МУТАНТНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ ИНДУЦИБЕЛЬНОГО ГЕНА НА ОСНОВЕ ЯДЕРНОГО РЕЦЕПТОРА Российский патент 2012 года по МПК C12N15/63 C12N15/12 C12N15/62 C07K14/47 C12N5/10 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Данное изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано при получении белков методом рекомбинантных ДНК. Предложена система модулирования экспрессии индуцибельного гена на основе ядерного рецептора, которая включает две кассеты экспрессии, где первая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий первый полипептид, который состоит из а) ДНК-связывающего домена, представленного доменом рецептора экдизона (EcR), GAL4 или LexA, и б) лигандсвязывающего домена (LBD) EcR, содержащего, по меньшей мере, мутацию в положении, соответствующем положению 132 в последовательности экдизонового рецептора Chotistoneura fumiferana (CfEcR), которая обеспечивает повышение чувствительности системы к диацилгидразиновым лигандам, а вторая кассета экспрессии содержит полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, который состоит из а) домена трансактивации, представленного доменом трансактивации EcR, VP16, кислотного активатора В42 или р65, и б) второго LBD, который является доменом ядерного рецептора, способным димеризоваться с первым мутантным LBD, предпочтительно лигандсвязывающего домена ретиноидного Х-рецептора. Применение настоящего изобретения обеспечивает возможность регулирования экспрессии рекомбинантных белков неприродными синтетическими лигандами и, соответственно, получение целевых продуктов в любых типах животных и растительных клеток-хозяев. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 14 табл., 10 пр.

1. Система модулирования экспрессии рекомбинантного гена, которая содержит:
а) первую кассету экспрессии рекомбинантного гена, способного к экспрессии в клетке-хозяине, содержащую полинуклеотид, кодирующий первый полипептид, который содержит:
i) ДНК-связывающий домен, распознающий элемент ответа, ассоциированный с геном, экспрессия которого должна быть модулирована, и выбранный из группы, включающей домен рецептора экдизона, ДНК-связывающий домен GAL4 и ДНК-связывающий домен LexA, и ii) первый лигандсвязывающий домен ядерного рецептора; и
б) вторую кассету экспрессии рекомбинантного гена, способного к экспрессии в клетке-хозяине, содержащую полинуклеотид, кодирующий второй полипептид, который содержит:
i) домен трансактивации, выбранный из группы, включающей домен трансактивации рецептора экдизона, домен трансактивации VP16, домен трансактивации кислотного активатора В42 и домен трансактивации р65,
и
ii) второй лигандсвязывающий домен ядерного рецептора,
при этом один из первого и второго лигандсвязывающих доменов ядерного рецептора является лигандсвязывающим доменом рецептора экдизона, содержащим мутацию, находящуюся в состоянии, эквивалентном или аналогичном, по меньшей мере, аминокислотному остатку 132 SEQ ID NO:1, которая обеспечивает повышение чувствительности указанного лигандсвязывающего домена к диацилгидразиновым лигандам, а другой из лигандсвязывающих доменов ядерного рецептора способен димеризоваться с лигандсвязывающим доменом рецептора экдизона, содержащим указанную мутацию.

2. Система модулирования экспрессии рекомбинантного гена по п.1, в которой мутация представляет собой L132M, L132N, L132V или L132E.

3. Изолированный полинуклеотид, входящий в систему модулирования экспрессии рекомбинантного гена по п.1 и кодирующий полипептид, который содержит лигандсвязывающий домен рецептора экдизона, содержащий мутацию в состоянии, эквивалентном или аналогичном, по меньшей мере, аминокислотному остатку 132 SEQ ID NO:1.

4. Изолированный полинуклеотид по п.3, в котором мутация SEQ ID NO:1 представляет собой L132M, L132N, L132V или L132E.

5. Вектор экспрессии, входящий в систему модулирования экспрессии рекомбинантного гена по п.1, содержащий изолированный полинуклеотид по п.4, функционально связанный с элементом, регулирующим транскрипцию.

6. Клетка-хозяин для регулируемой экспрессии рекомбинантного гена, включающая систему модулирования экспрессии по п.1.

7. Клетка-хозяин по п.6, включающая вектор экспрессии по п.5.

8. Система модулирования экспрессии рекомбинантного гена по п.1, в которой лигандсвязывающий домен рецептора экдизона дополнительно включает мутацию, находящуюся в состоянии, эквивалентном или аналогичном аминокислотному остатку 125 SEQ ID NO:1.

9. Система модулирования экспрессии рекомбинантного гена по п.8, в которой мутация в аминокислотном остатке 125 представляет собой М125Р, M125R, М125Е, M125L, М125С, M125W, M125G, M125I, M125N, М125S или М125V.

10. Изолированный полинуклеотид по п.3, в котором лигандсвязывающий домен рецептора экдизона дополнительно включает мутацию, находящуюся в состоянии, эквивалентном или аналогичном аминокислотному остатку 125 SEQ ID NO:1.

11. Изолированный полинуклеотид по п.10, в котором мутация в аминокислотном остатке 125 представляет собой М125Р, M125R, М125Е, M125L, М125С, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S или M125V.

12. Система модулирования экспрессии рекомбинантного гена по п.1, в которой другой лигандсвязывающий домен ядерного рецептора является лигандсвязывающим доменом ретиноидного Х-рецептора.