ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/058973, поданной 2 октября 2014 г., предварительной заявке на патент США №61/977751, поданной 10 апреля 2014 г., предварительной заявке на патент США №61/986479, поданной 30 апреля 2014 г., предварительной заявке на патент США №62/089730 поданной 9 декабря 2014 г., предварительной заявке на патент США №62/090845, поданной 11 декабря 2014 г., и предварительной заявке на патент США №62/088363, поданной 5 декабря 2014 г. Содержание указанных заявок полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПЕРЕЧЕНЬ ТАБЛИЦ ИЛИ КОМПЬЮТЕРНЫХ ПРОГРАММ
[002] Настоящая заявка подана совместно с перечнем последовательностей в электронной форме. Перечень последовательностей предоставлен в виде файла под названием SCRI-53WO_SEQUENCE_LISTING.TXT, созданного 7 апреля 2015 года, размер которого составляет 65 кбайт. Информация, представленная в электронной форме в перечне последовательностей, полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[003] Адоптивный перенос Т-лимфоцитов человека, которые модифицированы с помощью переноса генов для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), специфичных в отношении поверхностных молекул, экспрессируемых на опухолевых клетках, является перспективным подходом для эффективного лечения рака. Химерные рецепторы представляют собой синтетические рецепторы, которые содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, наиболее часто одноцепочечный вариабельный фрагмент моноклонального антитела (scFv), соединенный с внутриклеточными компонентами для передачи сигналов, наиболее часто с CD3ζ, по отдельности или в комбинации с одним или более ко-стимулирующими доменами. Большая часть исследований в области разработки химерных рецепторов была сосредоточена на определении scFv и других лигандсвязывающих элементов, которые нацелено воздействуют на злокачественные клетки, не вызывая серьезной токсичности жизненно важных нормальных тканей, а также на определении оптимального состава внутриклеточных сигнальных модулей для активации эффекторных функций Т-клеток.
[004] Несмотря на то, что результаты клинических исследований с применением адоптивной терапии на основе Т-клеток (CAR-T) (Т-клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор) свидетельствуют о мощной противоопухолевой активности, очевидно, что существует вероятность развития значительной токсичности, например, индуцированной приживлением гиперцитокинемии, синдромов лизиса опухоли и продолжающейся В-клеточной цитопении, каждое из указанных состояний относится к нерегулируемым функциональным эффектам конститутивно экспрессируемых CAR. Указанные виды токсичности могут в некоторых случаях ограничивать применимость CAR-T-клеточной адоптивной терапии. В клинических исследованиях с применением различных видов адоптивной иммунотерапии на основе Т-клеток, модифицированных трансгенами, изучали только Т-клетки, которые конститутивно экспрессируют трансген, или всегда находятся в состоянии «ON», что вносит значительный вклад в развитие нежелательных эффектов, связанных с трансгеном. Устранение путем инактивации CAR-Т-клеток, опосредованное геном, может ослабить указанные виды токсичности; однако недостаток этого подхода заключается в преждевременном ослаблении противоопухолевой активности и в значительной степени влияет на терапевтический потенциал.
[005] Имеющиеся в настоящее время технологии экспрессии трансгенов, регулируемой малыми молекулами, основаны на введении различных лекарственных средств, включая макролиды, экдизоны и аналоги рапамицина. Клиническая применимость перечисленных систем ограничена вследствие нецелевого токсического действия, неблагоприятного биораспределения и профилей фармакодинамики, ограниченного конечного динамического диапазона и/или ограниченного наличия в качестве коммерчески доступных фармацевтических средств, одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA). Помимо этого многие из указанных систем используют химерные регуляторы транскрипции, сконструированные из ксеногенных компонентов, что может являться причиной таких осложнений как иммуногенность при применении этих систем в составе лекарственных средств у человека.
[006] Существует потребность в выявлении способов определения элементов дизайна химерных рецепторов, имеющих большое значение для терапевтической активности и клеточных популяций, которые будут генетически модифицированы и адоптивно перенесены, которые обеспечат повышенную выживаемость и эффективность в условиях in vivo, сводя при этом к минимуму нежелательные побочные эффекты. Также существует потребность в системах экспрессии и способах модулирования клеток для применения в клеточной терапии, например, для модулирования экспрессии рекомбинантных антигенных рецепторов, таких как CAR, и/или других молекул, экспрессируемых указанными клетками, так, чтобы улучшить терапевтическую активность, повысить выживаемость и/или эффективность в условиях in vivo и/или свести к минимуму нежелательные побочные эффекты.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[007] Один из аспектов настоящего изобретения включает генетическую систему для обеспечения экспрессии трансгена, регулируемой лекарственным средством, в клетках. В другом варианте реализации настоящего изобретения регулируемая экспрессия трансгена нацелена на клетки, такие как лимфоциты, предназначенные для использования в адоптивной иммунотерапии. Указанная система обеспечивает повышенные показатели безопасности для стратегий адоптивной терапии, перенаправленной с помощью химерного антигенного рецептора (CAR), без ущерба для терапевтической эффективности, которая позволяет клиницисту контролировать в режиме реального времени экспрессию CAR в условиях in vivo. С помощью создания модифицированных векторов, которые обеспечивают транскрипционный контроль экспрессии CAR, восприимчивый к действию лекарственных средств, активность CAR и других клеточных медиаторов может быть переключена в состояние «ON» и «OFF» в условиях in vivo при введении назначенного клиницистом фармацевтического средства, который проявляет клинически допустимую фармакокинетику, распределение в тканях, а также распределение между внеклеточным пространством и цитозолем лимфоцитов. Генетическая система обеспечивает экспрессию трансгенов, регулируемую лекарственным средством, чтобы индуцировать функциональное состояние «OFF» в отсутствие лекарственного средства и функциональное состояние «ON» экспрессии трансгена в присутствии лекарственного средства.
[008] В одном варианте реализации лекарственное средство представляет собой тамоксифен. Тамоксифен является антагонистом эстрогена/частичным агонистом, который одобрен FDA и коммерчески доступен. Тамоксифен предназначен для приема внутрь и подходит для ежедневного введения в течение длительного периода времени. Тамоксифен имеет доказанные показатели безопасности, благоприятный фармакокинетический профиль, превосходное распределение в тканях и низкий коэффициент распределения между внеклеточным пространством и цитозолем. Другие лекарственные средства могут быть выбраны на основании показателей безопасности, благоприятного фармакокинетического профиля, превосходного распределения в тканях и низкого коэффициента распределения между внеклеточным пространством и цитозолем и/или низкой токсичности.
[009] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в системе применяется синтетический регулятор транскрипции, который, в присутствии тамоксифена, связывается с синтетическим промотором, распложенным в направлении 5'-конца относительно трансгена, чтобы индуцировать экспрессию. Фактор транскрипции, регулируемый тамоксифеном («TamR-tf», также обозначенный «НЕА-3»), представляет собой химерный фактор транскрипции, состоящий из субъединиц человека, включая N-концевой ДНК-связывающий домен ядерного фактора 1-альфа гепатоцитов (HNF-1α), гибридизованный в пределах одной открытой рамки считывания с мутированным тамоксифен-специфичным лигандсвязывающим доменом из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD), который, в свою очередь, гибридизован с доменом активации р65 NF-κВ (р65). Типичная аминокислотная последовательность представлена в таблице 10 и определена как SEQ ID NO: 40. Мутированный тамоксифен-специфичный лигандсвязывающий домен из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD) находится на участке с 282 по 595 остаток аминокислотной последовательности TamR-tf и содержит мутацию в положении 521. Домен активации р65 NF-κВ (р65) находится на участке с 596 по 862 остаток аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40. Другие изменения могут быть внесены в активатор транскрипции для улучшения свойств фактора транскрипции, включая, но не ограничиваясь перечисленными, изменения одной или более аминокислот в лигандсвязывающем домене рецептора эстрогена, чтобы увеличить аффинность фактора в отношении аналогов эстрогена, и изменение одной или более аминокислот в домене трансактивации р65.
[0010] В отсутствие тамоксифена TamR-tf исключается из ядра вследствие связывания цитозольного белка теплового шока 90 (HSP90) с активным сайтом связывания тамоксифена, и экспрессия трансгена находится в состоянии «OFF». Тамоксифен, присутствующий в наномолярных концентрациях в цитозоле, активно конкурирует с HSP90 за связывание с ER-LBD, что приводит к транслокации TamR-tf в ядро. После транслокации в ядро TamR-tf легко связывается со своим специфичным синтетическим промотором (например, 7×HBD/EF1αp). В присутствии тамоксифена связывание TamR-tf с промотором 7×HBD/EF1αp индуцирует состояние «ON» экспрессии трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный регулятор транскрипции может быть модифицирован, чтобы обеспечить различную степень контроля экспрессии трансгена. Аминокислотные замены в LBD TamR-tf обеспечивают селективную восприимчивость к тамоксифену и его метаболитам, причем 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) является наиболее фармакологически активным метаболитом в отношении активности TamR-tf и при этом не вступает во взаимодействия с эндогенным эстрогеном.
[0011] Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способам и композициям для обеспечения и/или усиления иммунных ответов, опосредованных клеточной иммунотерапией, например, путем адоптивного переноса подгрупп опухолеспецифичных, генетически модифицированных CD8+ или CD4+ Т-клеток по отдельности или в комбинации. В настоящем изобретении предложены нуклеиновые кислоты химерных рецепторов, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует химерный рецептор, соединяет несколько модульных компонентов, которые могут быть вырезаны и заменены другими компонентами, чтобы адаптировать химерный рецептор для эффективной активации Т-клеток и распознавания конкретной молекулы-мишени или эпитопа на молекуле-мишени, и обеспечивают регулируемую транскрипцию, описанную в настоящем документе.
[0012] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора содержит: первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, которая экспрессируются на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий транс мембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым.
[0013] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора содержит: первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, хемокин, полипептид, который регулирует апоптоз, и/или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно примерному варианту реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор под контролем конститутивного промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты.
[0014] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены композиции для обеспечения и/или усиления иммунных ответов, опосредованных клеточной иммунотерапией, например, путем адоптивного переноса подгруппы опухолеспецифичных, генетически модифицированных CD4+ Т-клеток, причем указанные CD4+ Т-клетки придают и/или усиливают способность CD8+ Т-клеток поддерживать противоопухолевую реактивность и увеличивают и/или максимально увеличивают опухолеспецифичную пролиферацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки генетически модифицированы для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор и/или полипептид химерного рецептора под контролем регулируемого промотора, описанного в настоящем документе.
[0015] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены композиции для обеспечения и/или усиления иммунных ответов, опосредованных клеточной иммунотерапией, например, путем адоптивного переноса подгруппы опухолеспецифичных, генетически модифицированных Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой CD8+ Т-клетки. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ Т-клетки экспрессируют нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный рецептор и/или полипептид химерного рецептора под контролем регулируемого промотора, описанного в настоящем документе.
[0016] Согласно некоторым вариантам реализации предложены способы осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство, путем введения субъекту препарата генетически модифицированных Т-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, и введения лекарственного средства, который индуцирует трансген в генетически модифицированных Т-лимфоцитах. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения препарат генетически модифицированных Т-лимфоцитов содержит клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения препарат генетически модифицированных Т-лимфоцитов содержит гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяции генетически модифицированных CD8+ и генетически модифицированных CD4+ клеток вводят совместно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки представляют собой аутогенные или аллогенные Т-клетки. Возможны различные модификации описанного выше способа. Например, химерные рецепторы, которые экспрессируются CD4+ Т-клеткой и CD8+ Т-клеткой, могут быть идентичными или различными.
[0017] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен является специфичным в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[0018] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован, полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным.
[0019] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен полипептид химерного рецептора, причем указанный полипептид химерного рецептора кодируется системой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[0020] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[0021] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
[0022] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция, причем указанная композиция содержит клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Fter2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и дополнительно содержит другую клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов или гемопоэтическую стволовую клетку.
[0023] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения клетки-хозяина в условиях in vitro, причем указанный способ включает: а) обеспечение системы, и b) введение системы в отдельную выделенную популяцию Т-лимфоцитов и размножение каждой популяции Т-лимфоцитов в условиях in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в случае если Т-лимфоциты размножают, способ дополнительно включает культивирование клеток в присутствии гранул, специфичных в отношении CD3 и/или CD28, и по меньшей мере одного гомеостатического цитокина до получения количества клеток, которое будет пригодно для применения в виде инфузии. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения лимфоцит представляет собой CD8+ или CD4+ клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
[0024] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение клетки-хозяина или композиции в комбинации с лекарственным средством, который индуцирует экспрессию трансгена в клетке-хозяине или композиции для лечения рака или вирусной инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой его связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральный памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и другую клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак выбран из солидной опухоли или гематологического злокачественного новообразования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака мозга, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов или гемопоэтическую стволовую клетку.
[0025] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего рак или вирусную инфекцию, причем указанный способ включает введение композиции или клетки-хозяина субъекту и введение лекарственного средства, который вызывает экспрессию трансгена в композиции или клетках-хозяевах. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и другую клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток или клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов или гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак выбран из солидной опухоли или гематологического злокачественного новообразования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака мозга, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция выделенных Т-лимфоцитов содержит клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-предшественники Т-лимфоцитов представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение лекарственного средства осуществляют после введения композиции или клеток-хозяев, причем введение осуществляют в течение 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 2 недель, 4 недель или двух месяцев, или в течение любого периода времени, который находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя перечисленными периодами времени.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0026] На фигуре 1А представлены данные по экспрессии ZsGreen и EGFRt, согласно результатам определения методом проточной цитометрии в клетках Jurkat, трансдуцированных двойной лентивирусной конструкцией, включая конструкции А и В, в присутствии или в отсутствие 4-гидрокситамоксифена (4-ОНТ). Результаты свидетельствуют об экспрессии EGFRt в присутствии или в отсутствие 4-ОНТ, это указывает на то, что клетки несут конструкцию А. Результаты также свидетельствуют о том, что клетки несут конструкцию В, поскольку экспрессия ZsGreen индуцируется в присутствии 4-ОНТ. На фигуре 1В представлена конструкция А, которая содержит конститутивный промотор EF1αp, соединенный с TamR-tf (НЕА-3), который, в свою очередь, соединен с EGFRt, и конструкция В, содержащая синтетический промотор 7×HBD/mE1b, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим ZsGreen.
[0027] На фигуре 2 представлены уровни экспрессии ZsGreen в трансдуцированных клетках Jurkat, которые были приведены в контакт с различными дозами 4-ОНТ, варьирующимися от 50 до 1000 нМ.
[0028] На фигуре 3 представлены кинетики активации и подавления экспрессии ZsGreen в трансдуцированных клетках Jurkat после однократной 48-часовой обработки 4-ОНТ с последующим вымыванием 
и в трансдуцированных клетках Jurkat после 24-часовой обработки 4-ОНТ с последующим вымыванием, с последующей повторной стимуляцией 4-ОНТ на 15-й день 
.
[0029] На фигуре 4A-D представлены уровни экспрессии ZsGreen в CD4 клетках центральной памяти, трансдуцированных двойными упакованными лентивирусными конструкциями А и В. Клетки разделяли на 3 группы, только 4-ОНТ (фигура 4А), 4-ОНТ в комбинации с обработкой гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28 (4В), или 4-ОНТ по отдельности в течение 48 ч с последующим добавлением гранул, специфичных в отношении CD3/CD28 (фигура 4С). Экспрессию ZsGreen контролировали в течение 96 часов. На фигуре 4D представлена конструкция, которая содержит конститутивный промотор EF1αp, соединенный с TamR-tf (НЕА-3), который, в свою очередь, соединен с EGFRt, и конструкция В, содержащая синтетический промотор 7×HBD/mE1b, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим ZsGreen.
[0030] На фигурах 5А-С представлены уровни экспрессии ZsGreen в CD8+ клетках центральной памяти, трансдуцированных двойными упакованными лентивирусными конструкциями А и В, как показано на фигуре 4. Клетки разделяли на 3 группы, 4-ОНТ по отдельности (фигура 5А), 4-ОНТ в комбинации с обработкой гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28 (фигуры 5В), или 4-ОНТ по отдельности в течение 48 часов, с последующим добавлением гранул, специфичных в отношении CD3/CD28 (фигура 5С). Экспрессию ZsGreen контролировали в течение 72 часов.
[0031] На фигуре 6А представлены уровни экспрессии EGFRt и Her2t в Т-клетках человека линии Jurkat, трансдуцированных конструкциями А и В, как показано на фигуре 6С. Экспрессию EGFRt и Her2t контролировали в присутствии или в отсутствие 4-ОНТ. Образцы окрашивали антителом к EGFRt-APC и герцептином-биотином, а затем SA-PE. На фигуре 6В представлены результаты исследования с помощью вестерн-блоттинга исходных клеток Jurkat и клеток, трансдуцированных CD19CAR, которые окрашивали антителом мыши к CD247, которое распознает внутриклеточную дзета-цепь CD3 на CD19 CAR (приблизительно 48 кДа), эндогенная дзета-цепь CD3 мигрирует при 23 кДа. Эндогенная дзета-цепь CD3 была обнаружена во всех клетках. Дзета-цепь CD3 из CD19 CAR была обнаружена только в трансдуцированных клетках Jurkat, подвергнутых обработке 4-ОНТ. На фигуре 6С представлена конструкция А, которая содержит конститутивный промотор EF1αp, соединенный с TamR-tf (НЕА-3), который, в свою очередь, соединен с EGFRt, и конструкция В, содержащая синтетический промотор 7×HBD/mElb, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим CD19CAR, который соединен с полинуклеотидом, кодирующим Her2t.
[0032] На фигуре 7А представлены уровни экспрессии EGFRt и Her2t в Т-клетках человека линии Jurkat, трансдуцированных лентивирусом, несущим TamR CD19CAR, включая дополнительный селективный маркер, DHFRdm, в присутствии или в отсутствие 4-ОНТ. Экспрессию EGFRt и Her2t контролировали в присутствии или в отсутствие 4-ОНТ. Образцы окрашивали антителом EGFRt-APC и герцептином-биотином, а затем SA-PE. На фигуре 7В представлены результаты исследования с помощью вестерн-блоттинга исходных клеток Jurkat и клеток, трансдуцированных CD19CAR, которые окрашивали антителом мыши к CD247, которое распознает внутриклеточную дзета-цепь CD3 на CD19 CAR (приблизительно 48 кДа), эндогенная дзета-цепь CD3 мигрирует при 23 кДа. Эндогенная дзета-цепь CD3 была обнаружена во всех клетках. Дзета-цепь CD 19 из CAR CD3 была обнаружена только в трансдуцированных клетках Jurkat, подвергнутых обработке 4-ОНТ. На фигуре 7С представлена конструкция А, которая содержит конститутивный промотор EF1αp, соединенный с TamR-tf (НЕА-3), который в свою очередь соединен с EGFRt, и конструкция В, содержащая синтетический промотор 7×HBD/mE1b, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим CD19CAR, связанным с полинуклеотидом, кодирующим Her2t, который связан с полинуклеотидом, кодирующим DHFRdm.
