ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2010 года по МПК C07K5/10 A61K38/08 A61P25/28 

Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть использовано для создания лекарственных препаратов с нейротропной активностью.

Известно, что нейрогипофизарный гормон вазопрессин обладает поведенческой активностью, являясь стимулятором памяти и обучаемости [1, 2]. Однако он обладает широким спектром биологической активности и в медицине используется прежде всего как гормональное средство, регулирующее кровяное давление, диурез.

Известны цистинсодержащие пептиды, являющиеся фрагментами С-концевой последовательности вазопрессина, стимулирующие обучаемость лабораторных животных в дозах, в 100-1000 раз превышающих дозы вазопрессина в аналогичных тестах, но лишенные его гормональных эффектов [3, 4].

Известны пептиды - С-концевые фрагменты вазопрессина, содержащие цистеин, более доступные синтетически [5, 6]. Наиболее активным стимулятором памяти и обучаемости из них является тетрапептид Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂, эффективные дозы которого сопоставимы с дозами вазопрессина.

Наряду с пептидами природной последовательности получены структурные аналоги С-конца вазопрессина. Так, замена цистеина или цистина на остаток серина привела к гексапептиду pGlu-Asn-Ser-Pro-Arg-Gly-NH₂, проявляющему активность в тестах по обучаемости лабораторных животных в дозах, в 100 раз превышающих дозы вазопрессина [7]. Однако синтез этих соединений сложен и многостадиен, так как с увеличением количества аминокислотных остатков увеличивается число стадий синтеза.

В два последних десятилетия были найдены несколько различных типов рецепторов вазопрессина и показано, что различные виды активности реализуются при связывании молекулы-лиганда с различными типами рецепторов [8, 9]. Очевидно, что более узкий спектр активности С-концевых аналогов по сравнению с природным гормоном связан с их большей избирательностью по отношению к рецепторам вазопрессина.

Задачей настоящего изобретения является создание лекарственных препаратов с нейротропной активностью.

Технический результат, который можно получить при осуществлении заявленного изобретения, состоит в получении новых соединений - аналогов С-концевой области вазопрессина, способных избирательно связываться с различными субтипами рецепторов вазопрессина и вследствие этого обладающих различными видами нейротропной активности (антидепрессантным действием, стимулирующим действием на процессы памяти, двигательной активностью), малотоксичных, пригодных для введения доступным интраназальным способом, которые могут быть использованы для создания ноотропных препаратов.

Указанный результат достигается за счет создания обладающего нейротропной активностью пептида общей формулы: Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, где X-Met -L-Met или DL-Met.

Для достижения поставленной цели проведены модификации С-концевого тетрапептида вазопрессина - замена Cys на оптические изомеры N-ацетилметионина - Ac-D-Met, Ac-L-Met и Ac-DL-Met. Замена Cys на стереоизомеры Ac-Met позволяет сохранить такие важные элементы структуры, как наличие нуклеофильного атома серы, а ацилирование α-аминогруппы метионина повышает энзиматическую устойчивость пептида. Теоретический конформационный анализ показал существенные различия стабильных конформаций полученных стереомеров, что приводит к высокой избирательности при связывании с различными субтипами рецепторов вазопрессина.

Синтез тетрапептида Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, где X-Met-L-Met или DL-Met проводят с использованием в реакциях пептидной конденсации дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) или диизопропилкарбодиимида (ДИПК) с добавлением оксибензотриазола (ОБТ). Дипептид Boc-Pro-Arg получают методом сукцинимидных эфиров, далее конденсируют его с амидом глицина, полученные трипептиды с Вос-защитой по аминогруппе деблокируют обработкой НС1 в этилацетате, при взаимодействии Pro-Arg-Gly-NH₂ и Na-ацетилированных стереомеров метионина в присутствии ДИПК и ОБТ получают стереозомеры пептидов общей формулы Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂.

В разработанных схемах синтеза защита гуанидиновой группы аргинина осуществляется протонированием, что позволяет получать соединения с минимальным количеством стадий синтеза за счет исключения стадий получения N^G-защищенных производных и отщепления защитных групп.

