СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ BRCA1 5382insC И СНЕК2 1100delC Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для определения частот встречаемости мутаций в популяции при анализе масштабных выборок ДНК.

На сегодняшний день известно, что 5-10% случаев рака молочной железы (РМЖ) обусловлено наследственными мутациями в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, р53 и некоторых других. Согласно литературным данным, лидирующими по распространенности в России, а также в ряде других стран, мутациями, ассоциированными с высоким риском развития РМЖ, являются мутации BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC [Sokolenko A.P. et al. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia. Familial Cancer (2007) 6:281-286; Chekmariova E.V. et al. CHEK2 1100delC mutation is frequent among Russian breast cancer patients. Breast Cancer Res. Treat. (2006) 100:99-102; Gorski В. et al. Founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer. Am. J.Hum. Genet. (2000) 66:1963-1968]. В то же время, для достоверной оценки частот встречаемости мутаций в популяции необходим анализ масштабных популяционных выборок, включающих тысячи образцов ДНК.

Известен способ выявления мутаций/аллельных вариантов в геномной ДНК. Он заключается в проведении аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, по результатам которой судят о генотипе исследуемого образца. ДНК-матрицей в ПЦР служит индивидуальный образец геномной ДНК, т.е. образец геномной ДНК одного человека (Патент США 7018816, МКИ С12Р 19/34, опубл. 2006).

Недостатками этого способа при анализе масштабных выборок ДНК являются высокая стоимость исследования и значительные затраты времени на выполнение анализа. Таким образом, для анализа, например, 4000 образцов ДНК потребуется провести свыше 8000 реакций (или свыше 4000 в случае мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, в ходе которой возможно определение обоих аллельных вариантов в одной реакционной смеси).

Известен способ выявления мутаций в пулированной ДНК (WO 2005/075678; Патент США 7078168, МКИ С07Н 21/04 и C12Q 1/68, опубл. 2006). Он заключается в осуществлении следующих этапов: 1) выделение ДНК из биологического материала; 2) определение концентрации образцов ДНК; 3) приведение образцов к одинаковой концентрации; 4) формирование пулов ДНК из индивидуальных образцов; 5) анализ пулированной ДНК на наличие мутаций/аллельных вариантов. Матрицей в этом случае является пулированная ДНК, т.е. смесь нескольких индивидуальных образцов геномной ДНК.

Существенным недостатком данного способа является необходимость определения концентрации индивидуальных образцов ДНК и последующего приведения их к одинаковой концентрации, что требует больших затрат времени и труда. Кроме того, в этом способе не предусмотрено выявление интересующих нас мутаций.

Известен также способ определения мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC в геномной ДНК (прототип), описанный в Сибирском онкологическом журнале, 2009 г., приложение №2, стр.14.

В соответствии с этим способом, определяли концентрации индивидуальных образцов ДНК, приводили образцы к одной концентрации, объединяли индивидуальные образцы в пулы, а затем определяли наличие мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Индивидуальные образцы пулов, содержащих мутацию, подвергали дополнительному анализу.

Как видно из описания способа, его недостатком также является необходимость измерения концентрации каждого образца ДНК и приведение группы образцов, образующих пул, к одной концентрации, что значительно усложняет процесс.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, являлась разработка эффективного способа выявления обозначенных мутаций при значительном упрощении проведения процесса.

Данная задача решается способом выявления мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC в геномной ДНК, включающим следующие стадии: определение диапазона концентраций образцов ДНК в достоверной выборке из всех подлежащих анализу образцов, определение максимально возможного количества образцов ДНК в пуле, смешение образцов ДНК из индивидуальных образцов с разной концентрацией в пулы, определение наличия мутаций в пулах с помощью аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени и дополнительный анализ пулов, содержащих мутацию. Изобретение иллюстрируется следующими рисунками:

Фиг.1 - концентрация 1000 из 7920 образцов ДНК, выделенных фенол-хлороформным методом;

Фиг.2 - результат аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием праймера BRCA-W;

Фиг.3 - результат аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием праймера BRCA-M.

Каждый пул формируется путем смешения 20 индивидуальных образцов ДНК в равных объемах. Количество индивидуальных образцов ДНК, входящих в состав одного пула, ограничивается рядом условий. Во-первых, при проведении аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени ΔCt≥8, что позволяет включить в состав пула до 2⁸=256 образцов, при условии, что их концентрации одинаковы. Во-вторых, возможность дальнейшего разведения определяется диапазоном концентраций образцов ДНК, который позволяет получить используемый метод выделения ДНК из биологического материала. Так, в случае, описанном в примерах 1 и 2, ДНК была выделена экстракцией фенолом-хлороформом. Более 97% индивидуальных образцов ДНК (из 1000) имели концентрацию в интервале от 70 до 700 нг/мкл (Фиг.1), что, с учетом поправки на разность концентраций, сокращает максимальное количество образцов ДНК в одном пуле до 25. Таким образом, при формировании пулов ДНК из индивидуальных образцов различной концентрации количество образцов в одном пуле не должно превышать 25.