[0033] На фигуре 8А представлены уровни экспрессии EGFRt и Her2t в CD4 Т-клетках центральной памяти человека, трансдуцированных лентивирусом, несущим TamR CD19CAR, включая дополнительный селективный маркер, DHFRdm, в присутствии или в отсутствие 4-ОНТ и гранул, специфичных в отношении CD3/CD28. Экспрессию EGFRt и Her2t контролировали в присутствии или в отсутствие 4-ОНТ и в присутствии или в отсутствие гранул, специфичных в отношении CD3/CD28. Образцы окрашивали антителом EGFRt-APC и герцептином-биотином, а затем SA-PE. На фигуре 8В представлена конструкция А, которая содержит конститутивный промотор EF1αp, соединенный с TamR-tf (НЕА-3), который, в свою очередь, соединен с EGFRt, и конструкция В, содержащая синтетический промотор 7×HBD/mE1b, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим CD19CAR, который связан с полинуклеотидом, кодирующим Her2t, который соединен с полинуклеотидом, кодирующим DHFRdm.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
[0034] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.
[0035] В настоящей заявке термин «приблизительно» при ссылке на измеряемое значение включает отклонения на ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1% от заданного значения.
[0036] В настоящей заявке термин «антиген» или «Ag» относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ. Иммунный ответ может включать выработку антител или активацию специфичных иммунологически компетентных клеток, или оба процесса. Очевидно, что антиген может быть создан, синтезирован, получен рекомбинантным способом или получен из биологического образца. Подходящий биологический образец может включать, но не ограничивается ими, образец ткани, образец опухоли, клетку или биологическую жидкость, такую как, например, кровь, плазма крови или асцитная жидкость.
[0037] В настоящей заявке термин «противоопухолевый эффект» относится к биологическому эффекту, который может проявляться в уменьшении объема опухоли, уменьшении количества опухолевых клеток, уменьшении числа метастазов, увеличении средней продолжительности жизни или уменьшении различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. «Противоопухолевый эффект» также может проявляться снижением количества рецидивов или увеличением времени до рецидива.
[0038] В настоящей заявке термин «химерный рецептор» относится к рецептору, разработанному синтетическим способом, содержащему лигандсвязывающий домен антитела или другую белковую последовательность, которая связывается с молекулой, связанной с заболеванием или расстройством, и соединенному посредством спейсерного участка с одним или более внутриклеточными сигнальными доменами Т-клетки или другими рецепторами, такими как костимулирующий домен. Химерный рецептор также может упоминаться как искусственные рецепторы Т-клеток, химерные рецепторы Т-клеток, химерные иммунорецепторы и химерные антигенные рецепторы (CAR). Указанные CAR представляют собой модифицированные рецепторы, которые могут придавать относительную специфичность иммунной рецепторной клетке. Термин химерные антигенные рецепторы или «CAR», согласно мнению некоторых исследователей, содержит антитело или фрагмент антитела, спейсер, сигнальный домен и трансмембранный участок. Однако вследствие неожиданных эффектов, вызванных модификацией различных компонентов или доменов CAR, описанных в настоящем документе, таких как область связывания эпитопа (например, фрагмент антитела, scFv или его часть), спейсер, трансмембранный домен и/или сигнальный домен, компоненты CAR часто описаны в тексте настоящего документа как независимые элементы. Изменение различных элементов CAR может, например, привести к более высокой аффинности связывания в отношении специфичного эпитопа или антигена. В настоящей заявке термин «костимулирующий домен» относится к сигнальному фрагменту, передающему Т-клеткам сигнал, который, в дополнение к основному сигналу, который передается с участием, например, дзета-цепи CD3 комплекса TCR/CD3, вызывает Т-клеточный ответ, включая, но не ограничиваясь ими, процессы активации, пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов и т.п. Костимулирующий домен может содержать, но не ограничивается ими, полноразмерный или часть CD27, CD28, 4-1ВВ, ОХ40, CD30, CD40, ICOS, антигена, ассоциированного с функцией лимфоцитов 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 или лиганда, который специфично связывается с CD83. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения костимулирующий домен представляет собой внутриклеточный сигнальный домен, который взаимодействует с другими внутриклеточными посредниками, чтобы вызвать клеточный ответ, включая активацию, пролиферацию, дифференцировку, секрецию цитокинов и т.п. В настоящей заявке термин «кодирование» относится к свойству специфичных последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таких как ген, кДНК или мРНК, выполнять функцию матриц для синтеза других макромолекул, таких как определенная последовательность аминокислот. Следовательно, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей указанному гену, приводит к выработке белка в клетке или другой биологической системе. Термин «последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид» включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют аналогичную аминокислотную последовательность.
[0039] В настоящей заявке термины «условный» или «индуцируемый» относятся к конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит промотор, который обеспечивает экспрессию гена в присутствии индуктора и по существу не вызывает экспрессии гена в отсутствие индуктора.
[0040] В настоящей заявке термин «конститутивный» относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей промотор, который конститутивно обеспечивает экспрессию полипептида, который непрерывно вырабатывается.
[0041] Термины «специфичный» или «специфичность» могут относиться к характеристике лиганда в отношении партнера по связыванию или, в другом варианте, партнера по связыванию для лиганда, и могут включать комплементарную форму, заряд и гидрофобную специфичность связывания. Специфичность связывания может включать стереоспецифичность, региоселективность и хемоселективность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор, который обеспечивает получение нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный антигенный рецептор.
[0042] В настоящей заявке термины «регулировать» или «модулировать» относятся к контролю биологического процесса или модифицирующему или контролирующему воздействию на биологический или клеточный процесс или путь. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован, полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование включает модулирование дифференцировки и апоптоза клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование включает модулирование пролиферации клеток путем регуляции активности белков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белки являются регуляторами клеточного цикла и факторами транскрипции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения регуляторы клеточного цикла представляют собой циклин D1, р21, р27 и/или cdc25A. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения факторы транскрипции представляют собой с-Мус.
[0043] В настоящей заявке термин «цитотоксический Т-лимфоцит» (ЦТЛ) относится к Т-лимфоциту, экспрессирующему CD8 на своей поверхности (т.е. к CD8+ Т-клетке). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такие клетки предпочтительно представляют собой Т-клетки «памяти» (ТМ-клетки), которые вступали в контакт с антигеном. В настоящей заявке термин Т-клетка «центральной памяти» (или «ТСМ») относится к ЦТЛ, вступавшим в контакт с антигеном, экспрессирующим CD62L или CCR-7 и/или CD45RO на своей поверхности, и не экспрессирующим или имеющим сниженный уровень экспрессии CD45RA, по сравнению с наивными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки центральной памяти являются положительными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO и/или CD95, и могут иметь сниженный уровень экспрессии CD54RA по сравнению с наивными клетками. В настоящей заявке термин Т-клетка «эффекторной памяти» (или «ТЕМ») относится к Т-клетке, которая вступала в контакт с антигеном, которая не экспрессирует или имеет сниженный уровень экспрессии CD62L на своей поверхности, по сравнению с клетками центральной памяти, и не экспрессирует или имеет сниженный уровень экспрессии CD45RA, по сравнению с наивными клетками. Согласно некоторым вариантам реализации клетки эффекторной памяти являются отрицательными в отношении экспрессии CD62L и/или CCR7, по сравнению с наивными клетками или клетками центральной памяти, и могут иметь различные уровни экспрессии CD28 и/или CD45RA.
[0044] В настоящей заявке термин «наивные» Т-клетки относится к Т-лимфоциту, не вступавшему в контакт с антигеном, который экспрессирует CD62L и/или CD45RA, и не экспрессирует CD45RO- по сравнению с клетками центральной или эффекторной памяти. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD8+ Т-лимфоциты характеризуются экспрессией фенотипических маркеров наивных Т-клеток, включая CD62L, CCR7, CD28, CD 127 и/или CD45RA.
[0045] В настоящей заявке термин «эффекторные» Т-клетки, «Те», относится к цитотоксическим Т-лимфоцитам, вступавшим в контакт с антигеном, которые не экспрессируют или имеют сниженные уровни экспрессии CD62L, CCR7 и/или CD28, и являются положительными в отношении гранзима В и/или перфорина по сравнению с клетками центральной памяти или наивными Т-клетками. В настоящей заявке термины «обогащенный» и «истощенный» описывают количество типов клеток в смеси, относятся к воздействию на смесь клеток процесса или этапа, который приводит к увеличению числа «обогащенного» типа и уменьшению числа «истощенных» клеток. Следовательно, в зависимости от источника исходной популяции клеток, подвергнутой процессу обогащения, смесь или композиция может содержать 60, 70, 80, 90, 95 или 99% или более (по числу или количеству) «обогащенных» клеток и/или 40, 30, 20, 10, 5 или 1% или менее (по числу или количеству) «истощенных» клеток.
[0046] В настоящей заявке термин «эпитоп» относится к части антигена или молекулы, которая распознается иммунной системой, включая антитела, Т-клетки и/или В-клетки. Эпитопы, как правило, содержат по меньшей мере 7 аминокислот и могу быть линейными или конформационными. Термин «выделенный», при использовании для описания различных полипептидов, описанных в настоящем документе, обозначает полипептид или нуклеиновую кислоту, которая была идентифицирована и отделена и/или выделена из компонентов природной среды. Предпочтительно выделенный полипептид или нуклеиновая кислота не связана с любыми компонентами, с которыми она связана в природе. Загрязняющие компоненты природной среды представляют собой материалы, которые обычно препятствуют диагностическому или терапевтическому применению полипептида или нуклеиновой кислоты, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества.
[0047] В настоящей заявке термин «внутриклеточный сигнальный домен» относится ко всему или части одного или более доменов молекулы (в настоящем изобретении молекулы химерного рецептора), которая обеспечивает активацию лимфоцита. Внутриклеточные домены таких молекул опосредуют передачу сигнала, взаимодействуя с клеточными медиаторами, чтобы вызвать пролиферацию, дифференцировку, активацию и другие эффекторные функции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные молекулы включают полноразмерный или часть CD28, CD3 или 4-1ВВ или их комбинации.
[0048] В настоящей заявке термин «лиганд» относится к веществу, которое специфично связывается с другим веществом с образованием комплекса. Примеры лигандов включают эпитопы антигенов, молекулы, которые связываются с рецепторами, субстратами, ингибиторами, гормонами и/или активаторами. В настоящей заявке термин «лигандсвязывающий домен» относится к веществу или части вещества, которая связывается с лигандом. Примеры лигандсвязывающих доменов включают антигенсвязывающие фрагменты антител, внеклеточные домены рецепторов и/или активные центры ферментов. В настоящей заявке термин «функционально соединенный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, что приводит к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально соединена со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально соединен с кодирующей последовательностью, если промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Обычно функционально соединенные последовательности ДНК являются смежными и, в случае необходимости, функциональную связь используют для соединения двух областей, кодирующих белки, в одной и той же рамке считывания.
[0049] Термин «процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» в отношении полипептидных последовательностей химерного рецептора, определенных в настоящем документе, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной последовательности для каждого из лигандсвязывающего домена, спейсера, трансмембранного домена и/или домена, активирующего лимфоциты, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с помощью общедоступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для оценки выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Например, процент идентичности аминокислотных последовательностей, полученный с применением компьютерной программы WU-BLAST-2 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)], основан на нескольких параметрах поиска, большинство из которых установлены как значения по умолчанию. Параметры, которые не установлены как значения по умолчанию (то есть, регулируемые параметры), устанавливаются со следующими значениями: длина перекрывания = 1, доля перекрывания = 0,125, пороговая длина слова (Т) = 11 и оценочная матрица = BLOSUM62. Значение процента идентичности аминокислотных последовательностей определяют путем деления (а) количества совпадающих идентичных аминокислотных остатков между каждой или всеми аминокислотными последовательностями эталонной последовательности химерного рецептора, представленной в таблице 2 и сравниваемой аминокислотной последовательностью, представляющей интерес, как определено WU-BLAST-2, на (b) общее количество аминокислотных остатков полипептида, представляющего интерес. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения процент идентичности аминокислотных или нуклеотидных последовательностей определяют с помощью программного обеспечения.
[0050] В настоящей заявке термин «вариант полинуклеотида химерного рецептора» или «вариант полинуклеотидной последовательности химерного рецептора» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, определенной ниже, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, 85%, 90% или 95% идентична (или процент идентичности нуклеотидных последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеуказанных процентных значений) последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в таблице 1, или ее конкретному фрагменту, такому как полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий домен, полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и/или полинуклеотид, кодирующий стимулирующий домен лимфоцитов. Обычно вариант полинуклеотида химерного рецептора или его фрагмента будет по меньшей мере на 80% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 81% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 82% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 83% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 84% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 86% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 87% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 88% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 89% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 91% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 92% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 93% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 94% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 96% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты и еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичен последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в таблице 1, или фрагменту, полученному из нее. Варианты не включают нативную нуклеотидную последовательность. В связи с этим, вследствие вырожденности генетического кода, специалист в данной области техники поймет, что большое количество вариантов полинуклеотидов, кодирующих химерный рецептор, имеющих по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты с нуклеотидной последовательностью, представленной в таблице 1, будут кодировать полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности, представленной в таблице 2.
[0051] Термин «по существу очищенный» относится к молекуле, которая содержит 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% или менее других типов молекул или других типов клеток. По существу очищенная клетка также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в природном состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к гомогенной популяции клеток.
[0052] Термин «по существу не обнаружено», при использовании в отношении присутствия опухолевого антигена или других молекул на нормальных клетках, относится к проценту нормальных клеток, которые содержат антиген или молекулу, и/или к плотности антигена на клетках. Согласно некоторым вариантам реализации «по существу не обнаружено» означает, что антиген или молекула обнаруживается на менее чем 50% нормальных клеток и/или с плотностью, которая на 50% меньше, по сравнению с количеством клеток или антигена, обнаруженного на опухолевой клетке или другой больной клетке.
[0053] В настоящей заявке «Т-клетки» или «Т-лимфоциты» могут быть получены из любого млекопитающего, предпочтительно примата, вида, включая обезьян, собак и человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки являются аллогенными (получены из одного и того же вида, но другого донора) по отношению к субъекту-реципиенту; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки являются аутологичными (донор и реципиент представляют собой одного и того же субъекта); согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки являются сингенными (донор и реципиент являются разными субъектами, но идентичными близнецами).
[0054] «Вектор» или «конструкция» представляет собой нуклеиновую кислоту, используемую для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетку, которая содержит регуляторные элементы, чтобы обеспечить экспрессию гетерологичных нуклеиновых кислот в клетке. Векторы включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, миникольцевые нуклеиновые кислоты, геномы дрожжей и вирусов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы представляют собой плазмиды, миникольцевые нуклеиновые кислоты, геномы дрожжей и вирусов
[0055] В настоящей заявке термин «апоптоз» относится к процессу запрограммированной клеточной смерти (PCD), который может иметь место в многоклеточных организмах. Биохимические события приводят к характерным изменениям (морфологическим) и гибели клетки. Изменения включают пузырение, сжатие клеток, фрагментацию ядер, конденсацию хроматина и фрагментацию хромосомной ДНК. При апоптозе клетка инициирует внутриклеточную апоптотическую передачу сигналов в ответ на стресс, который может привести к суициду клеток. Связывание ядерных рецепторов с глюкокортикоидами, нагревание, облучение, недостаток питательных веществ, вирусные инфекции, гипоксия и увеличение внутриклеточной концентрации кальция, например, при повреждении мембраны, все могут вызвать высвобождение внутриклеточных апоптотических сигналов поврежденной клеткой. Ряд клеточных компонентов, таких как поли(АДФ рибоза)-полимераза, также могут облегчить регуляцию апоптоза.
[0056] Прежде чем ферменты спровоцируют непосредственный процесс гибели клеток, апоптотические сигналы должны оказать воздействие на регуляторные белки, которые инициируют апоптотический путь. Этот этап не позволяет апоптотическим сигналам вызывать гибель клеток, или процесс должен быть остановлен, если клетка больше не обязана подвергаться апоптозу. В процесс апоптоза вовлечены некоторые белки, однако были выявлены два основных способа регулирования: нацеленное воздействие на функциональные возможности митохондрий или непосредственная трансдукция сигнала посредством адаптерных белков к апоптотическим механизмам. Другой внешний путь инициации, выявленный в нескольких исследованиях с использованием токсинов, заключается в увеличении концентрации кальция внутри клетки, вызванном активностью лекарственного средства, которое также может вызывать апоптоз с участием связывающей кальций протеазы, кальпаина.
[0057] Апоптоз может регулироваться многими факторами. Указанные факторы могут включать, но не ограничиваются ими, гены, которые могут экспрессировать ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Вс12, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 и/или химеры PD-1CD28. ИЛ-15 регулирует активацию и пролиферацию Т-клеток и природных Т-клеток киллеров. Было показано, что в лимфоцитах грызунов ИЛ-15 предотвращает апоптоз путем индукции ингибитора апоптоза, BCL2L1/BCL-X(L). У людей с целиакией ИЛ-15 также подавляет апоптоз в Т-лимфоцитах путем индукции Вс1-2 и/или Bc1-XL. Bc1-2 (В-клеточная лимфома 2), кодируемая у человека геном BCL2, является первоначальным членом семейства Вс1-2 регуляторных белков, которые регулируют клеточную гибель (апоптоз) путем его индукции (проапоптотическое действие) или ингибирования (антиапоптотическое действие). Вс1-2 рассматривается в частности как важный антиапоптический белок и, следовательно, классифицируется как онкоген. Протеинкиназа В (РКВ), также известная как Akt, представляет собой серин/треонин-специфичную протеинкиназу, которая играет ключевую роль в нескольких клеточных процессах, таких как метаболизм глюкозы, апоптоз, пролиферация клеток, транскрипция и миграция клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который регулирует апоптоз или модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, включает ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Вс12, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28.
[0058] В настоящей заявке «передача сигналов с участием контрольных точек» блокирует клеточный цикл в определенных точках перехода, контрольных точках, чтобы гарантировать, что события клеточного цикла происходят в правильном порядке. Передача сигналов с участием контрольных точек также может быть активирована. Например, но не ограничиваясь этим, передача сигналов с участием контрольных точек может произойти при повреждении ДНК, так, что клеточный цикл не продолжается до тех пор, пока повреждение не будет восстановлено. «Контрольные точки клеточного цикла» представляют собой контрольные механизмы в эукариотических клетках, которые обеспечивают надлежащее деление клетки. Каждая контрольная точка служит в качестве потенциальной точки остановки во время клеточного цикла, в течение которой оценивается состояние клетки, при этом если достигаются благоприятные условия, то клетка проходит различные фазы клеточного цикла. В настоящее время существуют три известные контрольные точки: контрольная точка G1, также известная как контрольная точка ограничения или старта; контрольная точка G2/M; и контрольная точка метафазы, также известная как контрольная точка сборки веретена деления. Биохимические пути, которые сдерживают продвижение клеточного цикла и/или индуцируют гибель клеток после стресса, известны как контрольные точки клеточного цикла. Указанные контрольные точки поддерживают точность репликации, восстановления ДНК и деления. Полипептиды, которые могут регулировать передачу сигналов с участием контрольных точек, могут включать, но не ограничиваются ими, р53, р107 р130 и репрессор транскрипции Rb.
