеющий аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным посредством GnT-V.

[0056] Изобретение будет подробно описано далее со ссылкой на Пример. Однако изобретение не ограничивается следующим Примером.

[Пример 1]

[Подготовка олигосахаридов]

Galβ-р-нитрофенил (pNP), GalNAcβ-pNP, Manα-pNP, GlcNAcα-pNP, Fucα-pNP и Galβ1-4Glcβ-pNP были закуплены у Sigma Corporation (Сэн-Луи, штат Миссури, США), a Galα-pNP, GalNAcα-pNP, Manβ-pNP, Galβ1-4 GlcNAcβ-pNP, Galβ1-3 GalNAcα-pNP (Core1), Galβ1-3 (GlcNAc β1-6) GalNAcα-pNP- (Core2), GlcNAcβ1-3GalNAcα-pNP (Core3) и GlcNAcβ1-6GalNAca-pNP (Core6) были закуплены у Toronto Research Chemicals Inc. (Норс-Йорк, Канада), а Glc-α был закуплен у Galbiochem (Сан-Диего, штат Калифорния, США). Другие pNP гликозиды (Glcβ-pNP, GlcNAcβ-pNP и (GlcNAcβ1-4)_2-5α-pNP) были закуплены у Seikagaku Corporation.

[0057] Пиридиламинированные (РА-) олигосахариды, использованные в Примере, перечислены на Фиг.2А и 2В. N-связанные сахарные цепи с номерами от 001 до 014, 103, 105, 107, 108, 307, 313, 314, 323, 405, 410, от 418 до 420, и 503 были закуплены у Takara Bio Inc., а другие олигосахариды были закуплены у Seikagaku Corporation. Немаркированные олигосахариды 906 и 907 были приобретены у Seikagaku Corporation и пиридиламинированы с использованием GlycoTAG (товарный знак Takara Bio Inc.).

[0058] [Подготовка лектинов]

Лектины Griffonia simplicifolia II (GSL-II)-агароза были приобретены у Vector Laboratories (Барлингейм, штат Калифорния, США). Лектины Boletopsis leucomelas (BLL) были получены при очистке съедобного гриба Boletopsis leucomelas способом, описанным в "Апоптозная индукция лектином, изолированным из гриба Boletopsis leucomelas в ячейках U937", «Биология. Биотехнология. Биохимия» 66, 784-789.

[0059] [Подготовка лектиновой колонки]

Лектин BLL был растворен в 0,2 моль буферного раствора NaHCO₃ (рН 8,3), содержащего 0,5 моль NaCl, и связан с NHS-активированной сефарозой (GE Healthcare Bioscience, Уппсала, Швеция) в соответствии с руководством по эксплуатации производителя. Лектин-сефароза был суспендирован в 10 ммоль буферного раствора Tris-HCl (рН 7,4, TBS), содержащем 0,8% NaCl, и залит в миниатюрную колонку (ϕ 2 мм × 10 мм, 31,4 мкл). Подобным образом подготавливается лектиновая колонка GSL-II.

[0060] Фронтальная аффинная хроматография (ФАХ)

Фронтальная аффинная хроматография выполнялась с использованием системы автоматизированного анализа ФАХ (FAC-1, Shimadzu Corporation). В частности, лектиновая колонка подготовленная, как описано выше, вставлялась в нержавеющий держатель и подсоединялась к системе FAC-1.

[0061] Скорость потока и температура колонки поддерживались на уровне 0,125 мл/мин и 25°С соответственно. После доведения миниатюрной колонки до равновесного состояния вышеуказанным буферным раствором TBS избыточный объем (от 0,5 до 0,8 мл) pNP-сахарной цепи (5 мкмоль) и РА-сахарной цепи (2,5 или 5,0 нмоль) непрерывно заливался в колонку с использованием автоматизированной системы отбора проб.

[0062] Элюаты pNP-сахарной цепи и РА-сахарной цепи контролировались при измерении УФ (280 нм) и флуоресценции (с длиной возбуждающей волны 310 нм и длиной волны флуоресценции 380 нм). Элюат начального этапа (т.е. V-V₀) измерялся по отношению к стандартному олигосахариду (РА-лактозе). Кроме того, константа диссоциации (K_d) определялась из V-V₀ и B_t на основе стандартного уравнения ФАХ. Учтите, что константа связывания K_a определяется в соответствии с уравнением K_a=1/K_d.