Способ синтеза пептида общей формулы Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, где X-Met-L-Met или DL-Met описан в примерах. Молекулярная масса синтезированных пептидов определена с использованием масс-спектрометрии. Масс-спектры FAB записаны на масс-спектрометре LCQ FLEET ("Thermo"). Однородность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинках "Сорбфил" (Россия), используя следующие смеси растворителей в качестве элюентов: н.бутанол-уксусная кислота-вода, 4:1:1 (А); хлороформ-метанол - 25% аммиак 60:45:15 (Б); хлороформ-метанол-25% аммиак-уксусная кислота 60:45:15:3 (В); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 10:10:3:6 (Г). Вещества обнаруживали на хроматограммах при помощи хлорбензидиновой пробы. Удельное вращение исследуемых соединений измеряли на спектрополяриметре J-20 "Jasco" (Япония).

Пример 1.

N^α-Трет.Бутилоксикарбонил"пролил-аргинин (Boc-Pro-Arg)

К раствору 2,15 г (10 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-пролина и 1,26 г (11 ммоль) N-оксисукцинимида в 12 мл свежеперегнанного диоксана добавляют при 7°С 2,16 г (10,5 ммоль) ДЦГК, интенсивно перемешивая реакционную массу. Перемешивание проводят 1 час при охлаждении, 3 часа при комнатной температуре. Образовавшийся осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 2-3 мл диоксана. Диоксановый раствор Вос-Pro-OSu прибавляют к раствору 1,22 г (7 ммоль) аргинина в 7 мл воды. Реакционную смесь перемешивают при 20°С в течение 4 ч, после окончания реакции охлаждают до 5°С, отфильтровывают осадок Boc-Pro-Arg, промывают его на фильтре водой, охлажденной до 3-5°С (2×2 мл), а затем этилацетатом (3×3 мл), сушат в вакуум-эксикаторе до постоянной массы. Выход Boc-Pro-Arg 1,85 г (71%).

Т.пл. 154-155°С [α]_D ²⁰-49°С (с 1, метанол), R_f 0,38 (А), 0,71 (Б).

Пример 2.

N^α-Трет.бутилоксикарбонил-пролил-аргинил-глициламида гидрохлорид(Boc-Pro-Arg-Gly-NH₂·HCl)

Смесь 1,11 г (3,0 ммоль) Boc-Pro-Arg и 0,33 г (3,0 ммоль) хлоргидрата глициламида в 7 мл ДМФ (реагенты предварительно растирают в ступке до мелкого порошка) перемешивают 1 ч при 20°С, охлаждают до 0-5°С и прибавляют 0,45 г (3,3 ммоль) ОБТ, затем 0,68 г (3,3 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при (0-5°С) и 16 ч при 20°С. Осадок ДЦГМ отделяют фильтрованием, промывают 2 мл ДМФ. К объединенному диметилформамидному раствору прибавляют 25 мл эфира, после уплотнения осадка декантируют слой растворителей, осадок дважды переосаждают из метанола эфиром. При наличии примеси исходного глицинамида (контроль ТСХ) осадок растворяют в 3-4 мл смеси этилацетата и метанола 1:1 и к раствору прибавляют небольшими порциями этилацетат (3-5 мл) до образования осадка. Операцию повторяют, если переведенный в осадок трипептид содержит примесь глицинамида. Однородный по данным ТСХ осадок сушат в вакууме над P₂O₅.

Выход Boc-Pro-Arg-Gly-NH₂·HCl 1,28 г (92%). Т.пл. 85-87°С, [α]_d ²⁰- 51° (с 1, метанол), R_f 0,39 (В), 0,51 (Г).

Пример 3.

Пролил-аргинил-глициламида дигидрохлорид (V) (Pro-Arg-Gly-NH₂·2HCl)

Суспензию 0,93 г (2,0 ммоль) Boc-Pro-Arg-Gly-NH₂·HCl в 10 мл 4,8 н. раствора HCl в этилацетате перемешивают в течение 120 мин, контролируя полноту снятия Вос-группы ТСХ в системах (А) или (Г), затем упаривают в вакууме растворитель, к остатку прибавляют 5 мл сухого этилацетата и операцию упаривания повторяют. Остаток растворяют в 3 мл метанола, переводят в осадок добавлением 12 мл эфира. Осадок Pro-Arg-Gly-NH₂·2HCl-EA отделяют фильтрованием, промывают его этилацетатом, эфиром, сушат в вакууме над КОН. Получают 0,94 г (96%) Pro-Arg-Gly-NH₂·2HCl в виде сольвата с одной молекулой этилацетата.