[0059] В настоящей заявке термин «отрицательные регуляторы контрольных точек» относится к факторам, которые могут ограничить способность Т-клеточных реакций эффективно атаковать опухоли. Отрицательные регуляторы контрольных точек также могут упоминаться как отрицательная передача сигналов с участием контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который ингибирует или регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[0060] В другом примере ингибиторы клеточного цикла, которые опосредуют передачу сигналов, ингибирующих размножение, к нижележащим сигнальным путям, ингибиторы циклин-CDK семейства Cip/Kip, p21Cip1, p27Kip1 и p57Kip2, были выявлены как многоцелевые белки, функции которых не ограничены регуляцией клеточного цикла. Помимо регуляции клеточного цикла белки Cip/Kip также могут играть важную роль в апоптозе, регуляции транскрипции, определении судьбы клеток, миграции клеток и динамике цитоскелета. Сложная сеть фосфорилирования модулирует функции белка Cip/Kip, изменяя его внутриклеточную локализацию, белок-белковые взаимодействия и стабильность. Перечисленные функции имеют большое значение для поддержания нормального клеточного и тканевого гомеостаза во многих процессах, начиная от эмбрионального развития и заканчивая подавлением опухолей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[0061] В настоящей заявке термин «предшественники Т-клеток» относится к лимфоидным клеткам-предшественникам, которые могут мигрировать в тимус и становиться предшественниками Т-клеток, которые не экспрессируют Т-клеточный рецептор. Все Т-клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге. Гемопоэтические клетки-предшественники (лимфоидные клетки-предшественники), происходящие из гемопоэтических стволовых клеток, заселяют тимус и размножаются путем деления клеток, чтобы создать большую популяцию незрелых тимоцитов. Самые ранние тимоциты не экспрессируют ни CD4, ни CD8, и поэтому классифицируются как двойные отрицательные (CD4-CD8-) клетки. По мере их развития они становятся двойными положительными тимоцитами (CD4+CD8+), и, наконец, зрелыми моноположительными (CD4+CD8- или CD4-CD8+) тимоцитами, которые затем высвобождаются из тимуса в периферические ткани.
[0062] Приблизительно 98% тимоцитов умирают во время процессов развития в тимусе, не сумев пройти положительную селекцию или отрицательную селекцию, в то время как другие 2% выживают и высвобождаются из тимуса, превращаясь в зрелые иммунокомпетентные Т-клетки.
[0063] [Двойная отрицательная (DN) стадия предшественника Т-клеток направлена на создание функциональной бета-цепи, тогда как двойная положительная (DP) стадия направлена на выработку функциональной альфа-цепи, что в конечном итоге должно привести к выработке функционального αβ Т-клеточного рецептора. По мере того как развивающийся тимоцит проходит четыре стадии DN (DN1, DN2, DN3 и DN4), Т-клетка экспрессирует инвариантную альфа-цепь, но претерпевает перестройки в локусе β-цепи. Если перестроенная β-цепь успешно спаривается с инвариантной α-цепью, то вырабатываются сигналы, которые приостанавливают перестройку бета-цепи (и подавляют альтернативный аллель) и приводят к пролиферации клетки. Несмотря на то, что эти сигналы требуют присутствия пре-TCR на поверхности клетки, они зависят от связывания лигандов с пре-TCR. Указанные тимоциты затем начинают экспрессировать CD4 и CD8 и прогрессируют до стадии двойной положительной (DP) клетки, когда происходит отбор α-цепи. Если перестроенная β-цепь не приводит к передаче сигналов (например, в результате неспособности спаривания с инвариантной альфа-цепью), то клетка может погибнуть вследствие исключения из процессов сигнализации (отсутствие передачи сигналов).
[0064] «Гемопоэтические стволовые клетки» или «ГСК», описанные в настоящем документе, представляют собой клетки-предшественники, которые могут дать начало миелоидным клетками, таким как, например, макрофаги, моноциты, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки и лимфоидные клоны (такие как, например, Т-клетки, В-клетки, NK-клетки). ГСК представляют собой гетерогенную популяцию, в которой существуют три класса стволовых клеток, которые различаются по соотношению лимфоидного и миелоидного потомства в крови (L/M).
[0065] В настоящем изобретении предложена система, которая содержит индуцируемый компонент для экспрессии трансгенов и конститутивный компонент для экспрессии трансгенов. Система может быть адаптирована, чтобы обеспечить регулируемую экспрессию одного или более трансгенов для обеспечения функциональных характеристик в трансдуцированных клетках.
[0066] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансген под контролем индуцируемого промотора представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). Индуцируемый промотор обеспечивает возможность остановки экспрессии CAR в клетках, обеспечивая при этом реактивацию клеток позднее (например, в случае рецидива). Помимо этого циркулирование CAR-экспрессирующих Т-клеток посредством периодов включения и выключения может свести к минимуму истощение и/или анергию вследствие хронической стимуляции Т-клеточных рецепторов.
[0067] Конструкция векторов также обеспечивает дополнительные трансгены, которые могут улучшить одну или более функциональных характеристик трансдуцированных клеток, такую как повышение специфичной активности в отношении опухоли, выживаемость и пролиферация трансдуцированных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные трансгены находятся под контролем индуцируемого промотора. Подходящие трансгены включают, но не ограничиваются ими, гены, которые способствуют выживанию и пролиферации, гены, которые предотвращают апоптоз, и гены, которые регулируют передачу сигналов с участием контрольных точек. Подходящие гены включают гены, кодирующие ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Вс12, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансгены включают гены, кодирующие ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Вс12, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, кодирует полипептид, который ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[0068] В настоящем изобретении предложена система, содержащая первую и вторую нуклеиновые кислоты, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие указанные нуклеиновые кислоты. Каждая из первой и второй нуклеиновых кислот содержит ряд модульных компонентов, которые могут быть вырезаны и заменены другими компонентами для того чтобы адаптировать систему для конкретной клетки-мишени. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит индуцируемый промотор для контроля экспрессии генов (например, полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор), который может быть активирован или подавлен, если необходимо. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота содержит конститутивный промотор, который обеспечивает экспрессию активатора транскрипции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ген кодирует химерный антигенный рецептор.
Индуцируемая система
[0069] В настоящем изобретении предложена система, которую можно применять, чтобы обеспечить регулируемую экспрессию трансгенов в клетках. Подходящие трансгены включают, но не ограничиваются ими, Т-клеточные рецепторы, Т-клеточные рецепторы с созревшей аффинностью, химерные антигенные рецепторы, рецепторы хемокинов, цитокины, гены, которые ингибируют апоптоз, и/или гены, которые модулируют передачу сигналов с участием контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит ряд модульных компонентов, которые обеспечивают легкое замещение элементов нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации системы, система обеспечивает регуляцию экспрессии трансгенов в клетках. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансгены кодируют Т-клеточные рецепторы, Т-клеточные рецепторы с созревшей аффинностью, химерные антигенные рецепторы, рецепторы хемокинов, цитокины, гены, регулирующие апоптоз, и/или гены, которые модулируют передачу сигналов с участием контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, кодирует полипептид, который ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[0070] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей модулятор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым.
[0071] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, при этом молекула-мишень представляет собой опухолеспецифичный антиген, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор экспрессии содержит первую и/или вторую нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем документе. Полипептиды, кодируемые всей или частью нуклеиновых кислот, кодирующих химерные рецепторы, также включены в объем настоящего изобретения.
[0072] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим ген, который способствует выживанию и пролиферации клеток, ген, который регулирует апоптоз, и/или ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек. Подходящие гены включают гены, кодирующие ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Вс12, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, кодирует полипептид, который ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
Индуцируемые промоторы
[0073] Система содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством. С помощью индуцируемого промотора экспрессия трансгена может быть активирована или подавлена, чтобы избежать токсичных побочных эффектов и/или обеспечить клеткам период покоя во время ремиссии. Несмотря на то, что известно несколько индуцируемых промоторных систем, клиническая применимость этих систем ограничена вследствие токсичных нецелевых эффектов, неблагоприятного биораспределения и профилей фармакодинамики, ограниченного конечного динамического диапазона и/или ограниченного наличия в качестве коммерчески доступных фармацевтических препаратов, одобренных FDA. Помимо этого во многих из указанных систем применяют химерные регуляторы транскрипции, сконструированные из ксеногенных компонентов, что вызывает иммуногенные осложнения при применении указанных систем в лекарственных средствах у человека.
[0074] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор может быть индуцирован лекарственным средством. Лекарственное средство выбирают на основании показателей безопасности, благоприятного профиля фармакокинетики, распределения в тканях, низкого коэффициента распределения между внеклеточным пространством и цитозолем, низкой иммуногенности, низкой токсичности и/или высокой экспрессии в лимфоцитах. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения выбрано лекарственное средство, которое одобрено FDA, обеспечивает экспрессию трансгенов в лимфоцитах, не активирует экспрессию другого нежелательного гена и индуцирует промотор, который не содержит каких-либо ксеногенных компонентов. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор активируется активатором транскрипции, который взаимодействует с лекарственным средством. Активатор транскрипции активируется или способен связываться и активировать индуцируемый промотор в присутствии лекарственного средства.
[0075] Согласно конкретному варианту реализации лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, которое связывается с лигандсвязывающим доменом рецептора эстрогена активатора транскрипции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство включает тамоксифен, его метаболиты, аналоги и фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты или сольваты.
[0076] Тамоксифен, CAS RN: 10540-29-1, также известен как 2-(4-((1Z)-1,2-дифенил-1-бутенил)фенокси)-N,N-диметилэтанамин или (7)-2-(пара-(1,2-дифенил-1-бутенил)фенокси)-N,N-диметиламин (IUPAC) и имеет молекулярную формулу C26H29NO, молекулярная масса 371,52. Тамоксифен является селективным модулятором рецептора эстрогена, который обладает тканеспецифичными видами активности. Тамоксифен действует как антиэстрогенный (ингибирующий агент) агент в ткани молочной железы, но как эстроген (стимулирующий агент) при метаболизме холестерина, увеличивает плотность костной ткани, а также пролиферацию клеток в эндометрии. Тамоксифен часто вводят перорально в виде фармацевтически приемлемой соли. Например, цитрат тамоксифена (RN 54965-24-1, молекулярная масса 563,643) показан для лечения метастатического рака молочной железы, а также в качестве вспомогательного средства для лечения рака молочной железы у женщин после мастэктомии с удалением подмышечных лимфоузлов и облучения груди. Цитрат тамоксифена также показан для снижения заболеваемости раком молочной железы у женщин с высоким риском развития рака молочной железы.
[0077] Метаболиты тамоксифена в моделях рака молочной железы у крыс и мышей, и пациентов, страдающих раком молочной железы, включая основные метаболиты N-дезметилтамоксифен (RN 31750-48-8, молекулярная масса 357,494) и 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) (RN 68392-35-8, молекулярная масса 387,52, афимоксифен), описаны в работе Robinson et al., Metabolites, pharmacodynamics, and pharmacokinetics of tamoxifen in rats and mice compared to the breast cancer patient. Drug Metab Dispos January 1991 19:36-43, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Дополнительные метаболиты, образующиеся в результате активности цитохрома Р-450, раскрыты в работе Crewe et al., 2002, включая цис-4-гидрокситамоксифен (RN 174592, молекулярная масса 387,52; афимоксифен, Е-изомер) и 4'-гидрокситамоксифен ((Z)-4-(1-(4-(2-(диметиламино)этокси)фенил)-1-фенилбут-1-ен-2-ил)фенол). См. работу Crewe et al., 2002, Metabolism of Tamoxifen by recombinant human cytochrome P-450 enzymes: Formation of the 4-hydroxy, 4'-hydroxy and N-desmethyl metabolites and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen, Drug Metab Dispos, 30(8): 869-874, фиг. 1, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
[0078] Соединения, обладающие структурным сходством с тамоксифеном, включают, но не ограничиваются ими, цис-тамоксифен (RN 13002-65-8, молекулярная масса 371,521), 4 метилтамоксифен (RN 73717-95-5, молекулярная масса 385,548), N-дезметилтамоксифен (RN 31750-48-8, молекулярная масса 357,494), (E)-дезэтилметилтамоксифен (RN 15917-50-7, молекулярная масса 357,494), (Е)-дезэтилметилтамоксифен (RN 31750-45-5, молекулярная масса 357,494), транс-4-гидрокситамоксифен (RN 68047-06-3, молекулярная масса 387,52), афимоксифен (RN 68392-35-8, молекулярная масса 387,52, 4-гидрокситамоксифен), афимоксифен, Е-изомер (RN 174592-47-3, молекулярная масса 387,52), 4-хлортамоксифен (RN 77588-46-6, молекулярная масса 405,966), 4-фтортамоксифен (RN 73617-96-6, молекулярная масса 389,511), торемифен (RN 89778-26-7, молекулярная масса 405,966), дезэтилтамоксифен (RN 19957-51-8, молекулярная масса 343,47), (Е)-дезэтилтамоксифен (RN 97151-10-5, молекулярная масса 343,47), (Z)-дезэтилтамоксифен (RN 97151-11-6, молекулярная масса 343,47), мипроксифен (RN 129612-87-9, молекулярная масса 429,6), 2-(п-(бета-этил-альфа-фенилстирил)фенокси)триэтиламин (RN 749-86-0, молекулярная масса 399,575), дролоксифен (RN 82413-20-5, молекулярная масса 387,52), 4-иодтамоксифен (RN 116057-68-2, молекулярная масса 497,413), дигидротамоксифен (RN 109640-20-2, молекулярная масса 373,537), (Е)-N,N-диметил-2-(4-(1-(2-метилфенил)-2-фенил-1-бутенил)фенокси)этанамин (RN 97150-96-4, молекулярная масса 385,548) или 4-гидрокситоремифен (RN 110503-62-3, молекулярная масса 421,965); и/или их фармацевтически приемлемые соли и/или гидраты, или сольваты.
[0079] Например, цитраты тамоксифена или цитраты соединений, обладающих структурным сходством с тамоксифеном, включают, но не ограничиваются ими, цитрат тамоксифена (RN 54965-24-1, молекулярная масса 563,64), цитрат 2-(п-(1,2-дифенил-1-бутенил)фенокси)-N,N-диметилэтиламина (RN 7244-97-5, молекулярная масса 563,64), цитрат (Е)-тамоксифена (RN 76487-65-5, молекулярная масса 563,64), цитрат торемифена (RN 89778-27-8, молекулярная масса 598,088), цитрат дролоксифена (RN 97752-20-0, молекулярная масса 579,64), цитрат 2-(п-(1,2-бис(п-метоксифенил)-1-бутенил)фенокси)триэтиламина (RN 42920-39-8, молекулярная масса 651,748), 2-(4-(1,2-дифенилэтил)фенокси)-N,N-диэтилэтанамин, 2-гидрокси-1,2,3-пропантрикарбоксилат (RN 40297-42-5, молекулярная масса 563,643), цитрат 2-(п-(альфа-фенилстерил)фенокси)триэтиламина (RN 102433-95-4, молекулярная масса 563,64), цитрат 2-(п-(2-(п-метоксифенил)-1-фенил-1-бутенил)фенокси)триэтиламина (1:1) (RN 42824-34-0, молекулярная масса 637,72), цитрат 2-(п-(1-(п-метоксифенил)-2-фенилпропенил)фенокси)триэтиламина (RN 13554-24-0, молекулярная масса 607,696), цитрата 2-(п-(альфа-(п-метоксифенил)стирил)фенокси)триэтиламина моногидрат (RN 13542-71-7, молекулярная масса 593,669), цитрат 2-(р-(р-метокси-альфа-фенилфенетил)фенокси)триэтиламина (RN 16421-72-0, молекулярная масса 595,685), альфа-(п-(2-(диэтиламино)этокси)фенил)-бета-этил-п-метокси-альфа-фенилфенетилового спирта цитрат (1:1) (RN 35263-93-5, молекулярная масса 639,737), цитрат 1-(п-(2-(диэтиламино)этокси)фенил)-2-(п-метоксифенил)-1-фенилэтанол (молекулярная масса 611,68), альфа-р-(2-(диэтиламино) этокси)фенил)-бета-этил-альфа-(п-гидроксифенил)-п-метоксифенетилового спирта цитрат (RN 35263-96-8, молекулярная масса 655,737) и/или цитрат 2-(п-(п-метокси-альфа-метилфенетил)фенокси)триметиламина (RN 15624-34-7, молекулярная масса 533,614).
[0080] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффективное количество лекарственного средства для индукции экспрессии представляет собой количество, которое обеспечивает увеличение экспрессии трансгенов по сравнению с неиндуцированным и/или начальным уровнем экспрессии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения подходящее количество может быть легко определено с помощью известных дозировок и фармакокинетического профиля лекарственного средства.
[0081] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор имеет низкий уровень исходной активности. При использовании лентивирусного вектора уровень исходной активности в неиндуцированных клетках составляет 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее по сравнению с уровнем активности, когда клетки индуцируют для экспрессии гена. Уровень исходной активности может быть определен путем измерения количества экспрессии трансгена (например, маркерного гена) в отсутствие индуктора (например, лекарственного средства) с использованием проточной цитометрии.
[0082] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор обеспечивает высокий уровень индуцированной активности, по сравнению с неиндуцированной или исходной активностью. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения уровень активности в индуцированном состоянии в 2, 4, 6, 8, или 10 или более раз выше, чем уровень активности в неиндуцированном состоянии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экспрессия трансгена под контролем индуцируемого промотора подавляется в отсутствие трансактиватора в течение менее чем 10, 8, 6, 4, 2 или 1 дня, не учитывая 0-й день.
[0083] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор может быть разработан и/или модифицирован так, чтобы обеспечить низкий уровень исходной активности, высокий уровень восприимчивости к индукции и/или короткое время для обратимости. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор представляет собой промотор 7×HBD/mE1b. Типичная последовательность промотора представлена в таблице 12 (SEQ ID NO: 41). Например, в промотор 7×HBD/mE1b могут быть введены мутации, чтобы усилить связывание активатора транскрипции.
[0084] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в системе применяется синтетический активатор транскрипции, который, в присутствии лекарственного средства (например, тамоксифена), связывается с синтетическим промотором, расположенным в направлении 5'-конца относительно трансгена, чтобы индуцировать экспрессию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции представляет собой TamR-tf (НЕА-3). Регулируемый тамоксифеном фактор транскрипции («TamR-tf», также обозначаемый «НЕА-3») представляет собой химерный фактор транскрипции, состоящий из субъединиц человека, включая N-концевой ДНК-связывающий домен ядерного фактора 1-альфа гепатоцитов (HNF-1α) (например, аминокислоты 1-281 из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40), гибридизованный в одной открытой рамке считывания с мутированным тамоксифен-специфичным лигандсвязывающим доменом из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD), который, в свою очередь, гибридизован с доменом активации р65 NF-κВ (р65). Типичная аминокислотная последовательность представлена в таблице 10 и определена как последовательность SEQ ID NO: 40. Мутированный тамоксифен-специфичный лигандсвязывающий домен из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD) находится в участке с 282 по 595 остаток аминокислотной последовательности TamR-tf и содержит мутацию в положении 521. Домен активации p65NF-κB (р65 или TAD) находится в участке с 596 по 862 остаток аминокислотной последовательности.
[0085] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательный регулятор контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно представляет собой связывающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в системе применяется синтетический активатор транскрипции, который, в присутствии лекарственного средства, связывается с синтетическим промотором, расположенным в направлении 5'-конца относительно трансгена, чтобы индуцировать экспрессию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции представляет собой TamR-tf (НЕА-3). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен.
[0086] В активатор транскрипции могут быть внесены дополнительные изменения, чтобы усилить свойства фактора транскрипции, включая, но не ограничиваясь ими, замены одной или более аминокислот в лигандсвязывающем домене рецептора эстрогена и/или замены одной или более аминокислот в домене трансактивации р65. Замены аминокислот в связывающем домене рецептора эстрогена могут обеспечить более специфичное связывание лекарственного средства с активатором транскрипции. Пример активатора транскрипции с измененной аминокислотной последовательностью в ER-LBD представлен в таблице 11 (SEQ ID NO: 43). Мутации введены в положении аминокислоты 400, 543 и 544 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40. Активатор транскрипции с измененной последовательностью имеет повышенную аффинность в отношении тамоксифена или 4-ОНТ. Замены аминокислот в домене трансактивации р65 могут обеспечить повышенную экспрессию трансгена в отсутствие активации трансдуцированных клеток.