[0063] [Анализ зависимости концентрации]

Анализ зависимости концентрации выполнялся для измерения эффективной концентрации лиганда B_t. GlcNAcα-pNP в первоначальной концентрации ([А]₀) заливался в колонку GSL-II, а Galβ1-3GalNAcα-pNP в первоначальной концентрации ([А]₀) заливался в колонку для BLL. Далее, V-V₀ (задержка поднятия фронта элюата) рассчитывалась в соответствии с методом, разработанным Арата ("Применение усиленной фронтальной аффинной хроматографии и современной процедуры обработки для изучения связующих свойств галектина Caenorhabditis elegans", журнал «Хроматография» А. 905, 337-43). Создавался график Хофсти ((V-V₀) против (V-V₀) [А]₀), и B_t и K_d соответственно определялись из угловых коэффициентов приближенной кривой.

[0064] [Уравнение лектиновой колонки с использованием pNP-олигосахаридов]

BLL-агароза и GSL-II агароза подготавливались в концентрациях 0,1 мг белка/мл геля и 3 мг белка/мл геля соответственно. Затем проводился анализ зависимости концентрации для оценки колонки.

[0065] Для GSL-II, GlcNAcα-pNP в различных концентрациях (от 2,5 до 70 мкмоль) готовились и заливались в колонку. В результате описанной выше фронтальной аффинной хроматографии, B_t и K_a соответственно определялись как 0,86 нмоль и 1,4×10⁵ моль^-1 (левая часть Фиг.3(А)).

[0066] Хотя производилась очистка BLL посредством GlcNAc-агарозы, не было видно значительного аффинитета к тестируемым pNP производным GlcNAc, то есть любому одному из GlcNAcα-pNP, GlcNAcβ-pNP и (GlcNAc β1-4)_2-5α-pNP (правая часть Фиг.3(А)). BLL продемонстрировал значительный аффинитет к Galβ1-3GalNAcα-pNP, и B_t и K_d соответственно определялись как 0,56 нмоль и 9,09×10⁴ моль^-1 (правая часть Фиг.3(А)).

[0067] [Уравнение лектинов с использованием pNP-производных]

GSL-II продемонстрировал наиболее сильный аффинитет к GlcNAcα-pNP среди протестированных pNP гликозидов, далее идут чито-олигосахариды, (GlcNAc β1-4)₂α-pNP, (GlcNAcβ1-4)₃α-pNP, (GlcNAcβ1-4)₄α-pNP и (GlcNAcβ1-4)₅α-pNP (левая часть Фиг.3(А)). Хотя GSL-II также продемонстрировал наиболее сильный аффинитет к GlcNAcβ-pNP, связывание было на уровне 1/7 α-аномера.

[0068] BLL не продемонстрировал видимого аффинитета к GlcNAcβ-pNP или чито-олигосахаридам (т.е. K_a<3,4×10³ М^-1). BLL продемонстрировал значительный аффинитет к Galβ1-3GalNAcα/β-pNP (Core1) (K_a=0,9×10⁵ М^-1).

[0069] [Уравнение лектинов с использованием РА-олигосахаридов]

Хотя GSL-II продемонстрировал значительный аффинитет к 105-108 и 203-205 среди агалакто-N-связанных сахарных цепей от 101 до 205, которые не содержали галактозы, она не продемонстрировала четкого аффинитета к 101-104, 201 или 202 (левая часть Фиг.3(В)). GSL-II продемонстрировал сильный аффинитет к 312, 315-320, 407-409, 411-416 среди N-связанных сахарных цепей 301-420 гибридного типа, к которым полностью или частично присоединялась галактоза.

[0070] Значения K_a, измеренные фронтальной аффинной хроматографией, были обработаны и представлены в виде гистограммы для прояснения структурных элементов, стандартно распознаваемых GSL-II (левая часть Фиг.3(В)). Из схемы видно, что GSL-II образует сильные связи с три- и тетраантеннарными сахарными цепями и не связывается с моноантеннарными или биантеннарными сахарными цепями или, даже если связывается, то образует с ними слабые связи.

[0071] BLL, напротив, распознал 101-106 и 201-204 с относительно высоким аффинитетом, но вообще не распознал 107, 108 и 205 среди агалакто-N-связанных сахарных цепей 101-205 (правая часть Фиг.3(В)). GSL-II, напротив, такой избирательностью не отличался. Сильный аффинитет наблюдался для 301-306, 309-312, 403, 404 и 407-409 среди N-связанных сахарных цепей 301-420 гибридного типа, к которым полностью или частично присоединена галактоза. Это также было почти полной противоположностью GSL-II.