[α]d²⁰- 38° (с 1, метанол), R_f 0,31 (В), 0,34 (Г).

Пример 4.

N-Ацетил-L-метионил-пролил-аргинил-глициламид (VI) (Ac-L-Met- Pro-Arg-GIy-NH₂)

К охлажденному до 3°С раствору 0,49 г (1,0 ммоль) Pro-Arg-Gly-NH₂·2HCl-EA в 3-х мл ДМФ прибавляют 0,135 мл (1,2 ммоль) N-метил-морфолина, через 10 мин - 0,23 г (1,2 ммоль) N-ацетил-D-метионина, 0,16 г (1,2 ммоль) ОБТ, 0,23 г (1,1 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают при 3-5°С в течение 1 ч и 3 ч при 20°С, затем отделяют фильтрованием осадок ДЦГМ, промывают его 0,5 мл ДМФ. К объединенному диметилформамидному раствору прибавляют 15 мл эфира, после уплотнения осадка декантируют надосадочную жидкость, осадок подсушивают в вакууме над Р₂О₅, переосаждают из хлороформа эфиром и из метанола этилацетатом. Осадок отделяют фильтрованием, сушат в вакууме над P₂O₅. Получают 0,42 г (83%) N-Ac-L-Met- Pro-Arg-Gly-NH₂.

При наличии примесей исходных соединений по данным ТСХ, навеску пептида растворяют в минимальном количестве метанола и наносят на колонку с силикагелем L 40/100, набухшем в элюенте хлороформ-метанол-вода 10:10:1. Проводят элюирование с использованием указанной смеси растворителей и собирают фракции, содержащие чистый продукт (контроль ТСХ). Объединенные фракции упаривают, остаток переосаждают из метанола ацетоном. После сушки над P₂O₅ получают чистый тетрапептид в виде белого кристаллического порошка. Выход N-Ac-L-Met- Pro-Arg-Gly-NH₂ 0,215 г (43%).

Т.пл. 109-110°С, [α]_d ²⁰-57° (с 1, метанол),), R_f 0,64 (В), 0,42 (Г).

Пример 5.

N-Ацетил-DL-метионил-пролил-аргинил-глициламид (VI) (Ac-DL-Met- Pro-Arg-Gly-NH₂).

N-Ацетил-DL-метионил-пролил-аргинил-глициламид получают по методике, приведенной в примере 4 для L-изомера из 0,49 г (1,0 ммоль) Pro-Arg-Gly-NH₂·2HCl-EA и 0,23 г (1,2 ммоль) N-ацетил-D-метионина. Выход Ac-DL-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ 0,275 г (55%).

Т.пл. 109-110°С, [α]_d ²⁰-40° (с 1, метанол),), R_f 0,64 (В), 0,42 (Г).

Эксперименты по изучению влияния·пептидов на поведенческие реакции выполнены на самцах белых беспородных крыс массой 180±30 г. Исследуемые пептиды вводили интраназально в водном растворе в объме 1 мкл/10 г массы тела за 5 мин до тестирования при исследовании ориентировочно-исследовательского поведения, уровня тревожности и степени депрессивности и ежедневно после сеанса обучения при выработке условной реакции активного избегания. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Препараты вводили в следующих дозах - 0,01 мкг/кг, 0,1, 1,0 и 10,0 мкг/кг.

Ориентировочно-исследовательское поведение животных исследовали в тестах "открытое поле" ("бесстрессорная" и "стрессогенная" модификации) и "норковая камера", уровень тревожности - в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" и "светлая-темная камера", степень депрессивности - в тесте "принудительное плавание".

Выработку условий односторонней реакции активного избегания осуществляли в течение четырех последовательных дней.

Ac-L-Met-Pro-Arg-Gly-NI-b при интраназальном введении в дозах 1,0-10,0 мкг/кг не оказывал влияния на ориентировочно-исследовательское поведение и уровень тревожности животных. Однако данный тетрапептид обладал выраженным антидепрессантным действием. В тесте "принудительное плавание" его введение оказало влияние практически на все исследуемые показатели - зарегистрировано достоверное увеличение как продолжительности первого периода активного плавания, так и суммарного времени активного плавания, увеличение суммарного времени и средней продолжительности периода пассивного плавания; суммарное время иммобилизации и количество ее периодов снижалось.