[0087] В отсутствие тамоксифена TamR-tf исключается из ядра вследствие связывания цитозольного белка теплового шока 90 (HSP90) с активным сайтом связывания тамоксифена, и экспрессия трансгена находится в состоянии «OFF». Тамоксифен, присутствующий в наномолярных концентрациях в цитозоле, активно конкурирует с HSP90 за связывание с ER-LBD, что приводит к транслокации TamR-tf в ядро. После транслокации в ядро TamR-tf становится легко доступен для связывания со своим специфичным синтетическим промотором. В присутствии тамоксифена связывание TamR-tf с промотором 7×HBD/EF1αp индуцирует состояние «ON» экспрессии трансгенов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный регулятор транскрипции может быть модифицирован так, чтобы обеспечить различный уровень контроля экспрессии трансгена. Замены аминокислот в LBD TamR-tf (НЕА-3) обеспечивают селективную восприимчивость к тамоксифену и его метаболитам, причем 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) является наиболее фармакологически активным метаболитом в отношении активности TamR-tf (НЕА-3), не вступая при этом во взаимодействия с эндогенным эстрогеном.
[0088] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор действует в лентивирусной конструкции и/или в лимфоцитах.
Химерные антигенные рецепторы
[0089] Система для экспрессии химерного антигенного рецептора содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может вызывать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения другой полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, находится под контролем конститутивного промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен.
Лигандсвязывающий домен
[0090] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен специфично связывается с антигеном, специфичным для опухоли или вируса, и указанный лигандсвязывающий домен может быть гуманизирован. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен содержит, но не ограничивается ими, рецепторы или их части, небольшие пептиды, пептидомиметики, субстраты, цитокины и тому подобное. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой антитело или его фрагмент, предпочтительно его связывающий фрагмент, каждый из которых может быть гуманизирован. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или фрагмент антитела, может быть легко определена. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения полинуклеотид кодирует одноцепочечный Fv, который специфично связывается с CD19. В других конкретных вариантах реализации настоящего изобретения полинуклеотид кодирует одноцепочечный Fv, который специфично связывается с Her2, СЕ7, hB7H3 или EGFR и необязательно указанный полинуклеотид кодирует его гуманизированные варианты. Последовательности указанных антител известны или могут быть легко определены специалистами в данной области техники.
[0091] Опухолевые антигены представляют собой белки, которые вырабатываются опухолевыми клетками, которые вызывают иммунный ответ. Выбор лигандсвязывающего домена согласно настоящему изобретению будет зависеть от типа рака, который лечат, и может быть направлен на опухолевые антигены или другие молекулы на поверхности опухолевых клеток. Образец опухоли от субъекта может быть охарактеризован для определения присутствия конкретных биомаркеров или поверхностных клеточных маркеров. Например, клетки рака молочной железы от субъекта могут быть положительными или отрицательными для каждого из Her2Neu, рецептора эстрогенов и/или рецептора прогестерона. Отбирают опухолевый антиген или поверхностную молекулу клетки, которые обнаруживают на отдельных опухолевых клетках субъекта. Опухолевые антигены и поверхностные молекулы клеток хорошо известны в данной области техники и включают, например, карциноэмбриональный антиген (СЕА), специфичный антиген простаты, PSMA, Her2/Neu, рецептор эстрогенов, рецептор прогестерона, ephrinB2, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, СЕ7, hB7H3, ROR1, мезотелин, c-Met, GD-2 и/или MAGE A3 TCR. Согласно некоторым вариантам реализации молекула-мишень представляет собой молекулу на поверхности клеток, которая находится на опухолевых клетках и по существу не обнаруживается на нормальных тканях, или ее экспрессия ограничена невитальными нормальными тканями.
[0092] Согласно другому варианту молекула-мишень на опухоли содержит один или более эпитопов, связанных со злокачественной опухолью. Злокачественные опухоли экспрессируют ряд белков, которые могут служить в качестве антигенов-мишеней для распознавания, опосредованного Т-клеточным рецептором или химерным рецептором. Другие молекулы-мишени относятся к группе молекул, связанных с трансформацией клеток, таких как онкоген HER-2/Neu/ErbB2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолевый антиген селективно экспрессируется или сверхэкспрессируется на клетках опухоли по сравнению с контрольными клетками этого же типа ткани. В других вариантах реализации настоящего изобретения опухолевый антиген представляет собой поверхностный полипептид клеток.
[0093] После определения поверхностной молекулы опухолевой клетки, которая может являться мишенью химерного рецептора, отбирают и описывают эпитоп молекулы-мишени. Антитела, которые специфично связываются с поверхностной молекулой опухолевых клеток, могут быть получены с применением способов получения моноклональных антител, способов фагового дисплея, основных способов получения антител человека или гуманизированных антител, или способов с применением трансгенного животного или растения, модифицированного для получения антител человека. Библиотеки фагового дисплея частично или полностью синтетических антител доступны и могут быть подвергнуты скринингу для определения антитела или его фрагмента, который может связываться с молекулой-мишенью. Также доступны фаговые библиотеки антител человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела специфично связываются с поверхностной молекулой опухолевой клетки и не вступают в перекрестные реакции с неспецифичными компонентами, такими как бычий сывороточный альбумин, или другими неродственными антигенами. После выявления аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности, кодирующей антитело, указанные последовательности могут быть выделены и/или определены.
[0094] Антитела или антигенсвязывающие фрагменты включают полноразмерные поликлональные антитела, моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, синтетическое антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, минитело и линейное антитело или их части. Фрагменты антитела содержат часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую или вариабельную область интактного антитела и могут быть легко получены. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диантитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фрагменты антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диантитела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Любые из вышеупомянутых антител или фрагментов антител могут быть гуманизированными и могут быть использованы в композициях и способах, описанных в настоящем документе.
[0095] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения несколько различных антител, которые связываются с конкретными поверхностными молекулами опухолевых клеток, могут быть выделены и описаны. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела описывают на основании специфичности эпитопа молекулы-мишени. Помимо этого, в некоторых случаях, антитела, которые связываются с аналогичным эпитопом, могут быть выбраны на основании аффинности антитела в отношении указанного эпитопа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аффинность антитела составляет по меньшей мере 1 мМ, предпочтительно <50 нМ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аффинность антитела составляет 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 300 нМ 400 нМ, 500 нМ, 1 мкМ, 100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 600 мкМ, 700 мкМ, 800 мкМ, 900 мкМ или 1 мМ, или величина аффинности находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеупомянутых значений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбрано антитело, которое имеет более высокую аффинность в отношении эпитопа по сравнению с другими антителами. Например, выбрано антитело, величина аффинности которого по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз выше величины аффинности эталонного антитела, которое связывается с аналогичным эпитопом, или аффинность которого выше аффинности эталонного антитела на величину, которая находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из перечисленных значений.
[0096] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы-мишени выбраны из CD19, CD20, CD22, CD23, СЕ7, hB7H3, EGFR, CD123, CS-1, ROR1, мезотелина, Her2, c-Met, PSMA, GD-2 и/или MAGE A3 TCR и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации антитело или его связывающий фрагмент, который специфичен в отношении указанных молекул-мишеней, является гуманизированным.
[0097] В конкретных вариантах реализации антиген-мишень представляет собой CD19. Ряд антител, специфичных в отношении CD19, известны специалистам в данной области техники и могут быть легко охарактеризованы в отношении последовательности, параметров связывания эпитопа и аффинности. В конкретном варианте реализации конструкция химерного рецептора содержит последовательность scFv из антитела FMC63. Согласно другим вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность 
гипервариабельного участка CDRL1 (SEQ ID NO: 88), последовательность 
участка CDRL2 (SEQ ID NO: 89) и последовательность 
участка CDRL3 (SEQ ID NO: 90). Согласно другим вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность 
участка CDRH1 (SEQ ID NO: 91), последовательность 
участка CDRH2 (SEQ ID NO: 92) и последовательность 
участка CDRH3 (SEQ ID NO: 93). В область настоящего изобретения также включены вариабельные области, аминокислотные последовательности которых по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотной последовательности scFv из антитела FMC63, и которые имеют по меньшей мере аналогичную аффинность в отношении CD19.
[0098] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гипервариабельные участки (CDR) находятся в пределах областей антитела и нумеруются в соответствии с системой нумерации по Кабат следующим образом: для легкой цепи; аминокислоты 24-34 CDRL1; аминокислоты 50-56 CDRL2; аминокислоты 89-97 CDRL3; для тяжелой цепи, аминокислоты 31-35 CDRH1; аминокислоты 50-65; CDRH2 и аминокислоты 95-102 CDRH3. Участки CDR в антителах могут быть легко определены.
[0099] Согласно некоторым вариантам реализации антиген-мишень представляет собой HER2. Ряд антител, специфичных в отношении HER2, известны специалистам в данной области техники и могут быть легко охарактеризованы в отношении последовательности, параметров связывания эпитопа и аффинности. Согласно конкретному варианту реализации конструкция химерного рецептора содержит последовательность scFv из антитела герцептина. Согласно некоторым вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность гипервариабельного участка (CDR1), последовательность CDR2 и последовательность CDR3 из антитела герцептина. Согласно некоторым вариантам реализации scFv представляет собой scFv человека или гуманизированный scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность гипервариабельного участка (CDR1), последовательность CDR2 и последовательность CDR3 из антитела герцептина. Последовательности CDR могут быть легко определены из аминокислотной последовательности герцептина. В область настоящего изобретения также включены вариабельные области, аминокислотные последовательности которых по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотной последовательности scFv для герцептина, и которые имеют по меньшей мере аналогичную аффинность в отношении HER2.
[00100] В настоящей заявке термин «гуманизированные антитела» относится к антителам из видов, отличных от человека, белковые последовательности которых были модифицированы, чтобы повысить их сходство с вариантами антител, вырабатываемых в природных условиях в организме человека. Процесс «гуманизации» может быть применен к моноклональным антителам, разработанным для введения человеку (например, антителам, разработанным в качестве противораковых лекарственных средств). Гуманизация может быть желательной, если процесс разработки специфичных антител предполагает использование иммунной системы видов, отличных от человека (например, у мышей). Белковые последовательности антител, полученных таким способом, частично отличаются от гомологичных антител, встречающихся в природных условиях в организме человека, и, следовательно, потенциально являются иммуногенными при введении пациентам-людям. Гуманизированные антитела отличаются от химерных антител содержанием белковых последовательностей, которым придали большее сходство с последовательностями антител человека, но при этом могут нести больший участок белка из вида, отличного от человека. Производное гуманизированного антитела может относиться к сегменту антитела или последовательности, полученной из гуманизированного антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен содержит гуманизированное антитело или его часть. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен содержит scFv. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения scFv представляет собой гуманизированный scFv.
[00101] Гуманизация может быть желательной согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для снижения иммуногенности моноклональных антител, которые получены из ксеногенных источников, таких как, например, грызуны. Гуманизация также является желательной согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для улучшения взаимодействия антитела или его фрагмента с иммунной системой человека. Благодаря развитию гибридомной технологии большое количество ксеногенных антител обладают высокой иммуногенностью у человека, что в конечном итоге может ограничить их клиническое применение, особенно если может потребоваться повторное введение. Помимо этого, указанные антитела могут быть быстро удалены из кровотока, а также могут вызывать системные воспалительные эффекты. Следовательно, необходимы стратегии гуманизации, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, чтобы избежать таких ситуаций. Методики гуманизации антител известны специалистам в данной области техники.
[00102] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим спейсерный участок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида другим полинуклеотидом, кодирующим лигандсвязывающий домен, кодирующий другой антиген или обладающий другими характеристиками связывания. Например, последовательность, кодирующая сайт рестрикции, NheI, введена в направлении 5'-конца относительно лидерной последовательности; и 3'-концевой сайт рестрикции RsrII, расположенный в шарнирной области, обеспечивает субклонирование любого желаемого scFv в вектор, несущий химерный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
[00103] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, функционально соединен с сигнальным пептидом. Согласно некоторым вариантам реализации сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Могут быть использованы полинуклеотиды, кодирующие другие сигнальные пептиды, такие как CD8 альфа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид кодирует CD8 альфа.
[00104] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий лигандсвязывающий домен, функционально соединен с промотором. Подходящий промотор обеспечивает экспрессию химерного антигенного рецептора в клетке млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации промотор представляет собой индуцируемый промотор.
[00105] Конкретный вариант полинуклеотида, кодирующего лигандсвязывающий домен, представлен в таблице 1 в виде scFv из антитела, которое специфично связывается с CD19, такого как FMC63. Полинуклеотид, кодирующий гибкий линкер, содержащий аминокислоты 
(SEQ ID NO: 94), отделяет цепи VH и VL в scFv. Аминокислотная последовательность scFv, включая линкер, представлена в таблице 2. (SEQ ID NO: 11) Известны другие С019-специфичные антитела, такие как SJ25C1 и HD37. (SJ25C1: Bejcek et al., Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199).
Спейсер
[00106] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок. Как правило, спейсерный участок находится между лигандсвязывающим доменом и трансмембранным доменом химерного рецептора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок обеспечивает гибкость лигандсвязывающего домена и высокие уровни экспрессии в лимфоцитах. CD19-специфичный химерный рецептор, содержащий спейсер, который состоит из 229 аминокислот, обладал более низкой противоопухолевой активностью, чем CD19-специфичный химерный рецептор с коротким спейсерным участком, состоящим только из модифицированной шарнирной области IgG4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[00107] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит по меньшей мере от 10 до 229 аминокислот, от 10 до 200 аминокислот, от 10 до 175 аминокислот, от 10 до 150 аминокислот, от 10 до 125 аминокислот, от 10 до 100 аминокислот, от 10 до 75 аминокислот, от 10 до 50 аминокислот, от 10 до 40 аминокислот, от 10 до 30 аминокислот, от 10 до 20 аминокислот или от 10 до 15 аминокислот, или его длина находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных значений длин аминокислотной последовательности спейсера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит 12 аминокислот или менее, 119 аминокислот или менее, или 229 аминокислот или менее, но более 1 или 2 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором
[00108] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок получен из шарнирной области иммуноглобулин-подобной молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит полноразмерную шарнирную область IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека или ее часть, и может содержать одну или более замен аминокислот. Типичные последовательности шарнирных областей представлены в таблице 8. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения часть шарнирной области содержит аминокислоты из верхней части шарнирной области, обнаруженные между вариабельной областью тяжелой цепи и остовом, и аминокислоты остова шарнирной области, включая область полипролина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[00109] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательности шарнирной области могут быть модифицированы в одной или более аминокислотах, чтобы избежать нежелательных структурных взаимодействий, таких как димеризация. Согласно конкретному варианту реализации спейсерный участок содержит часть модифицированной шарнирной области человека из IgG4, например, представленную в таблице 2 или таблице 8 (SEQ ID NO: 21). Типичный полинуклеотид, кодирующий часть модифицированной шарнирной области IgG4, представлен в таблице 1. (SEQ ID NO: 4). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность шарнирной области может быть по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности шарнирной области, представленной в таблице 2 или таблице 8, или идентична на любой другой процент, который находится в диапазоне, определенном любыми двумя перечисленными процентными значениями идентичности последовательностей. Согласно другому варианту часть шарнирной области человека из IgG4 содержит замену аминокислоты в аминокислотной последовательности остова, такую как замена CPSP с образованием СРРС.
[00110] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полноразмерную шарнирную область или ее часть комбинируют с одним или более доменами константной области иммуноглобулина. Например, часть шарнирной области может быть комбинирована с полноразмерной или частью области СН2 или СН3, или ее варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок не включает последовательность шарнирной области, состоящую из 47-48 аминокислот, из CD8-альфа или спейсерного участка, содержащего внеклеточную часть молекулы CD28.
[00111] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий спейсерный участок содержит 12 аминокислот или менее, и содержит полноразмерную или часть последовательности шарнирной области IgG4 или ее варианта, промежуточный спейсерный участок содержит 119 аминокислот или менее, и содержит полноразмерную или часть последовательности шарнирной области IgG4 и область СН3 или ее вариант, и длинный спейсер содержит 229 аминокислот или менее, и содержит полноразмерную или часть последовательности шарнирной области IgG4, область СН2 и область СН3 или ее вариант. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий спейсерный участок содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислот или размер участка находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя вышеупомянутыми длинами аминокислотных участков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения средний спейсерный участок содержит 13, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 119 аминокислот или размер участка находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя вышеупомянутыми длинами аминокислотных участков. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсерный участок содержит 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210 или 219 аминокислот, или размер участка находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя вышеупомянутыми длинами аминокислотных участков.
[00112] Полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, может быть легко получен с помощью синтетических или рекомбинантных способов из аминокислотной последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный участок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий спейсерный участок, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида другим полинуклеотидом, кодирующим другой спейсерный участок. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего спейсерный участок, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
[00113] Согласно другому варианту спейсерный участок представляет собой последовательность шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или ее часть, последовательность шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 в комбинации с полноразмерной или частью области СН2 или ее варианта, последовательность шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 в комбинации с полноразмерной или частью области СН3 или ее варианта, и последовательность шарнирной области из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 в комбинации с полноразмерной или частью области СН2 или ее варианта, и/или области СН3 или ее варианта. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения короткий спейсерный участок представляет собой модифицированную последовательность шарнирной области IgG4 (SEQ ID NO: 4), содержащую 12 аминокислот или менее, но более одной или двух аминокислот, промежуточная последовательность представляет собой последовательность шарнирной области IgG4 в комбинации с последовательностью СН3, содержащей 119 аминокислот или менее, но более одной или двух аминокислот (SEQ ID NO: 62); или последовательность шарнирной области IgG4 в комбинации с областью СН2 и СН3, содержащей 229 аминокислот или менее, но более одной или двух аминокислот (SEQ ID NO: 50).
Трансмембранный домен
[00114] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен. Трансмембранный домен обеспечивает закрепление химерного рецептора в мембране.
[00115] Согласно другому варианту трансмембранный домен в природных условиях связан с одним из доменов в химерном рецепторе. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем замены аминокислоты, чтобы избежать связывания указанных доменов с трансмембранными доменами аналогичных или других поверхностных мембранных белков, чтобы свести к минимуму взаимодействие с другими членами рецепторного комплекса.
[00116] Трансмембранный домен может быть получен из природного или синтетического источника. В случае если источник является природным, домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка.
[00117] Трансмембранные участки содержат по меньшей мере трансмембранный участок(и) альфа, бета или дзета-цепи рецептора Т-клеток, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и/или CD154. Согласно конкретному варианту реализации трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность трансмембранного домена CD28, представленную в таблице 2. Типичная полинуклеотидная последовательность, кодирующая трансмембранный домен CD28, представлена в таблице 1 (SEQ ID NO: 5).
[00118] Трансмембранный домен может быть синтетическим или представлять собой вариант природного трансмембранного домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синтетические трансмембранные домены или их варианты содержат преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность трансмембранного домена может быть по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична аминокислотной последовательности трансмембранного домена, представленной в таблице 2 или таблице 6, или процент идентичности аминокислотных последовательностей находится в диапазоне между любыми двумя из указанных выше процентных значений. Варианты трансмембранных доменов предпочтительно имеют оценку гидрофобности по меньшей мере 50, вычисленную Kyte Doolittle.
[00119] Полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, может быть легко получен синтетическими или рекомбинантными способами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим внутриклеточный участок для передачи сигналов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида, кодирующего трансмембранный домен, другим полинуклеотидом, кодирующим другой трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего трансмембранный домен, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.