[0072] Как видно из правой части Фиг.3(В), BLL демонстрирует наиболее сильный аффинитет к агалакто-биантеннарно N-связанным сахарным цепям 103 и 202. В то время как агалакто триантеннарные сахарные цепи 105 и 204 также являются хорошим лигандом, аффинитет по существу такой же, что и аффинитет к моноантеннарным сахарным цепям 101 и 201. Цепи с разветвлением V (GlcNAcβ1-6 Manα1-6Manβ, на правой части Фиг.3(В)) аффинитета к BLL не имеют. Изобретение не ограничивается описанным ниже. Однако, поскольку наличие разветвления V создает значительное изменение в N-связанной сахарной цепи гибридного типа, распознавание BLL может потребовать стерической конфигурации перед присоединением ветки V агалакто-биантеннарно N-связанной сахарной цепи.

[0073] То, что было описано выше, далее будет описано со ссылкой на «карту» разветвленной цепи, приведенную под гистограммой на Фиг.4. Карта создана при классификации разветвленных цепей GlcNAc, отдельные N-связанные сахарные цепи основаны на номенклатуре, применяющейся для человеческих GlcNAc трансфераз. Например, если участок в ветке V для определенной сахарной цепи заштрихован, это означает, что сахарная цепь имеет GlcNAc, синтезированный GnT-V энзимом.

[0074] На карте разветвленной цепи в Фиг.4 видно, что GSL-II правильно распознает N-связанные сахарные цепи 107, 315, 411, 414, 108, 205 и т.п., имеющие разветвление типа V, они имеют GlcNAc, перенесенную посредством GnT-V. Однако GSL-II также распознает N-связанные сахарные цепи 105, 106, 204, 408 и т.п., не имеющие такой разветвленной структуры сахарных цепей. Поэтому при использовании одного лектина, такого как GSL-II, который, как предполагается, обнаруживает сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, невозможно обнаружить или очистить сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V.

[0075] Хотя BLL не распознает N-связанные сахарные цепи 107, 315, 411 и т.п., содержащие сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V, он распознает N-связанные сахарные цепи 105, 106, 204, 408 и т.п., не имеющие сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V. Из двух результатов стало ясно, что комбинированное использование GSL-II и BLL обеспечивает точное обнаружение сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V. Все описанное выше кратко отображено в Таблице 1.

[Таблица 1]   Сахарные цепи, связывающиеся с BLL Сахарные цепи, не связывающиеся с BLL Сахарные цепи, связывающиеся с GSL-II Группа А Группа В 105 106 203 204 312 407 408 409 Сахарные цепи, не связывающиеся с GSL-II Группа С Группа D 101 102 103 104 201 202 304 305 306 310 311 403 404 308 406

Сахарные цепи с подчеркнутыми номерами сахарных цепей в Таблице 1 - это сахарные цепи, содержащие GlcNAc, синтезированные GnT-V. Группа В (группа сахарных цепей, которые связываются с GSL-II, но не связываются с BLL) содержит все такие сахарные цепи и не содержит никаких сахарных цепей, отличных от таких сахарных цепей.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается способа обнаружения сахарных цепей с GlcNAc, синтезированных GnT-V. Сущность изобретений включает способы определения, очистки и фильтрации сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где используется, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей GSL-II и PHA-L, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей BLL и АВА, и используются в комбинации в качестве среды для определения сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V или в сочетании для вступления в контакт с образцом сахарной цепи. Одним из группы изобретений также является набор, включающий два вида GlcNAc-специфических лектинов. Преимущество изобретения заключается в разработке точного метода определения сахарных цепей с GlcNAc, синтезированных GnT-V. 4 н.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

1. Способ определения сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где используется, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей GSL-II и PHA-L, и, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, не имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей BLL и АВА, и используются в комбинации в качестве среды для определения сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V.

2. Способ очистки сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей GSL-II и PHA-L, и, по крайней мере, один вид лектинов, не имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей BLL и АВА, и используются в сочетании для вступления в контакт с образцом сахарной цепи.

3. Способ фильтрации сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, где, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей GSL-II и PHA-L, и, по крайней мере, один вид лектинов, не имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей BLL и АВА, и используются в комбинации для вступления в контакт с образцом.

4. Набор реактивов для определения сахарных цепей, содержащих GlcNAc, синтезированных GnT-V, причем набор реактивов содержит, по крайней мере, один вид GlcNAc-специфических лектинов, имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей GSL-11 и PHA-L, и, по крайней мере, один вид лектинов, не имеющих аффинитет к сахарным цепям, содержащим GlcNAc, синтезированным GnT-V, которые выбираются из группы, включающей BLL и АВА.