Таким образом, замена аминокислотного остатка в тетрапептидном фрагменте молекулы вазопрессина на L-Met привела к потере влияния пептида на ориентировочно-исследовательское поведение и уровень тревожности животных. Однако высокий уровень антидепрессантного действия Ac-L-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ свидетельствует, по-видимому, о том, что пептид является избирательным агонистом V1bR рецепторов вазопрессина.

Тетрапептид с рацемическим остатком метионина Ac-DL-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ проявил спектр поведенческой активности, аналогичный D-изомеру (патент на изобретение №1623166 SU, 15,02.1994 «Нейропептиды, обладающие поведенческой активностью»), он стимулировал обучаемость животных в тесте условной реакции активного избегания, увеличивал двигательную активность и снижал эмоциональную реактивность. В этих тестах эффективные дозы были в 5-10 раз меньше по сравнению с D-изомером и на 2 порядка ниже, чем у вазопрессина.

Кроме того, он подобно L-изомеру обладал выраженным антидепрессантным действием, которое проявлялось в дозах 1-10 мкг/кг. Таким образом, Ac-DL-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ обнаружил свойства, присущие и D- и L-изомерам тетрапептида общей формулы Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, где X-Met - D-Met, L-Met или DL-Met.

Источники информации

1. Папсуевич О.С., Чипенс Г.И., Михайлова С.В. Нейрогипофизарные гормоны. - Рига: Зинатне. - 1986, 282 с.

2. Walter R., Van Ree J.M., de Wied D. Modification of conditioned benavior of rats by neurohypophysial hormones and analogues // Proc. Nat. Acad. Sci USA. - 1978. V.75, N 5. - P.2493-2496.

3. Burbach J.P.H., Leboille J.L.M. Proteolytic conversion of arginine vasopressin and oxytocin by brain synaptic membranes. Characterization of formed peptides and mechanisms of proteolysis // J. Biol. Chem. - 1983. - V.258, N 3. - P.1487-1489.

4. Valter M.P., De Wied D., Van Ree J.M. Vasopressin fragment, AVP(4-9), improves long-term and short-term memory in the hole board search task // Neuropeptides. - 1997. - V.31, N 5. - P.489-494.

5. Голубович В.П., Мартинович В.П., Усенко А.Б и др. //. Химико-фармац.журнал, 1888. - №6. - С.675-679.

6. Мартинович В.П., Слободчикова Л.К., Голубович В.П., Ахрем А.А., Титов С.А., Воскресенская О.Г. Синтез и исследование биологической активности С-концевых фрагментов вазопрессина - АВП_5-9 и pGlu--АВП_5-9 // Химико-фармац.журнал - 1989. - №9. - С.1054-1057.

7. Sato Т., Tanaka K., Teramoto Т et. Al. Effect of pretraining administration of NC-1900, a vasopressin fragment analog, on memory performance in non- or CO₂-amnesic mice Pharmacol. Biochem. Behav. - 2004. V.78. - P.309-317.

8. Lolait S.J., O'Carrol A.M. Brownstein M.J. Molekular biology of vasopressin receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1995 - V.771. P.273-292.

9. Burbach J.p.H., Schoots O., Hernando F. Biochemistry of vasopressin fragments. Prog /Brain res. 1998. - Vol.119. - P.127-136/.

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть использовано для создания лекарственных препаратов с нейротропной активностью. Технический результат, который можно получить при осуществлении заявленного изобретения, состоит в получении нового соединения - аналогов С-концевой области вазопрессина, способных избирательно связываться с различными субтипами рецепторов вазопрессина и вследствие этого обладающих различными видами нейротропной активности, малотоксичных и пригодных для введения доступным интраназальным способом. Указанный результат достигается за счет создания обладающей нейротропной активностью пептида общей формулы: Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂, где X-Met - L-Met или DL-Met.

Пептид, обладающий нейротропной активностью, общей формулы: Ac-X-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂,
где Х - Met-L-Met или DL-Met.