Внутриклеточный сигнальный домен
[00120] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, содержит полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Внутриклеточный сигнальный домен обеспечивает активацию одной функции трансдуцированной клетки, экспрессирующей химерный рецептор, после связывания с лигандом, который экспрессируется на опухолевых клетках. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен содержит один или более внутриклеточных сигнальных доменов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен представляет собой часть и/или вариант внутриклеточного сигнального домена, который обеспечивает активацию по меньшей мере одной функции трансдуцированной клетки.
[00121] Примеры внутриклеточных сигнальных доменов для применения в химерных рецепторах согласно настоящему изобретению включают цитоплазматические последовательности дзета-цепи CD3 и/или корецепторы, которые действуют согласованно, чтобы инициировать передачу сигналов после взаимодействия с химерным рецептором, а также любое производное или вариант указанных последовательностей и любой синтетической последовательности, которая имеет аналогичную функциональную способность. Можно утверждать, что активация Т-клеток опосредована двумя различными классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: теми, которые инициируют первичную антигензависимую активацию и обеспечивают сигнал, сходный с таковым от Т-клеточных рецепторов (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и те, которые действуют антигеннезависимым способом, чтобы обеспечить вторичный или костимуляторный сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые оказывают стимулирующее действие, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают те, которые получены из CD3-дзета, FcR гамма, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и/или CD66d. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первичный внутриклеточный сигнальный домен может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% идентичность последовательности с дзета-цепью CD3, содержащей последовательность, представленную в таблице 2, или по меньшей мере процент идентичности последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD3-дзета сохраняет по меньшей мере один, два, три или все участки ITAM, представленные в таблице 7.
[00122] В предпочтительном варианте реализации внутриклеточный сигнальный домен химерного рецептора может быть разработан так, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета по отдельности или в комбинации с любым другим желательным цитоплазматическим доменом(ами). Например, внутриклеточный сигнальный домен химерного рецептора может содержать дзета-цепь CD3 и костимулирующий сигнальный участок.
[00123] Костимулирующий сигнальный участок относится к части химерного рецептора, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой поверхностную молекулу клеток, отличную от рецептора антигена или его лигандов, которая необходима для ответа лимфоцитов на антиген. Примеры подходящих молекул включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD 137), ОХ40, CD30, CD40, ассоциированный с функцией лимфоцитов антиген 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3, ассоциированную с дзета-цепью протеинкиназу (Zap70) и/или лиганд, который специфично связывается с CD83. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность костимулирующего сигнального домена может быть по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности внутриклеточного домена CD28, представленного в таблице 5, или последовательности 4-1ВВ, содержащий последовательность, представленную в таблице 2, или по меньшей мере процент идентичности последовательностей находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных выше процентных значений. Согласно другому варианту вариант внутриклеточного домена CD28 содержит замену аминокислоты в положениях 186-187, в которых LL замещены GG.
[00124] Внутриклеточные сигнальные последовательности химерного рецептора могут быть связаны друг с другом в произвольном или указанном порядке. Согласно другим вариантам короткий олиго- или полипептидный линкер, предпочтительно содержащий от 2 до 10 аминокислот в длину, может образовывать связь. Согласно другому варианту внутриклеточные сигнальные домены содержат полноразмерный или часть сигнального домена дзета-цепи CD3 или ее варианта, и полноразмерный или часть сигнального домена CD28 или его варианта. Согласно другому варианту внутриклеточный сигнальный домен содержит полноразмерный или часть сигнального домена дзета-цепи CD3 или ее варианта, и полноразмерный или часть сигнального домена 4-1ВВ или его варианта. Согласно другому варианту внутриклеточный сигнальный домен содержит полноразмерный или часть сигнального домена дзета-цепи CD3 или ее варианта, полноразмерный или часть сигнального домена CD28 или его варианта, и полноразмерный или часть сигнального домена 4-1ВВ или его варианта. Согласно конкретному варианту реализации аминокислотная последовательность внутриклеточного сигнального домена, содержащего вариант дзета-цепи CD3 и часть внутриклеточного сигнального домена 4-1ВВ, представлена в таблице 2. Типичная последовательность нуклеиновой кислоты представлена в таблице 1 (SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
[00125] Согласно другому варианту полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, содержит внутриклеточный домен 4-1ВВ, соединенный с частью домена дзета-цепи CD3. Согласно другим вариантам внутриклеточный домен 4-1ВВ и внутриклеточный домен CD28 соединены с частью домена дзета-цепи CD3.
[00126] Полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, может быть легко получен из аминокислотной последовательности с помощью синтетических или рекомбинантных способов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида, кодирующего внутриклеточный сигнальный домен, другим полинуклеотидом, кодирующим другой внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего внутриклеточный сигнальный домен, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки млекопитающих представляют собой клетки человека.
Маркерные последовательности
[00127] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит одну или более маркерных последовательностей под контролем индуцируемого промотора. Маркерная последовательность может обеспечить отбор трансдуцированных клеток и/или выявление трансдуцированных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность предназначена для селекции трансдуцированных клеток и/или выявления трансдуцированных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность функционально соединена с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность линкера представляет собой расщепляемую последовательность линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой расщепляемый линкер Т2А.
[00128] Множество различных маркерных последовательностей может быть использовано. Как правило, маркерная последовательность обладает функциональной характеристикой, которая обеспечивает отбор трансдуцированных клеток и/или детектирование трансдуцированных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность совместима с трансдукцией лимфоцитов человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность обеспечивает отбор трансдуцированных клеток и/или детектирование трансдуцированных клеток.
[00129] Положительный селективный маркер может представлять собой ген, который при введении в клетку-хозяина экспрессирует доминирующий фенотип, обеспечивающий положительную селекцию клеток, несущих ген. Гены подходящего типа известны в данной области техники и включают, среди прочего, ген гигромицин-В фосфотрансферазы (hph), который придает устойчивость к гигромицину В, ген аминогликозидфосфотрансферазы (neo или aph) из Tn5, который кодирует устойчивость к антибиотику G418, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), который обеспечивает устойчивость к метотрексату, DHFR-Dm (типичные полинуклеотидные и аминокислотные последовательности представлены в таблице 14, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47, ген рас, который обеспечивает устойчивость к пуромицину, ген Sh ble, который инактивирует зеоцин, ген аденозиндезаминазы (ADA) и ген множественной лекарственной устойчивости (MDR). Трансдуцированные клетки, культивированные в присутствии указанных агентов, будут выживать и могут быть отобраны.
[00130] В другом варианте реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность. В другом варианте реализации настоящего изобретения маркерная последовательность представляет собой усеченный рецептор эпидермального фактора роста, представленный в таблице 2. Типичный полинуклеотид усеченного рецептора эпидермального фактора роста показан в таблице 1. (SEQ ID NO: 9). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность представляет собой усеченную последовательность HER2. Типичные полинуклеотидные и аминокислотные последовательности усеченной последовательности Her2 представлены в таблице 13 и в последовательностях SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 45, соответственно.
[00131] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим последовательность линкера. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения последовательность линкера представляет собой расщепляемую линкерную последовательность Т2А, представленную в таблице 2. Типичная полинуклеотидная последовательность, кодирующая линкер Т2А, представлена в таблице 1. (SEQ ID NO: 8).
[00132] Полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, может быть легко получен синтетическими или рекомбинантными способами из аминокислотной последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, также может содержать один или более сайтов рестрикции на 5'- и/или 3'-концах кодирующей последовательности, так, чтобы обеспечить легкое удаление и замену полинуклеотида, кодирующего маркерную последовательность, другим полинуклеотидом, кодирующим другую маркерную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения кодоны полинуклеотида, кодирующего маркерную последовательность, оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно у человека.
[00133] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут быть использованы две или более маркерные последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая маркерная последовательность находится под контролем конститутивного промотора и позволяет отслеживать экспрессию трансгена трансдуцированной клеткой. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вторая маркерная последовательность находится под контролем индуцируемого промотора и позволяет отслеживать индукцию экспрессии трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркер под контролем индуцируемого промотора можно использовать для отбора клеток, в которых уровень не индуцированной или исходной экспрессии значительно ниже, чем в других клетках, путем отбора клеток, которые имеют более низкую экспрессию маркерной последовательности под контролем индуцируемого промотора, и размножения указанных клеток для последующего применения.
Другие генетические компоненты, находящиеся под контролем индуцируемого промотора
[00134] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую гены, которые способствуют выживанию и пролиферации, гены, которые предотвращают апоптоз, и/или гены, которые ингибируют передачу сигналов с участием отрицательного регулятора контрольных точек под контролем индуцируемого промотора. Подходящие гены включают гены, кодирующие ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Bcl2, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28. Подходящие гены также находятся под контролем индуцируемого промотора, описанного в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гены кодируют ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Bcl2, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, кодирует полипептид, который ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[00135] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит первый индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим цитокин или рецептора хемокинов. Хемокины, также называемые хемотаксическими цитокинами, представляют собой группу структурно родственных белков, которые регулируют перемещение лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хемокины являются гомеостатическими или воспалительными. Рецепторы хемокинов включают CCR2, CCR7 или CCR15. К цитокинам относятся интерлейкины, такие как ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-7 и/или ИЛ-15, интерфероны, такие как интерферон 5, фактор некроза опухоли и агонист TLR4. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рецепторы хемокинов включают CCR2, CCR7 и/или CCR15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рецепторы хемокинов включают CCR2, CCR7 или CCR15. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитокины включают интерлейкины, причем интерлейкины представляют собой ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-7 и/или ИЛ-15, или интерфероны, причем интерфероны включают интерферон 5, фактор некроза опухоли или агонист TLR4.
[00136] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит первый индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, который регулирует апоптоз. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гены, которые ингибируют апоптоз, включают, например, BCL2 и/или CA-Akt. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид представляет собой Bcl2 или CA-Akt.
[00137] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота содержит первый индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольной точки. Подходящие гены включают Dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 и/или химеры PD-1CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид представляет собой dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 и/или химеры PD-1CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[00138] Типичные последовательности полинуклеотидов, кодирующих указанные гены, представлены ниже:
[00139] Любое количество нуклеиновых кислот может быть помещено под контроль индуцируемого промотора, включая гены, кодирующие химерный антигенный рецептор, маркерные последовательности, цитокин, хемокин, ингибитор апоптоза и/или ингибитор передачи сигналов с участием отрицательного регулятора контрольной точки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один или более индуцируемых промоторов могут быть использованы для обеспечения достаточного уровня экспрессии каждой из нуклеиновых кислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут быть получены конструкции, содержащие ген, такой как цитокин, под контролем индуцируемого промотора, и конструкция, содержащая химерный антигенный рецептор под контролем конститутивного промотора. Указанные конструкции могут быть использованы, чтобы обеспечить выживание и пролиферацию трансдуцированных клеток, например лимфоцитов, экспрессирующих химерный антигенный рецептор.
Конститутивные промоторные системы
[00140] Согласно другим вариантам реализации система содержит вторую нуклеиновую кислоту, которая содержит конститутивный промотор или второй индуцируемый промотор, соединенный с активатором транскрипции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения система содержит вторую нуклеиновую кислоту, которая содержит промотор, соединенный с активатором транскрипции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения промотор представляет собой конститутивный промотор или индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конститутивный промотор включает промотор EF1α, промотор актина, миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусные промоторы, такие как промотор CMV, исключаются. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения конститутивный промотор может быть соединен с одним или более из полинуклеотида, кодирующего маркер, или химерного антигенного рецептора, описанного в настоящем документе.
Конститутивные промоторы
[00141] Конститутивный промотор обеспечивает непрерывную экспрессию гена, находящегося под контролем промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конститутивный промотор представляет собой промотор, который обеспечивает экспрессию гена в лентивирусной конструкции и/или в лимфоцитах. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения промотор получен не из ксеногенного источника, такого как растение или вирус.
[00142] В конкретном варианте реализации настоящего изобретения конститутивный промотор включает промотор EF1α, промотор актина, миозина, промотор гемоглобина и/или промотор креатинкиназы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения исключены вирусные промоторы, такие как промотор CMV.
Активаторы транскрипции
[00143] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конститутивный промотор функционально соединен с активатором транскрипции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции активирует индуцируемый промотор в присутствии индуктора (например, лекарственного средства).
[00144] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор индуцируется в присутствии активатора транскрипции. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции предпочтительно связывается с промотором в присутствии лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции представляет собой TamR-tf (НЕА-3). В аминокислотную последовательность активатора транскрипции может быть введена модификация, которая оказывает влияние на способность активатора связываться со средством, промотором, или ими обоими. Например, связывание в лигандсвязывающем домене ER будет влиять на связывание лекарственного средства с активатором транскрипции.
[00145] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в системе применяется синтетический активатор транскрипции, который, в присутствии лекарственного средства (например, тамоксифена), связывается с синтетическим промотором, расположенным перед трансгеном, чтобы индуцировать экспрессию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции представляет собой TamR-tf (НЕА-3). Регулируемый тамоксифеном фактор транскрипции («TamR-tf», также обозначаемый «НЕА-3») представляет собой химерный фактор транскрипции, который состоит из субъединиц человека, включая N-концевой ДНК-связывающий домен ядерного фактора 1-альфа гепатоцитов (HNF-1α) (например, аминокислоты 1-281 из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40), гибридизованный в пределах открытой рамки считывания с мутированным тамоксифен-специфичным лиганд связывающим доменом из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD), который, в свою очередь, гибридизован с доменом активации р65 NF-κВ (р65). Типичная аминокислотная последовательность представлена в таблице 10 и определена как SEQ ID NO: 40. Мутированный тамоксифен-специфичный лигандсвязывающий домен из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD) расположен в участке с 282 по 595 остаток аминокислотной последовательности TamR-tf и содержит мутацию в положении 521. Домен активации р65 NF-κВ (р65 или TAD) расположен в участке с 596 по 862 остаток аминокислотной последовательности.
[00146] В активатор транскрипции могут быть внесены дополнительные изменения, чтобы увеличить свойства фактора транскрипции, включая, но не ограничиваются ими, изменения одной или более аминокислот в лигандсвязывающем домене рецептора эстрогена и/или изменения одной или более аминокислот в домене трансактивации р65. Изменение аминокислот в связывающем домене рецептора эстрогена может обеспечить более специфичное связывание лекарственного средства с активатором транскрипции. Пример активатора транскрипции с измененной последовательностью в ER-LBD представлен в таблице 11 (SEQ ID NO: 43). Мутации сделаны в положении аминокислоты 400, 543 и 544 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40. Активатор транскрипции с измененной последовательностью имеет повышенную аффинность в отношении тамоксифена или 4-ОНТ. Изменение аминокислот в домене трансактивации р65 может обеспечить повышенную экспрессию трансгена в отсутствие активации трансдуцированных клеток.
Маркер
[00147] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конститутивный промотор функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим маркерный полипептид. Подходящие маркерные полипептиды описаны в настоящем документе и включают EGFRt, Her2t и/или DHFRdm.
Химерный антигенный рецептор
[00148] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конститутивный промотор функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован, чтобы обеспечить повышенную пролиферацию Т-клеток и/или выработку цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с химерным эталонным рецептором. Примеры химерных антигенных рецепторов описаны в настоящем документе.
Векторы
[00149] Может быть сконструировано множество векторных комбинаций, чтобы обеспечить эффективность трансдукции и экспрессии трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой двойной упакованный или одиночный (все в одном) вирусный вектор. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения векторы могут включать комбинацию вирусных векторов и плазмидных векторов. Другие вирусные векторы включают пенистый вирус, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы и лентивирусные векторы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой лентивирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой пенистый вирусный вектор, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы или лентивирусные векторы.
[00150] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения плазмидный вектор или вирусный вектор содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения плазмидный вектор или вирусный вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотид, кодирующий ген, который увеличивает выживаемость клеток или пролиферацию, ген, который регулирует апоптоз, и/или ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование передачи сигналов с участием контрольных точек ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Подходящие полинуклеотиды кодируют цитокин или рецептор хемокина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения плазмидный вектор или вирусный вектор содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим маркерную последовательность. Маркерные последовательности описаны в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность совместима с трансдукцией лимфоцитов человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркерная последовательность обеспечивает отбор трансдуцированных клеток и/или детектирование трансдуцированных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения маркер представляет собой ген, который может включать, среди прочего, ген гигромицин-В-фосфотрансферазы (hph), который придает устойчивость к гигромицину В, ген аминогликозидфосфотрансферазы (neo или aph) из Tn5, который кодирует устойчивость к антибиотику G418, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), который обеспечивает устойчивость к метотрексату, DHFR-Dm (типичные полинуклеотидные и аминокислотные последовательности представлены в таблице 14, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47), ген рас, который обеспечивает устойчивость к пуромицину, ген Sh ble, который инактивирует зеоцин, ген аденозиндезаминазы (ADA) и/или ген множественной лекарственной устойчивости (MDR). Первая нуклеиновая кислота может содержать ряд различных полинуклеотидных последовательностей, все из которых находятся под контролем индуцируемого промотора. Например, полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, может быть связан с полинуклеотидом, кодирующим маркерный полипептид, и/или полинуклеотидом, кодирующим цитокин или рецептор хемокина.
[00151] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лентивирусный вектор содержит вторую нуклеиновую кислоту, содержащую конститутивный промотор, соединенный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей активатор транскрипции, который связывается с лекарственным средством и активирует экспрессию индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лентивирусный вектор, содержащий конститутивный промотор, также может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, включая маркерный ген, транспозазу piggyback и/или полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор. Каждый элемент нуклеиновой кислоты может быть отделен от другого последовательностью, такой как последовательность саморасщепляющегося линкера Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения элементы нуклеиновой кислоты отделены друг от друга саморасщепляющейся последовательностью. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения саморасщепляющаяся последовательность представляет собой Т2А.
[00152] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гетерогенная (гетерогенная по отношению к вектору, например, лентивирусному вектору) последовательность нуклеиновой кислоты ограничена количеством дополнительных генетических компонентов, которые могут быть упакованы в вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция содержит по меньшей мере два гена, гетерогенных по отношению к вирусному вектору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конструкция содержит не более 4 генов, гетерогенных по отношению к вирусному вектору. Число генов, гетерогенных по отношению к вирусному вектору, которые могут быть упакованы в вектор, может быть определено путем детектирования экспрессии одного или более трансгенов и отбора векторных конструкций, которые обеспечивают трансдукцию по меньшей мере 10% клеток и/или детектируемые уровни экспрессии трансгена в по меньшей мере 10% клеток.
[00153] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лентивирус представляет собой двойной упакованный вирус. Двойной упакованный вирус содержит по меньшей мере одну условную конструкцию, содержащую индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор. При необходимости условная конструкция содержит маркерный ген, нуклеиновую кислоту, кодирующую цитокин, нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор хемокинов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения двойной упакованный лентивирус содержит конститутивную конструкцию, содержащую конститутивный промотор. В другом варианте реализации настоящего изобретения конститутивная конструкция содержит конститутивный промотор, соединенный с активатором транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения конститутивная конструкция также содержит маркерный ген и/или полинуклеотид, кодирующий цитокин или хемокин. Согласно некоторым вариантам реализации системы с двумя конструкциями, каждая конструкция может быть упакована в отдельный вирусный вектор и вирусные векторы могут быть смешаны для трансдукции в клеточной популяции.