Далее проводится аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени, в которой матрицей служит пулированная ДНК. Таким образом, в одной реакционной смеси проводится анализ 20 образцов одновременно.

В случае обнаружения в пуле мутантного аллеля проводится анализ индивидуальных образцов ДНК (также с помощью аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени), входящих в состав данного пула, и выявляется носитель мутации.

При разработке системы детекции мутаций с помощью ПЦР в режиме реального времени была использована технология, описанная в [Li J. et al. Antiprimer quenching-based real-time PCR and its application to the analysis of clinical cancer samples. Clinical Chemistry (2006) 52:4 624-633]. К аллель-специфичным праймерам с 5'-конца в процессе синтеза добавляется уникальная нуклеотидная последовательность, содержащая флуоресцентый краситель. Также синтезируется нуклеотидная последовательность, комплементарная добавленной к аллель-специфичному праймеру и содержащая на 3'-конце темновой гаситель флуоресценции, так называемый «антипраймер». При нахождении в реакционной смеси антипраймер образует дуплекс с 5'-концевой областью аллель-специфичного праймера, и кванты света, испускаемые флуорофором после возбуждения, поглощаются темновым гасителем. В ходе первого цикла ПЦР происходит отжиг аллель-специфичного праймера на ДНК-матрицу и синтез комплементарной цепи, в результате чего флуорофор оказывается встроенным в ампликон. На втором и последующих циклах ПЦР синтезированный ампликон выполняет роль матрицы, с которой гибридизуется общий праймер и синтезируется комплементарная цепь. В ходе синтеза комплементарной цепи происходит пространственное разобщение флуорофора и гасителя, и в результате генерируется флуоресцентный сигнал, детектируемый прибором.

Предлагаемый способ выявления мутаций позволяет значительно упростить проведение процесса и эффективно выявлять указанные мутации. Данный способ может быть также использован для анализа других мутаций/полиморфизмов.

Изобретение иллюстрируют нижеприведенные примеры.

Пример 1.

Анализ 7920 образцов ДНК жителей г.Новосибирска на наличие мутации BRCA1 5382insC.

Проводится выделение ДНК из биологического материала (кровь). Спектрофотометрически определяется концентрация 1000 из 7920 образцов ДНК. Рассчитывается максимально возможное количество образцов ДНК, которое можно поместить в один пул. Расчет проводится на основании двух параметров. Первый параметр - это разница между кривой специфической амплификации (ДНК-матрица, не содержащая мутации, и праймер, ей комплементарный) и кривой неспецифической амплификации (ДНК-матрица, не содержащая мутации, и праймер, комплементарный ДНК с мутацией), т.е. ΔCt. В данном примере ΔCt≥8, что позволяет включить в состав пула до 2⁸=256 образцов, при условии, что их концентрации одинаковы. Второй параметр - это диапазон концентраций исследуемых образцов ДНК. В данном случае более 970 образцов ДНК (из 1000) имели концентрацию в интервале от 70 до 700 нг/мкл, т.е. минимальное и максимальное значение отличались в 10 раз, что привело к сокращению максимально возможного количества образцов ДНК в одном пуле в 10 раз - с 256 до 25. Формируется 396 пулов ДНК, каждый из которых содержит по 20 индивидуальных образцов. Проводится аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени с использованием в качестве матрицы пулов геномной ДНК (Фиг.2 и 3). Выявляется 20 пулов, содержащих мутантный аллель. Далее путем анализа индивидуальных образцов ДНК, входящих в состав этих пулов, подтверждается наличие 20 гетерозиготных носителей мутации BRCA1 5382insC. ПЦР в режиме реального времени осуществляется с помощью прибора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит: 5 мкл ДНК (пулированной или индивидуального образца); дискриминирующие флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды BRCA-W (400 нМ) или BRCA-M (400 нМ); общий праймер BRCA-com (400 нМ); «антипраймер» АР (800 нМ), несущий гаситель флуоресценции BHQ-1; дезоксинуклеозидтрифосфаты (0,32 мМ каждого); хлорид магния (3 мМ); сульфат аммония (16 мМ); Tris-HCl (67 мМ; рН=8,8); 1,25 единицы активности Taq ДНК-полимеразы. ПЦР осуществляется в следующих условиях: начальная денатурация - 3 мин при 95°С, далее 40 циклов: денатурация - 10 с при 95°С, гибридизация праймеров - 15 с при 61°С, элонгация цепей - 30 с при 72°С, регистрация флуоресценции - 15 с при 50°С. Структуры олигонуклеотидов: BRCA-W: 5'-FAM-AGTGCTATCCGAGGGAACAAAGCGAGCAAGAGAATCCTAG-3'; BRCA-M: 5'-FAM-CTATCCGAGGGAAAAAGCGAGCAAGAGAATCCTCA-3'; BRCA-com: 5'-TTATGTGGTTGGGATGGAAGAG-3'; АР: 5'-TTCCCTCGGATAGCACT-BHQ1-3', где FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, флуорофор; BHQ1 - Black Hole Quencher 1, гаситель флуоресценции.