[00154] В случае если конститутивные и условные конструкции содержат маркерный ген, то маркерные гены в каждой конструкции могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если конститутивные и условные конструкции содержат полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, химерный антигенный рецептор может быть нацелен на один и тот же антиген, но на различные лигандсвязывающие домены, может быть нацелен на один и тот же антиген, но на различные эпитопы, или может быть нацелен на различные антигены.
[00155] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой миникольцо. Миникольца представляют собой эписомные ДНК-векторы, которые получают в виде кольцевой кассеты для экспрессии, которая не содержит бактериального плазмидного ДНК-остова. Небольшая молекулярная масса миниколец обеспечивает более эффективную трансфекцию и устойчивую экспрессию в течение недели по сравнению со стандартными плазмидными векторами, которые функционируют только в течение нескольких дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миникольцо содержит промотор, индуцируемый лекарственным средством, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор может быть связан с рецептором хемокина, маркерным геном, и/или цитокином. Можно применять одно или более миниколец. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения миникольцо содержит индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим первый химерный антигенный рецептор, другое миникольцо содержит индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим второй отличающийся химерный антигенный рецептор, и/или миникольцо содержит индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим рецептор хемокина, химерный антигенный рецептор и маркерный ген. Каждый элемент конструкций отделен нуклеиновой кислотой, например, кодирующей саморасщепляющуюся последовательность Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый элемент конструкций отделен нуклеиновой кислотой, например, кодирующей саморасщепляющуюся последовательность Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждое миникольцо отличается от другого химерным антигенным рецептором, включая, но не ограничиваясь ими, длину и последовательность спейсера, внутриклеточный сигнальный домен и/или маркерную последовательность. Вектор на основе миникольца может быть использован с конститутивным лентивирусным вектором, кодирующим активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор на основе миникольца используется с конститутивным лентивирусным вектором, кодирующим активатор транскрипции для индуцируемого промотора.
[00156] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой транспозон PiggyBac. Транспозон PiggyBac (РВ) представляет собой мобильный генетический элемент, который эффективно перемещается между векторами и хромосомами с помощью механизма «вырезания и вставки». Во время транспозиции транспозаза РВ распознает последовательности инвертированных концевых повторов (ITR), специфичные для транспозонов, расположенные на обоих концах транспозонного вектора, эффективно перемещает содержимое из исходных сайтов и эффективно встраивает его в хромосомные сайты ТТАА. Мощная активность транспозонной системы PiggyBac обеспечивает быструю мобилизацию представляющих интерес генов, расположенных между двумя ITR в векторе РВ, в целевые геномы.
[00157] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения РВ содержит промотор, индуцируемый лекарственным средством, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор может быть соединен с рецептором хемокина, маркерным геном и/или цитокином. Может быть использован один или более транспозонов РВ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения РВ содержит индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим первый химерный антигенный рецептор, другой РВ содержит индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим второй отличающийся химерный антигенный рецептор, и/или РВ содержит индуцируемый промотор, соединенный с полинуклеотидом, кодирующим рецептор хемокинов, химерный антигенный рецептор и маркерный ген. Каждый элемент конструкций отделен нуклеиновой кислотой, например, кодирующей саморасщепляющуюся последовательность Т2А. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый РВ отличается от другого химерным антигенным рецептором включая, но не ограничиваясь ими, длину и последовательность спейсера, внутриклеточный сигнальный домен и/или маркерную последовательность. Вектор РВ может быть использован с конститутивным лентивирусным вектором, кодирующим активатор транскрипции для индуцируемого промотора, и конститутивным вектором, содержащим транспозазу piggyback, соединенную с конститутивным промотором.
[00158] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена первая нуклеиновая кислота, содержащая первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен является специфичным в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты находятся в одном лентивирусном векторе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован, чтобы повысить пролиферацию Т-клеток и/или выработку цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[00159] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит маркерный ген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий второй отличающийся химерный антигенный рецептор. Первый и второй химерные антигенные рецепторы могут отличаться друг от друга по лигандсвязывающему домену, антигену-мишени, эпитопу антигена-мишени, длине и последовательности спейсера (короткий, средний или длинный), а также по внутриклеточному сигнальному домену.
[00160] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты в отдельной лентивирусной конструкции могут быть разделены с помощью геномной инсуляторной нуклеиновой кислоты, такой как инсуляторный домен хроматина морского ежа. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индуцируемый промотор первой нуклеиновой кислоты и конститутивный промотор второй нуклеиновой кислоты находятся в противоположной ориентации.
[00161] Один или более из указанных векторов могут быть использованы в комбинации друг с другом для трансдукции клеток-мишеней и обеспечивают индуцируемую экспрессию химерного антигенного рецептора.
Клетки-хозяева и композиции: популяции Т-лимфоцитов
[00162] Композиции, описанные в настоящем изобретении, обеспечивают генетически модифицированные клетки-хозяева совместно с векторами и/или конструкциями, описанными в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяев а представляют собой CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоциты.
[00163] Т-лимфоциты могут быть собраны в соответствии с известными методиками и обогащены или истощены с помощью известных методик, таких как аффинное связывание с антителами, например, проточная цитометрия и/или иммуномагнитная сортировка. После этапов обогащения и/или истощения размножение желаемых Т-лимфоцитов в условиях in vitro можно осуществлять в соответствии с известными методиками или их вариантами, которые будут очевидны специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки представляют собой аутогенные Т-клетки, полученные от пациента.
[00164] Например, желаемая популяция Т-клеток или субпопуляция может быть размножена путем добавления исходной популяции Т-лимфоцитов к культуральной среде в условиях in vitro, с последующим добавлением к культуральной среде фидерных клеток, таких как непролиферирующие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), (например, так, что конечная популяция клеток содержит по меньшей мере 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток МКПК для каждого Т-лимфоцита в исходной популяции, которую размножают); и инкубации культуры (например, в течение времени, достаточного для размножения Т-клеток). Неделящиеся фидерные клетки могут включать фидерные клетки МКПК, облученные гамма-лучами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МКПК облучают гамма-лучами в диапазоне от 3000 до 3600 рад, чтобы предотвратить деление клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения МКПК облучают гамма-лучами с интенсивностью 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 или 3600 рад или с применением любого значения интенсивности, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками из перечисленных значений, чтобы предотвратить деление клеток. Порядок добавления Т-клеток и фидерных клеток к культуральной среде может быть полностью изменен, при необходимости. Культуру, как правило, можно инкубировать при температуре и других условиях, которые пригодны для размножения Т-лимфоцитов. Для размножения Т-лимфоцитов человека, например, температура обычно будет по меньшей мере 25 градусов по Цельсию, предпочтительно по меньшей мере 30 градусов, более предпочтительно 37 градусов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения температура для размножения Т-лимфоцитов человека составляет 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37 градусов по Цельсию или соответствует любому другому значению температуры между любыми двумя конечными точками любого из перечисленных значений.
[00165] Размноженные Т-лимфоциты включают CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и CD4+ хелперные Т-лимфоциты, которые могут быть специфичными в отношении антигена, присутствующего на опухоли человека или патогене. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки включают клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
[00166] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ размножения может дополнительно включать добавление непролиферирующих EBV-трансформированных лимфобластных клеток (LCL) в качестве фидерных клеток. LCL могут быть облучены гамма-лучами в диапазоне от 6000 до 10000 рад. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения LCL облучают гамма-лучами с интенсивностью 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 или 10000 рад или с любым значением интенсивности, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя конечными точками из перечисленных значений, чтобы предотвратить деление клеток. Фидерные клетки LCL могут быть обеспечены в любом подходящем количестве, так, что соотношение фидерных клеток LCL и исходных Т-лимфоцитов составляет по меньшей мере 10:1.
[00167] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ размножения может дополнительно включать добавление антитела к CD3 и/или антитела к CD28 к культуральной среде (например, в концентрации по меньшей мере 0,5 нг/мл). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ размножения может дополнительно включать добавление ИЛ-2 и/или ИЛ-15 к культуральной среде (например, концентрация ИЛ-2 составляет по меньшей мере 10 Ед/мл).
[00168] После выделения Т-лимфоцитов цитотоксические и хелперные Т-лимфоциты могут быть рассортированы перед или после этапа размножения на субпопуляции наивных Т-клеток, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток.
[00169] CD8+ клетки могут быть получены с применением стандартных способов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ клетки далее сортируют на наивные клетки, клетки центральной памяти и клетки эффекторной памяти путем идентификации поверхностных антигенов клеток, которые связаны с каждым из указанных типов CD8+ клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки памяти присутствуют в обеих подгруппах, CD62L+ и CD62L-, CD8+ лимфоцитов периферической крови. МКПК сортируют на CD62L-CD8+ и CD62L+ CD8+ фракции после окрашивания с применением антител к CD8 и антител к CD62L. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экспрессия фенотипических маркеров Тем центральной памяти включает CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD 127 и уровень экспрессии гранзима В является низким или отсутствует. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки центральной памяти представляют собой CD45RO+CD62L+ и/или CD8+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные Те являются отрицательными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28 и/или CD127 и положительными в отношении экспрессии гранзима В и/или перфорина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD8+ Т-лимфоциты характеризуются экспрессией фенотипических маркеров наивных Т-клеток, включая CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 и/или CD45RA.
[00170] Хелперные CD4+ Т-клетки сортируют на наивные Т-клетки, Т-клетки центральной памяти и эффекторные Т-клетки путем выявления клеточных популяций, которые несут поверхностные антигены клеток. CD4+ лимфоциты могут быть получены стандартными способами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD4+ Т-лимфоциты включают CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ и/или CD4+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки центральной памяти включают CD62L+ и/или CD45RO+ клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные CD4+ клетки включают CD62L- и/или CD45RO- клетки.
[00171] Является ли клетка или клеточная популяция положительной в отношении конкретного поверхностного маркера клеток, можно определить методом проточной цитометрии путем окрашивания специфичными антителами к поверхностному маркеру и соответствующим антителом для контроля изотипа. Клеточная популяция, отрицательная в отношении экспрессии маркера, относится к отсутствию значительного окрашивания клеточной популяции специфичным антителом, по сравнению с окрашиванием антителом для контроля изотипа, положительная популяция относится к равномерному окрашиванию популяции клеток, по сравнению с окрашиванием антителом для контроля изотипа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения снижение экспрессии одного или более маркеров относится к уменьшению средней интенсивности флуоресценции на величину 1 log 10 и/или уменьшению процента клеток, которые несут маркер, составляющему по меньшей мере 20% клеток, 25% клеток, 30% клеток, 35% клеток, 40% клеток, 45% клеток, 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток и 100% клеток или любую величину от 20 до 100%, по сравнению с эталонной популяцией клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция клеток, положительная в отношении экспрессии одного или более маркеров, относится к проценту клеток, которые несут маркер, составляющему по меньшей мере 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток или 100% клеток и любую величину от 50 до 100%, по сравнению с эталонной популяцией клеток.
[00172] Является ли клетка или клеточная популяция положительной в отношении конкретного поверхностного маркера клеток, можно определить методом проточной цитометрии путем окрашивания специфичным антителом к поверхностному маркеру и соответствующим антителом для контроля изотипа. Клеточная популяция, отрицательная в отношении экспрессии маркера, относится к отсутствию значительного окрашивания клеточной популяции специфичным антителом, по сравнению с окрашиванием антителом для контроля изотипа, положительная популяция относится к равномерному окрашиванию популяции клеток, по сравнению с окрашиванием антителом для контроля изотипа. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения снижение экспрессии одного или более маркеров относится к уменьшению средней интенсивности флуоресценции на величину 1 log 10 и/или уменьшению процента клеток, которые несут маркер, составляющему по меньшей мере 20% клеток, 25% клеток, 30% клеток, 35% клеток, 40% клеток, 45% клеток, 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток и 100% клеток или любую величину от 20 до 100%, по сравнению с эталонной популяцией клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения увеличение относится к увеличению средней интенсивности флуоресценции и/или увеличению количества клеток в клеточной популяции, которые являются положительными в отношении одного или заданного маркера, такая как популяция, в которой s относится к проценту клеток, которые содержат маркер, составляющему 50% клеток, 55% клеток, 60% клеток, 65% клеток, 70% клеток, 75% клеток, 80% клеток, 85% клеток, 90% клеток, 95% клеток или 100% клеток и любую величину от 50 до 100%, например, по сравнению с эталонной популяцией клеток.
[00173] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяции CD4+ и CD8+ , которые являются антигенспецифичными, могут быть получены путем стимуляции наивных или антигенспецифичных Т-лимфоцитов антигеном. Например, антигенспецифичные линии Т-клеток или клоны могут быть получены для антигенов цитомегаловируса путем выделения Т-клеток от инфицированных субъектов и путем стимуляции клеток аналогичным антигеном в условиях in vitro. Также могут быть использованы наивные Т-клетки. Любое количество антигенов из опухолевых клеток может быть использовано в качестве мишеней для индукции Т-клеточных реакций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции для адоптивной клеточной иммунотерапии можно применять при лечении заболевания или расстройства, включая солидные опухоли, гематологические злокачественные новообразования, рак молочной железы или меланому. Модификация популяций Т-лимфоцитов
[00174] Согласно некоторым вариантам реализации желательным может быть введение функциональных генов в Т-клетки, которые будут применять в иммунотерапии в соответствии с настоящим изобретением. Например, введенный ген или гены могут улучшить эффективность терапии путем стимулирования жизнеспособности и/или функции перенесенных Т-клеток; или они могут обеспечить генетический маркер для отбора и/или оценки выживаемости или миграции в условиях in vivo; или они могут включать функции, которые улучшают безопасность иммунотерапии, например, путем придания клетке восприимчивости к контролируемой экспрессии трансгена. Введение гена можно осуществлять в соответствии с известными методиками, которые будут очевидны специалистам в данной области техники на основании настоящего описания.
[00175] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки модифицированы с применением вектора, кодирующего химерные рецепторы, индуцируемые лекарственным средством, описанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки модифицированы с применением вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, находящийся под контролем индуцируемого промотора. Согласно другим вариантам реализации клетки модифицированы с применением вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий цитокин, рецептор хемокинов, ген, который регулирует апоптоз, или ген, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, под контролем индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки получают от субъекта, подлежащего лечению, согласно другому варианту лимфоциты получают от аллогенных доноров-людей, предпочтительно здоровых доноров-людей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование передачи сигналов с участием контрольных точек ингибирует отрицательный регулятор контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек содержит VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[00176] Химерные рецепторы могут быть сконструированы так, чтобы обладать специфичностью в отношении любого поверхностного маркера клеток благодаря использованию антигенсвязывающих фрагментов или вариабельных областей антител, например, молекул антител. Антигенсвязывающие молекулы могут быть связаны с одним или более модулями для передачи сигналов в клетке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модули для передачи сигналов в клетке включают трансмембранные домены CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или трансмембранные домены CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный и сигнальный домены CD28, соединенные с внутриклеточным доменом дзета-цепи CD3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный рецептор также может содержать маркер трансдукции, такой как tEGFR.
[00177] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналогичный или другой химерный рецептор может быть введен в каждую из популяций CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный рецептор в каждой из указанных популяций содержит лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с аналогичным лигандом на опухоли или инфицированной клетке или с другим антигеном или эпитопом. Модули для передачи сигналов в клетке могут различаться. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутриклеточный сигнальный домен CD8+ цитотоксических Т-клеток аналогичен внутриклеточному сигнальному домену CD4+ Т-хелперов. Согласно другим вариантам реализации внутриклеточный сигнальный домен CD8+ цитотоксических Т-клеток отличается от внутриклеточного сигнального домена CD4+ Т-хелперов.
[00178] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из CD4 или CD8 Т-лимфоцитов может быть отсортирован в группу наивных Т-клеток, Т-клеток центральной памяти, Т-клеток эффекторной памяти или эффекторных клеток перед трансдукцией, описанной в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из CD4 или CD8 Т-лимфоцитов может быть отсортирован в группу наивных Т-клеток, Т-клеток центральной памяти, Т-клеток эффекторной памяти или эффекторных клеток после трансдукции. [00179] Как описано в настоящем изобретении, согласно некоторым вариантам
реализации настоящего изобретения наивные CD4+ клетки представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ и/или CD4+ положительные Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки центральной памяти представляют собой CD62L положительные и/или CD45RO положительные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L отрицательные и/или CD45RO положительные клетки. Каждая из этих популяций может быть независимо модифицирована с применением химерного рецептора.
[00180] Как описано в настоящем изобретении, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки памяти присутствуют в обеих подгруппах, CD62L+ и/или CD62L-, CD8+ лимфоцитов периферической крови. МКПК сортируют на фракции CD62L-CD8+ и/или CD62L+CD8+ после окрашивания с применением антител к CD8 и антител к CD62L. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экспрессия фенотипических маркеров Т-клеток центральной памяти (ТСМ) включает CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD 127 и низкий уровень экспрессии гранзима В или отсутствие его экспрессии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки центральной памяти включают CD45RO+, CD62L+ и/или CD8+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффекторные Т-клетки (Те) являются отрицательными в отношении экспрессии CD62L, CCR7, CD28 и/или CD 127, и положительными в отношении экспрессии гранзима В и/или перфорина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наивные CD8+ Т-лимфоциты характеризуются как CD8+ , CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+CD127+ и/или CD45RO+. Каждая из этих популяций может быть независимо модифицирована с применением химерного рецептора.
[00181] Были разработаны различные методы трансдукции, в которых для доставки генов используются частицы рекомбинантных инфекционных вирусов. Описанный подход в настоящее время является предпочтительным для трансдукции Т-лимфоцитов согласно настоящему изобретению. Вирусные векторы, которые были использованы таким способом, включают вирусные векторы, полученные из вируса обезьян 40, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), лентивирусных векторов и/или ретровирусов. Соответственно, известны многочисленные способы переноса и экспрессии генов, однако основной их задачей является введение и экспрессия генетического материала в клетках млекопитающих. Некоторые из указанных выше методик были использованы для трансдукции кроветворных или лимфоидных клеток, включая трансфекцию с применением фосфата кальция, слияние протопластов и инфекцию рекомбинантным аденовирусом, аденоассоциированным вирусом и ретровирусными векторами. Первичные Т-лимфоциты были успешно трансдуцированы методом электропорации и путем инфицирования ретровирусами или лентивирусами.
[00182] Ретровирусные и лентивирусные векторы обеспечивают высокоэффективный способ переноса генов в эукариотические клетки. Помимо этого, интеграция ретровирусов или лентивирусов происходит контролируемым образом и приводит к стабильной интеграции одной или более копий новой генетической информации на клетку.
[00183] Предполагается, что избыточная экспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для индивидуума, которого лечат. Следовательно, в объем настоящего изобретения включены сегменты генов, которые придают Т-клеткам согласно настоящему изобретению восприимчивость к отрицательному отбору в условиях in vivo. Термин «отрицательный отбор» подразумевает, что клетка после инъекции может быть устранена в результате изменения состояния индивидуума в условиях in vivo. Фенотип, подходящий для отрицательной селекции, может возникнуть в результате введения гена, который придает чувствительность к введенному агенту, например, соединению. Другие гены, подходящие для отрицательного отбора, известны в данной области техники и включают, помимо всего прочего, следующие: ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа I (HSV-I ТК), который придает чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT) и ген бактериальной цитозиндезаминазы. [00184] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение в Т-клетки положительного маркера, который позволяет отбирать клетки, имеющие отрицательный селективный фенотип, в условиях in vitro может обеспечить преимущество. Положительный селективный маркер может представлять собой ген, который при введении в клетку-хозяина экспрессирует доминантный фенотип, обеспечивающий положительную селекцию клеток, несущих ген. Гены указанного типа известны в данной области техники и включают, среди прочего, ген гигромицин-В-фосфотрансферазы (hph), который придает устойчивость к гигромицину В, ген аминогликозидфосфотрансферазы (neo или aph) из Tn5, который кодирует устойчивость к антибиотику G418, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), ген аденозиндезаминазы (ADA), и/или ген множественной лекарственной устойчивости (MDR).
[00185] Для трансдукции Т-лимфоцитов могут быть использованы различные способы, хорошо известные в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансдукцию осуществляют с применением лентивирусных векторов.
[00186] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждая из CD4+ и CD8+ клеток может быть по отдельности модифицирована с применением вектора экспрессии, кодирующего химерный рецептор, чтобы получить определенные популяции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки могут быть модифицированы по отдельности с помощью вектора, содержащего полинуклеотид под контролем конститутивного промотора, и вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий цитокин или рецептор хемокина под контролем индуцируемого промотора.
[00187] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные клетки затем дополнительно сортируют на субпопуляции наивных клеток, клеток центральной памяти и эффекторных клеток, описанных выше, путем сортировки на основании экспрессии поверхностных антигенов клеток, уникальных для каждой из указанных клеточных популяций. Помимо этого, популяции клеток CD4+ или CD8+ могут быть отобраны на основании их цитокинового профиля или пролиферативной активности. Например, могут быть отобраны CD4+ Т-лимфоциты, которые при стимуляции антигеном имеют повышенную выработку цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-альфа и/или ИФН-гамма, по сравнению с контрольными трансдуцированными клетками или трансдуцированными CD8+ клетками. Согласно другим вариантам могут быть отобраны наивные CD4+ Т-клетки или CD4+ Т-клетки центральной памяти, которые имеют повышенную выработку ИЛ-2 и/или ФНО-альфа. Аналогичным образом, могут быть отобраны CD8+ клетки, которые имеют повышенную выработку ИФН-гамма, по сравнению с контрольными трансдуцированными CD8+ клетками.
[00188] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отбирают CD4+ и CD8+ клетки, которые являются цитотоксическими по отношению к клеткам, несущим антиген. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки, как ожидается, будут обладать незначительной цитотоксичностью по сравнению с CD8+ клетками. В предпочтительном варианте отбирают трансдуцированные лимфоциты, такие как CD8+ клетки центральной памяти, которые вызывают гибель опухолевых клеток в условиях in vivo в животной модели, общепринятой для исследования конкретного типа рака
[00189] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения отбирают трансдуцированные Т-клетки, экспрессирующие химерный рецептор, которые могут сохраняться в условиях in vivo в животной модели, общепринятой для исследования конкретного типа рака. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения было показано, что трансдуцированные CD8+ клетки центральной памяти, экспрессирующие химерный рецептор и содержащие короткий спейсерный участок, сохраняются в условиях in vivo после введения в организм животного в течение приблизительно 3 дней или более, 10 дней или более, 20 дней или более, 30 дней или более, 40 дней или более, или 50 дней или более.
[00190] В настоящем изобретении предложено применение комбинаций CD4+ и CD8+ Т-клеток в композициях. В одном варианте реализации настоящего изобретения комбинации трансдуцированных CD4+ клеток, экспрессирующих химерный рецептор, можно комбинировать с трансдуцированными CD8+ клетками, экспрессирующими химерный рецептор, которые обладают специфичностью в отношении аналогичного лиганда, или комбинировать с CD8+ Т-клетками, которые являются специфичными в отношении другого опухолевого лиганда. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения трансдуцированные CD8+ клетки, экспрессирующие химерный рецептор, комбинируют с трансдуцированными CD4+ клетками, экспрессирующими химерный рецептор, которые специфичны в отношении другого лиганда, экспрессируемого на опухоли. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения трансдуцированные CD4+ клетки, экспрессирующие химерный рецептор, комбинируют с трансдуцированными CD8+ клетками, экспрессирующими химерный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ и CD4+ клетки можно комбинировать в различных соотношениях, например, в соотношении CD8+ и CD4+ 1:1, в соотношении CD8+ и CD4+ 10:1, или в соотношении CD8+ и CD4+ 100:1, или в любом другом соотношении CD8+ и CD4+ , величина которого находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из указанных соотношений. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения комбинированную популяцию исследуют для оценки пролиферации клеток в условиях in vitro и/или в условиях in vivo, и отбирают соотношение клеток, которое обеспечивает пролиферацию клеток.
[00191] Популяции клеток предпочтительно размножают в условиях in vitro после трансдукции и/или отбора клеток, несущих химерный рецептор, для получения достаточного количества клеток, чтобы обеспечить по меньшей мере одну инфузию субъекту-человеку, как правило, приблизительно от 104 клеток/кг до 109 клеток/кг. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансдуцированные клетки культивируют в присутствии клеток, несущих антиген, антител к CD3, антител к CD28, ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-15 или ИЛ-21, или их комбинаций.
[00192] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отбирают CD4+ и CD8+ клетки, которые пролиферируют в ответ на стимуляцию цитокинами, антигенами-мишенями или опухолевыми мишенями в условиях in vitro или в условиях in vivo. Например, отбирают CD4+ или CD8+ трансдуцированные клетки, которые интенсивно пролиферируют при стимуляции антителами к CD3 и/или антителами к CD28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения стимуляция транс дуцированных клеток обеспечивает усиленную экспрессию трансгенов в присутствии индуктора (например, лекарственного средства) указанных трансгенов под контролем индуцируемого промотора.
[00193] Каждую из субпопуляций CD4+ и CD8+ клеток можно комбинировать с другой. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения модифицированные наивные CD4+ клетки или CD4+ клетки центральной памяти комбинируют с модифицированными CD8+ Т-клетками центральной памяти, чтобы обеспечить синергическое цитотоксическое действие на клетки, несущие антиген, такие как опухолевые клетки. Композиции
[00194] В настоящем изобретении предложены композиции для адоптивной клеточной иммунотерапии, содержащие препарат генетически модифицированных Т-лимфоцитов, описанных в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения препарат Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий внеклеточную вариабельную область антитела, специфичную в отношении лиганда, связанного с заболеванием или расстройством, спейсерный участок, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен рецептора Т-клеток или других рецепторов под контролем промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного в настоящем изобретении. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция для адоптивной клеточной иммунотерапии дополнительно содержит препарат опухолеспецифичных CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, модифицированных химерным рецептором, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, причем препарат цитотоксических Т-лимфоцитов содержит CD8+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий внеклеточное одноцепочечное антитело, специфичное в отношении лиганда, связанного с заболеванием или расстройством, спейсерный участок, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен рецептора Т-клеток под контролем промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция Т-клеток, модифицированных химерным рецептором согласно настоящему изобретению, может сохраняться в условиях in vivo в течение по меньшей мере 3 дней или дольше. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения каждую из указанных популяций можно комбинировать с другой популяцией или с другими типами клеток, чтобы обеспечить композицию.
[00195] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хелперный CD4+ Т-лимфоцит представляет собой наивные CD4+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки центральной памяти, CD4+ Т-клетки эффекторной памяти или общую популяцию CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хелперный CD4+ лимфоцит представляет собой наивную CD4+ Т-клетку, причем указанная наивная CD4+ Т-клетка включает CD45RO-, CD45RA+, и/или представляет собой CD62L+CD4+ Т-клетку.
[00196] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой наивную CD8+ Т-клетку, CD8+ Т-клетку центральной памяти, CD8+ Т-клетку эффекторной памяти и/или клетку из общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой Т-клетку центральной памяти, причем указанная Т-клетка центральной памяти включает CD45RO+, CD62L+и/или CD8+ Т-клетку. Согласно другим вариантам цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой Т-клетку центральной памяти, и хелперный CD4+ Т-лимфоцит представляет собой наивную CD4+ Т-клетку или CD4+ Т-клетку центральной памяти.
[00197] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции содержат клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции содержат гемопоэтические стволовые клетки. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Способы
[00198] В настоящем изобретении предложены способы получения композиций для адоптивной иммунотерапии и их применения, или способы применения указанных композиций для осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ изготовления композиций включает получение модифицированных наивных или хелперных CD4+ Т-клеток центральной памяти, причем указанный препарат модифицированных хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, который специфичен в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен под контролем индуцируемого промотора, описанного в настоящем документе. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки содержат рецептор цитокина или хемокина под контролем индуцируемого промотора.
[00199] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способ дополнительно включает получение модифицированных CD8+ Т-клеток центральной памяти, причем препарат указанных модифицированных CD8 Т-лимфоцитов центральной памяти содержит CD8+ клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, спейсерный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен под контролем индуцируемого промотора, описанного в настоящем документе. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки содержат цитокин или рецептор хемокина под контролем индуцируемого промотора.
[00200] Промотор, индуцируемый лекарственным средством, в обеих подгруппах клеток, модифицированных CD4+ Т-клетках и модифицированных CD8+ цитотоксических Т-клетках, может быть идентичным или может различаться. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в одной популяции клеток промотор, соединенный с химерным антигенным рецептором, представляет собой конститутивный промотор, и в другой популяции промотор представляет собой индуцируемый промотор. Например, модифицированные CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен под контролем конститутивного промотора, тогда как CD8+ цитотоксическая Т-клетка включает CD8+ клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен под контролем индуцируемого промотора. [00201] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид может кодировать химерный антигенный рецептор, который отличается в CD4+ по сравнению с популяцией CD8+ клеток. Различие между двумя конструкциями может включать специфичность или аффинность лигандсвязывающего домена в отношении антигена или эпитопа, длину и последовательность спейсера и внутриклеточные сигнальные компоненты.
[00202] Получение CD4+ и CD8+ клеток, которые модифицированы химерным рецептором, описано в тексте настоящего документа. Антигенспецифичные Т-лимфоциты могут быть получены от пациента, имеющего заболевание или расстройство, или могут быть получены путем стимуляции Т-лимфоцитов в условиях in vitro в присутствии антигена. Субпопуляции CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов, которые не подвергают отбору в отношении антигенной специфичности, также могут быть выделены, как описано в настоящем документе, и комбинированы в способах изготовления.
[00203] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения комбинацию популяций клеток можно оценить для определения однородности поверхностных клеточных маркеров и способности пролиферировать на протяжении по меньшей мере двух поколений, чтобы получить одинаковый статус дифференцировки клеток. Контроль качества можно осуществлять путем совместного культивирования клеточной линии, экспрессирующей лиганд-мишень, с модифицированными Т-клетками, несущими химерный рецептор, и лекарственным средством, который индуцирует экспрессию химерного антигенного рецептора, чтобы определить, распознают ли модифицированные Т-клетки, несущие химерный рецептор, клеточную линию с использованием количественных исследований цитотоксичности, пролиферации или выработки цитокинов в присутствии индуктора, которые известны в данной области техники. Статус дифференцировки клеток и поверхностные клеточные маркеры на модифицированных Т-клетках, несущих химерный рецептор, могут быть определены методом проточной цитометрии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения статус дифференцировки клеток и маркеры на CD8+ клетках включают CD3, CD8, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4, CD45RO и/или CD45RA. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения статус дифференцировки клеток и маркеры на CD4+ клетках включают CD3, CD4, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4 CD45RO и/или CD45RA.
[00204] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные Т-клетки, несущие химерный рецептор, описанные в настоящем изобретении, могут сохраняться в условиях in vivo в течение по меньшей мере 3 дней или по меньшей мере 10 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модифицированные Т-клетки, несущие химерный рецептор, могут размножаться в условиях in vivo на протяжении по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 поколений, согласно результатам определения по разбавлению красителя CFSE. Пролиферацию и сохранение модифицированных Т-клеток, несущих химерный рецептор, можно определить с применением животной модели заболевания или расстройства, и путем введения клеток и определения сохранения и/или пролиферативной способности перенесенных клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения пролиферацию и активацию можно исследовать в условиях in vitro, используя несколько циклов активации с применением клеток, несущих антиген.
[00205] В настоящем изобретении также предложены способы проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство, включающие: введение композиции лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор под контролем промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного в настоящем документе, и введение лекарственного средства.
[00206] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен, его варианты, производные, фармацевтические соли, сольваты и гидраты, описанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство вводят перед, одновременно с композицией или позднее после того как композиция была введена.
[00207] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство вводят совместно с композицией, и, если наблюдают токсическое действие композиции, введение лекарственного средства прекращают до момента уменьшения токсического действия. После уменьшения симптомов токсичности лекарственное средство вводят снова. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство может быть введен снова после уменьшения симптомов токсичности.
[00208] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство вводят одновременно с композицией, однако после того как у субъекта наблюдают уменьшение опухолевой нагрузки или раковых клеток, введение средства прекращают на определенный периода времени, чтобы обеспечить период покоя модифицированным клеткам и, если активность модифицированных клеток отсутствует, модифицированные клетки не требуются вследствие ремиссии рака.
[00209] Согласно другим вариантам реализации способ включает введение субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат цитотоксических Т-лимфоцитов содержит CD8+ Т-клетки, которые содержат химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем лигандсвязывающий домен является специфичным в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, спейсерный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен под контролем промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного в настоящем документе, и/или препарата генетически модифицированных хелперных Т-лимфоцитов, что индуцирует непосредственное распознавание опухоли и увеличивает способность препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов вызывать клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, спейсерный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен под контролем конститутивного промотора или промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного выше, и введение лекарственного средства, который индуцирует индуцируемый промотор. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения введение лекарственного средства осуществляют после введения композиции или клеток-хозяев, причем введение осуществляют 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 2 недели, 4 недели или два месяца, или любой промежуток времени, который находится в диапазоне, определенном любыми двумя перечисленными значениями времени.
[00210] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов, что обеспечивает клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат цитотоксических Т-лимфоцитов содержит CD8+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен под контролем конститутивного промотора, описанного в настоящем документе, и/или препарата генетически модифицированных хелперных Т-лимфоцитов, который вызывает непосредственное распознавание опухоли и увеличивает способность препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов вызывать клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые несут химерный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный участок, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен под контролем конститутивного промотора или промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного в настоящей заявке, и введение лекарственного средства, индуцирующего индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой поверхностную молекулу опухоли.
[00211] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение субъекту препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат цитотоксических Т-лимфоцитов содержит CD8+ Т-клетки, которые экспрессируют цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, и/или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, под контролем индуцируемого промотора, описанного в настоящем документе, и/или препарата генетически модифицированных хелперных Т-лимфоцитов, который индуцирует непосредственное распознавание опухоли и увеличивает способность препарата генетически модифицированных цитотоксических Т-лимфоцитов вызывать клеточный иммунный ответ, причем указанный препарат хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4 Т-клетки, которые экспрессируют цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, и/или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, под контролем конститутивного промотора или промотора, индуцируемого лекарственным средством, описанного в настоящем документе, и введение лекарственного средства, индуцирующего индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или более из клеточных популяций экспрессируют химерный антигенный рецептор под контролем конститутивного промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модулирование передачи сигналов с участием контрольных точек ингибирует отрицательный регулятор контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3.
[00212] Эффективное количество лекарственного средства для индукции представляет собой количество лекарственного средства, которое обеспечивает индукцию химерного антигенного рецептора по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, или на любое процентное значение, которое находится в пределах диапазона, определенного любыми двумя из перечисленных процентных значений трансдуцированных клеток.
[00213] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения описан способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство, включающий: исследование биологического образца субъекта для определения присутствия молекулы-мишени, связанной с заболеванием или расстройством, и введение композиций для адоптивной иммунотерапии, описанных в настоящем документе, и введение лекарственного средства, который индуцирует индуцируемый промотор, причем указанный химерный рецептор специфично связывается с молекулой-мишенью.
[00214] Субъекты, которые могут получить лечение согласно настоящему изобретению, в целом включают человека и других субъектов-приматов, таких как обезьяны и человекообразные обезьяны, для ветеринарных целей. Субъекты могут быть мужского или женского пола, и могут иметь любой подходящий возраст, включая младенцев, малолетних детей, подростков, взрослых и гериатрических субъектов.
[00215] Указанные способы можно применять в лечении или ингибировании, например, гематологических злокачественных новообразований, меланомы, рака молочной железы, рака мозга и других эпителиальных злокачественных новообразований или солидных опухолей. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекула, связанная с заболеванием или расстройством, представляет собой орфанный тирозинкиназный рецептор ROR1, Her2, EGFR, СЕ7, hB7H3, CD19, CD20, CD22, мезотелин, СЕА или поверхностный антиген вируса гепатита В.
[00216] Субъекты, которые могут получить лечение с использованием способов, описанных в настоящем документе, включают субъектов, у которых выявлен рак или которые отобраны, как имеющие рак, включая, но не ограничиваясь перечисленными, рак толстой кишки, рак легких, рак печени, рак молочной железы, рак почек, рак простаты, рак яичников, рак кожи (включая меланому), рак костей, рак мозга и т.д. Идентификацию или отбор можно проводить с помощью клинической или диагностической оценки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения известны ассоциированные с опухолью антигены или молекулы, например, меланомы, рака молочной железы, рака мозга, плоскоклеточной карциномы, рака толстой кишки, лейкемии, миеломы и/или рака предстательной железы. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения ассоциированные с опухолью молекулы могут являться мишенью генетически модифицированных Т-клеток, экспрессирующих модифицированный химерный рецептор. Примеры включают, но не ограничиваются ими, В-клеточную лимфому, рак молочной железы, рак мозга, рак предстательной железы и/или лейкемию.
[00217] Клетки, полученные с помощью описанных выше способов, могут быть использованы в способах и композициях для адоптивной иммунотерапии в соответствии с известными методиками или их разновидностями, которые будут очевидны специалистам в данной области техники на основании настоящего описания.
[00218] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки получают путем сбора их из культуральной среды с последующим промыванием и концентрированием клеток в среде и контейнере, пригодном для введения («фармацевтически приемлемый» носитель) в терапевтически эффективном количестве. Подходящая среда для инфузии может представлять собой любой изотонический жидкий состав, как правило, нормальный физиологический раствор, Normosol R (Abbott) или Plasma-Lyte A (Baxter), также можно использовать 5% раствор декстрозы в воде или раствор Рингера с лактатом. Среда для инфузии может быть дополнена сывороточным альбумином человека, эмбриональной бычьей сывороткой или другими компонентами сыворотки человека.
[00219] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтическое или ингибирующее эффективное количество клеток в композиции представляет собой трансдуцированные CD4 или CD8 клетки или по меньшей мере 2 подгруппы клеток (например, 1 подгруппа представляет собой CD8+ Т-клетки центральной памяти и 2 подгруппа представляет собой CD4+ Т-хелперы) или обычно количество составляет более чем 102 клеток и вплоть до 106, вплоть до или равное 108 или 109 клеток, и может быть более 1010 клеток. Количество клеток будет зависеть от конечной цели применения, для которой предназначена композиция, а также типа клеток, включенных в нее. Например, если желательны клетки, которые являются специфичными в отношении конкретного антигена, то популяция будет содержать более 70%, обычно более 80%, 85% и 90-95% указанных клеток. В отношении вариантов применения, предложенных в настоящем изобретении, клетки обычно обеспечены в объеме 1 литр или менее, или 500 мл или менее, или 250 мл или 100 мл или менее, или в любом объеме, который находится в пределах диапазона, определенного двумя конечными точками любого из перечисленных значений. Следовательно, плотность желаемых клеток, как правило, более 104 клеток/мл и обычно более 107 клеток/мл, обычно 108 клеток/мл или более. Клинически значимое количество иммунных клеток может быть распределено на несколько инфузий, которые совокупно обеспечивают количество клеток, которое соответствует или превышает 10б, 107, 108, 108, 109, 1010 или 1011 клеток или любое количество клеток, которое находится в пределах диапазона, определенного двумя конечными точками из перечисленных значений.