Для анализа 7920 индивидуальных образцов ДНК на наличие мутации BRCA1 5382insC без применения пулирования необходимо провести свыше 16000 реакций (по 8000 с каждым аллель-специфичным праймером, учитывая постановку контролей в каждом эксперименте).

Использование пулированной ДНК в приведенном примере позволяет сократить количество реакций в 10 раз - до 1600 (приблизительно по 400 реакций с каждым аллель-специфичным праймером с использованием в качестве матрицы пулированной ДНК, затем по 400 реакций для анализа индивидуальных образцов).

Пример 2.

Анализ 7920 образцов ДНК на наличие мутации CHEK2 1100delC. Формируется 396 пулов ДНК, каждый из которых содержит по 20 индивидуальных образцов. Проводится аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени с использованием в качестве матрицы пулов геномной ДНК. Выявляется 32 пула, содержащих мутантный аллель. Далее путем анализа индивидуальных образцов ДНК, входящих в состав этих пулов, подтверждается наличие 32 гетерозиготных носителей мутации CHEK2 1100delC. ПЦР в режиме реального времени осуществляется с помощью прибора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит: 5 мкл ДНК (пулированной или индивидуального образца); дискриминирующие флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды CHEK-W (400 нМ) или CHEK-М (400 нМ); общий праймер CHEK-com (400 нМ); «антипраймер» АР (800 нМ), несущий гаситель флуоресценции BHQ-1; дезоксинуклеозидтрифосфаты (0,32 мМ каждого); хлорид магния (3 мМ); сульфат аммония (16 мМ); Tris-HCl (67 мМ; рН=8,8); 1,25 единицы активности Taq ДНК-полимеразы. ПЦР осуществляется в следующих условиях: начальная денатурация - 3 мин при 95°С, далее 40 циклов: денатурация - 10 с при 95°С, гибридизация праймеров - 15 с при 61°С, элонгация цепей - 20 с при 72°С, регистрация флуоресценции - 15 с при 50°С. Структуры олигонуклеотидов: CHEK-W: 5'-FAM-AGTGCTATCCGAGGGAATTGGAGTGCCCAAAATCAGT-3'; CHEK-М: 5'-FAM-AGTGCTATCCGAGGGAACTTGGAGTGCCCAAAATCATA-3'; CHEK-com: 5'-GAAACTGATCTAGCCTACGTGT-3'; АР: 5'-TTCCCTCGGATAGCACT-BHQ1-3', где FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, флуорофор; BHQ1 - Black Hole Quencher 1, гаситель флуоресценции.

Для анализа 7920 индивидуальных образцов ДНК на наличие мутации CHEK2 1100delC без применения пулирования необходимо провести свыше 16000 реакций (по 8000 с каждым аллель-специфичным праймером, учитывая постановку контролей в каждом эксперименте). Использование пулированной ДНК в приведенном примере позволяет сократить количество реакций в 8 раз - до 2000 (приблизительно по 400 реакций с каждым аллель-специфичным праймером с использованием в качестве матрицы пулированной ДНК, затем по 640 реакций для анализа индивидуальных образцов).

Таким образом, разработан эффективный способ выявления мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC, который позволяет значительно упростить процесс: сократить расходы (приблизительно в 8-10 раз) на проведение анализа масштабных выборок ДНК на наличие мутаций.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу выявления мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC в геномной ДНК. Предложенное изобретение может быть использовано для определения частот встречаемости мутаций в популяции при анализе масштабных выборок ДНК. Способ включает определение концентрации ДНК в исследуемых образцах. Определяют максимально возможное количество образцов в пуле. Смешивают образцы в пул и определяют наличие мутаций в пулах с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Проводят дополнительный анализ пулов, содержащих мутацию, путем определения диапазона концентраций образцов ДНК в достоверной выборке из всех подлежащих анализу образцов. После определения максимально возможного количества образцов в пуле составляют пул из индивидуальных образцов с разной концентрацией. Предложенное изобретение позволяет значительно снизить стоимость и продолжительность анализа масштабных выборок ДНК на наличие мутаций. 3 ил., 2 пр.

Способ выявления мутаций BRCA1 5382insC и CHEK2 1100delC в геномной ДНК, включающий стадии: определение концентрации ДНК в исследуемых образцах, определение максимально возможного количества образцов в пуле, смешивание образцов в пул, определение наличия мутаций в пулах с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и дополнительный анализ пулов, содержащих мутацию, отличающийся тем, что определяют диапазон концентраций образцов ДНК в достоверной выборке из всех подлежащих анализу образцов, и после определения максимально возможного количества образцов в пуле составляют пул из индивидуальных образцов с разной концентрацией.