[00220] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лимфоциты могут быть использованы для обеспечения индивидуумов иммунитетом. Термин «иммунитет» означает облегчение одного или более физических симптомов, связанных с ответом на инфекцию патогеном, или на опухоль, на которую направлен ответ лимфоцитов. Количество вводимых клеток обычно находится в диапазоне, который наблюдают у нормальных индивидуумов с иммунитетом к возбудителю. Следовательно, клетки обычно вводят путем инфузий, причем с каждой инфузией вводят от 2 клеток и вплоть до по меньшей мере 106-3×1010 клеток, предпочтительно в диапазоне от по меньшей мере 107 до 109 клеток. Т-клетки могут быть введены с помощью однократной инфузии или нескольких инфузий в течение какого-либо периода времени. Однако поскольку ожидается, что различные индивидуумы имеют различную восприимчивость, тип и количество клеток, вводимых с помощью инфузий, а также количество инфузий и период времени, в течение которого проводят несколько инфузий, определяются лечащим врачом и могут быть определены с помощью стандартного исследования. Получение достаточных уровней Т-лимфоцитов (включая цитотоксические Т-лимфоциты и/или хелперные Т-лимфоциты) может быть легко достигнуто с применением способа быстрого размножения согласно настоящему изобретению, который приведен в качестве примера в настоящем документе
[00221] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композицию, описанную в настоящем документе, вводят выявленным субъектам или отобранным субъектам, имеющим меланому, рак молочной железы, рак мозга, плоскоклеточную карциному, рак толстой кишки, лейкемию, миелому и/или рак предстательной железы, внутривенно, внутрибрюшинно, внутриопухолево, в костный мозг, в лимфатический узел и/или в спинномозговую жидкость. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции, содержащие модифицированные химерные рецепторы, доставляют в очаг опухоли. Согласно другому варианту композиции, описанные в настоящем документе, можно комбинировать с соединением, которое направляет клетки к опухоли или в компартменты иммунной системы, и при этом указанные композиции не обладают направленным действием на такие органы как легкие.
[00222] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции, описанные в настоящем документе, вводят с химиотерапевтическими агентами и/или иммунодепрессантами. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пациенту сначала вводят химиотерапевтический агент, который ингибирует или разрушает другие иммунные клетки, с последующим введением композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых случаях применение химиотерапии может не требоваться.
[00223] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ включает введение модифицированных Т-клеток, описанных в настоящем документе, в комбинации с индуктором (например, индуцирующим лекарственным средством) до тех пор, пока не будет достигнуто уменьшение опухолевой массы. После уменьшения опухолевой массы введение индуцирующего лекарственного средства может быть прекращено для подавления экспрессии химерного антигенного рецептора и уменьшения количества Т-клеток, экспрессирующих рецептор. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индуцирующий лекарственное средство можно вводить в разное время, чтобы активировать экспрессию химерного антигенного рецептора в случае рецидива или увеличения роста опухоли.
[00224] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения индуцирующий лекарственное средство можно вводить в течение нескольких дней, недель или месяцев, и затем прекратить введение средства в течение нескольких дней, недель или месяцев, с последующим повторным введением индуцирующего лекарственного средства в течение нескольких дней, недель или месяцев, чтобы обеспечить циклическую экспрессию химерного антигенного рецептора, чтобы избежать анергии или невосприимчивости из-за хронической стимуляции клеток.
Конструирование вектора и получение двойного упакованного лентивируса
[00225] Был сконструирован индуцируемый лентивирусный вектор, кодирующий 7xHBD/mElb-CD19t-her2t-T2A-epHIV7). CD 1 α-специфичные химерные рецепторы были сконструированы с использованием: (1) сегментов цепи VL и VH С019-специфичного MAT FMC63 (SEQ ID NO: 3), соединенных линкерным (G4S)3 (SEQ ID NO: 12) пептидом (УЬ-линкер-УН); (2) спейсерного домена, полученного только из шарнирной области IgG4-Fc (12 аминокислот, кодируемый (SEQ ID NO: 4)). Спейсеры содержали замену S→Р в пределах шарнирной области, расположенную в положении 108 нативного белка IgG4-Fc; 27 аминокислотного трансмембранного домена CD28 человека (база данных UniProt: Р10747 (SEQ ID NO: 14)); (4) сигнального модуля, содержащего (I) цитоплазматический домен CD28 человека, содержащий 41 аминокислоту, с заменой LL→GG, расположенной в положении 186-187 нативного белка CD28 (SEQ ID NO: 14); и/или (II) цитоплазматический домен 4-1 ВВ человека, содержащий 42 аминокислоты (база данных UniProt: Q07011, (SEQ ID NO: 15)); соединенного с (III) цитоплазматическим доменом изоформы 3 CD3+ человека, содержащим 112 аминокислот (база данных UniProt: Р20963 (SEQ ID NO: 16)).
[00226] Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие CD19t, были соединены с последовательностями, кодирующими Her2t (SEQ ID NO: 44); и с саморасщепляющейся последовательностью Т2А (SEQ ID NO: 8).
[00227] Был сконструирован условный лентивирусный вектор, кодирующий 7xHBD/mEFlap-ZsGreen-epHIV7. Синтетический промотор 7xHBD/mEFlap был сконструирован путем комбинирования семи минимальных сайтов связывания ядерного фактора-1 гепатоцитов (HNF-1), клонированных из промотора альбумина человека и блока TATA промотора huEFla, и имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41. Следовательно, только в присутствии тамоксифена связывание НЕА-3 с промотором 7xHBD/EFlmp индуцирует состояние «ON» экспрессии трансгенов.
[00228] Был сконструирован условный лентивирусный вектор, кодирующий 7xHBD/mEFlap-CD19t-T2A-DHFRdm epHIV7. COIII-специфичные химерные рецепторы были построены с использованием: (1) сегментов цепи VL и VH С019-специфичного MAT FMC63 (SEQ ID NO: 3), соединенных (G4S)3 линкерным (SEQ ID NO: 12) пептидом (VL-линкер-УН); (2) спейсерного домена, полученного только из шарнирной области IgG4-Fc (12 аминокислот, кодируемых последовательностью (SEQ ID NO: 4)). Спейсеры содержали замену S -» Р в пределах шарнирной области, расположенную в положении 108 нативного белка IgG4-Fc; 27 аминокислотный трансмембранный домен CD28 человека (база данных UniProt: Р10747 (SEQ ID NO: 14)); (4) сигнального модуля, содержащего (I) цитоплазматический домен CD28 человека, содержащий 41 аминокислоту, с заменой LL^ GG, расположенной в положении 186-187 нативного белка CD28 (SEQ ID NO: 14); и/или (II) цитоплазматический домен 4-1 ВВ человека, содержащий 42 аминокислоты (база данных UniProt: Q07011, (SEQ ID NO: 15)); соединенный с (III) цитоплазматическим доменом изоформы 3 CD3C, человека, содержащим 112 аминокислот (база данных UniProt: Р20963 (SEQ ID NO: 16)).
[00229] Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие CD19t, были соединены с последовательностями, кодирующими саморасщепляющуюся последовательность Т2А (SEQ ID NO: 8); и DHFRdm (SEQ ID NO: 46)
[00230] Регулятор транскрипции, HEA-3, представляет собой химерный фактор транскрипции, состоящий из субъединиц человека, включая N-концевой ДНК-связывающий домен ядерного фактора 1-альфа гепатоцитов (HNF-la), гибридизованный в открытой рамке считывания с мутированным тамоксифен-специфичным лигандсвязывающим доменом из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD), который в свою очередь гибридизован с доменом активации р65 из NF-кВ (р65). В отсутствие тамоксифена НЕА-3 исключается из ядра вследствие связывания цитозольного белка теплового шока 90 (HSP90) с активным сайтом связывания тамоксифена и экспрессия трансгена переключается в состояние «OFF». Тамоксифен, присутствующий в наномолярных концентрациях в цитозоле, активно конкурирует с HSP90 за связывание с ER-LBD, что приводит к транслокации НЕА-3 в ядро. После ядерной транслокации НЕА-3 легко доступен для связывания со своим специфичным синтетическим промотором. Транскрипционная восприимчивость к НЕА-3 в присутствии тамоксифена достигается, когда трансгены расположены после НЕА-3 чувствительного синтетического промотора (7xHBD/EFlmp).
[00231] Конститутивная конструкция была сконструирована с использованием конститутивного промотора EF-la, соединенного с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции НЕА-3 (SEQ ID NO: 39) и маркерную последовательность EGFRt (SEQ ID NO: 9).
[00232] Нуклеотидные последовательности, содержащие оптимизированные кодоны для экспрессии у человека, кодирующие каждый трансген, были синтезированы (Lifetechnologies, Carlsbad, CA) и клонированы в лентивирусный вектор epHIV7 с использованием сайтов рестрикции Nhel и Notl. Лентивирусный вектор epHIV7 был получен из вектора pHIV7 путем замены промотора цитомегаловируса pHIV7 промотором EF-1.
[00233] Индуцируемый лентивирус, кодирующий химерный рецептор CD19, и конститутивный лентивирус нарабатывали в клетках 293Т, котрансфицированых лентивирусным вектором и упаковочными векторами pCHGP-2, pCMV-Rev2 и pCMV-G с использованием реагента для трансфекции Calphos (Clontech). Среду заменяли через 16 часов после трансфекции, и лентивирус собирали через 24, 48 и 72 часа. Получение Т-клеточных линий Jurkat, экспрессирующих химерные рецепторы CD19 и ZsGreen после индукции тамоксифеном
[00234] Клетки Jurkat трансдуцировали супернатантом лентивируса (MOI=3), дополненным 1 мкг/мл полибрена (Millipore), на 3-й день после активации путем центрифугирования при 2100 оборотах в минуту в течение 45 минут при 32°С. Т-клетки размножали в RPMI, содержащей 10% сыворотки человека, 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина (среда ЦТЛ), дополненной рекомбинантным (rh) ИЛ-2 человека до конечной концентрации 50 ед/мл через каждые 48 часов.
Дополнительные варианты
[00235] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован, полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и Ь) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EFlap. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус.Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер.
[00236] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, хемокин, полипептид, который регулирует апоптоз, и/или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно примерному варианту реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор под контролем конститутивного промотора.
[00237] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены композиции для обеспечения и/или усиления иммунных ответов, опосредованных клеточной иммунотерапией, например, путем адоптивного переноса специфичной подгруппы опухолеспецифичных, генетически модифицированных CD4+ Т-клеток, в которых CD4+ Т-клетки придают и/или усиливают способность CD8+ Т-клеток поддерживать противоопухолевую реактивность и увеличивать и/или максимально увеличивать опухолеспецифичную пролиферацию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения CD4+ клетки генетически модифицированы для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор, и/или полипептида химерного рецептора под контролем регулируемого промотора, описанного в настоящем документе.
[00238] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены композиции для обеспечения и/или усиления иммунных ответов, опосредованных клеточной иммунотерапией, например, путем адоптивного переноса специфичной подгруппы опухолеспецифичных, генетически модифицированных CD8+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения CD8+ Т-клетки экспрессируют нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный рецептор, и/или полипептид химерного рецептора под контролем регулируемого промотора, описанного в настоящем документе.
[00239] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство, путем введения субъекту генетически модифицированного лекарственного препарата Т-лимфоцитов, который обеспечивает клеточный иммунный ответ, и введения лекарственного средства, который индуцирует трансген в генетически модифицированных Т-лимфоцитах.
[00240] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяции генетически модифицированных CD8+ и генетически модифицированных CD4+ клеток вводят совместно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Т-клетки представляют собой аутогенные или аллогенные Т-клетки. Возможны различные модификации описанного выше способа. Например, химерные рецепторы, которые экспрессируются CD4+ Т-клеткой и CD8+ Т-клеткой, могут быть идентичными или могут различаться.
[00241] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp.Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором.
[00242] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула представляет собой CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелин, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 или MAGE A3 TCR, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор или конститутивный промотор.
[00243] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен полипептид химерного рецептора, причем указанный полипептид химерного рецептора кодируется системой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем лиганд связывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, причем лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующий активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор.
[00244] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий транс мембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующий активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
[00245] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция, причем указанная композиция содержит клетки-хозяева в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту; содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующий активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и дополнительно содержит другую клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин является предшественником Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
[00246] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения клетки-хозяина в условиях in vitro, причем указанный способ включает: а) обеспечение системы, и b) введение системы в отдельную выделенную популяцию Т-лимфоцитов и размножение каждой популяции Т-лимфоцитов в условиях in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лиганд связывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующий активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в которых применяют размножение Т-лимфоцитов, способ дополнительно включает культивирование клеток в присутствии антитела к CD3 и/или антитела к CD28 и по меньшей мере одного гомеостатического цитокина до момента получения достаточного количества клеток, пригодного для применения в качестве инфузии. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения лимфоцит представляет собой CD8+ или CD4+ клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин является клеткой-предшественником Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
[00247] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение клетки-хозяина или композиции в комбинации с лекарственным средством, который индуцируют экспрессию трансгена в клетке-хозяине или композиции для лечения рака или вирусной инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующий активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и d) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и d) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент.Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция выделенных Т-лимфоцитов содержит клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-предшественники Т-лимфоцитов представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и другую клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак представляет собой солидную опухоль или гематологическое злокачественное новообразование. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака мозга, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин является предшественником Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
[00248] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего рак или вирусную инфекцию, причем указанный способ включает введение композиции или клетки-хозяина субъекту и введение лекарственного средства, который индуцирует экспрессию трансгена в композиции или клетках-хозяевах. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом, полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен, и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD 19, CD20, CD22, CD23, CD 123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующий активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, полинуклеотидом, кодирующим трансмембранный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения спейсер оптимизирован для увеличения пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин содержит систему. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и b) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен; и с) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой тамоксифен и/или его метаболиты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой EF1αp. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно составляет первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно составляет второй вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения оба вектора упакованы в вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирус. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая и вторая нуклеиновые кислоты составляют вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лиганд связывающий домен, причем указанный лигандсвязывающий домен специфичен в отношении лиганда, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий транс мембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, причем указанная первая нуклеиновая кислота функционально соединена с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, который регулирует апоптоз, или полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек; и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор является конститутивным или индуцируемым. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептид, который модулирует передачу сигналов с участием контрольных точек, ингибирует отрицательные регуляторы контрольных точек. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отрицательный регулятор контрольных точек включает VISTA, LAG-3 и/или TIM3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, содержащий лигандсвязывающий домен, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, при этом указанный лиганд может индуцировать распознавание, модулирование, ингибирование и/или устранение лимфоцитом; полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, причем указанный спейсер оптимизирован; полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR или их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и другую клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак выбран из солидной опухоли или гематологического злокачественного новообразования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака мозга, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения популяция выделенных Т-лимфоцитов содержит клетки-предшественники Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-предшественники Т-лимфоцитов представляют собой гемопоэтические стволовые клетки. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит клетку-хозяина, причем указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, или хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбиранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток, и вторую клетку-хозяина, причем указанная вторая клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-предшественник Т-лимфоцитов представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
Дополнительные варианты
[00249] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, который способен активировать транскрипцию первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии, причем указанная система включает: а) индуцируемый промотор, b) полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, и с) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции способен активировать транскрипцию индуцируемого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, причем указанный полинуклеотид функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство или его метаболит содержит: (i) лекарственное средство, который переносится при ежедневном или еженедельном введении субъекту-человеку, или его метаболит; (ii) молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно с рецептором эстрогена, или ее метаболит; и/или (iii) тамоксифен и/или его метаболит или аналог тамоксифена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит: (а) ДНК-связывающий домен; (b) лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом; и (с) домен трансактивации, необязательно соединенные и/или гибридизованные в указанном порядке. Согласно некоторым вариантам реализации системы (а) ДНК-связывающий домен содержит участки связывания ДНК, которые не присутствуют в природном белке, экспрессируемом в лимфоците, или не присутствуют в белке, экспрессируемом в природных условиях в Т-клетке; и/или (b) лекарственное средство или метаболит представляет собой молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно рецептором эстрогена, или ее метаболит, и связывание лекарственного средства или метаболита и лигандсвязывающего домена является селективным для лигандсвязывающего домена по сравнению с рецептором человека, в результате чего связывание лигандсвязывающего домена с лекарственным средством или метаболитом сильнее, необязательно по меньшей мере в 1,5, 2, 3, или 4 раза сильнее, чем связывание с рецептором человека; и/или (с) домен транс активации содержит домен трансактивации р65 или его функциональный вариант; и/или (d) первый промотор содержит один или более сайтов связывания для ДНК-связывающего домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор не содержит другой сайт связывания для любого ДНК-связывающего домена человека, за исключением ДНК-связывающего домена или доменов, присутствующих в активаторе транскрипции; и/или указанный первый промотор представляет собой синтетический химерный промотор и/или активатор транскрипции представляет собой синтетический химерный активатор транскрипции; и/или указанный ДНК-связывающий домен содержит ДНК-связывающий домен, присутствующий в ядерном факторе гепатоцитов, который необязательно представляет собой HNF1-альфа или HNF1-бета. Согласно некоторым вариантам реализации указанной системы первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой или содержит промотор EF1α или его функциональную часть. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота входит в состав первого вектора, который дополнительно входит в состав системы, и вторая нуклеиновая кислота входит в состав второго вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота, или первый промотор, полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, второй промотор, и полинуклеотид, кодирующий транс активатор, входят в состав вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации системы указанная система входит в состав отдельного упакованного вирусного вектора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный со вторым промотором.
[00250] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии, причем указанная система содержит: а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор и функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, ингибирующий апоптоз, или полипептид, который ингибирует передачу сигнала с участием отрицательного регулятора контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, который представляет собой конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, способный индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, или аналога. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный антигенный рецептор, который необязательно представляет собой химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит а) лигандсвязывающий домен, который связывается с лигандом, который необязательно представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, которая способна опосредовать распознавание и устранение лимфоцитом, b) полипептидный спейсер, причем указанный спейсер необязательно обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, с) трансмембранный домен, и d) внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, MAGE A3 TCR и их комбинаций.
[00251] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен полипептид химерного рецептора, кодируемый системой. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, который способен активировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии, причем указанная система содержит: а) индуцируемый промотор, b) полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, и с) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции способен активировать транскрипцию индуцируемого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, причем указанный полинуклеотид функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство или его метаболит включает: (i) лекарственное средство или его метаболит, который переносится при ежедневном или еженедельном введении субъекту-человеку; (ii) молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно с рецептором эстрогена, или ее метаболит; и/или (iii), тамоксифен и/или его метаболит, или аналог тамоксифена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит: (а) ДНК-связывающий домен; (b) лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом; и (с) домен трансактивации, которые необязательно соединены и/или гибридизованы в указанном порядке. Согласно некоторым вариантам реализации системы (а) ДНК-связывающий домен содержит участки связывания ДНК не присутствующие в белке, экспрессируемом в природных условиях в лимфоците, или не присутствующие в белке, экспрессируемом в природных условиях в Т-клетке; и/или (b) лекарственное средство или метаболит представляет собой молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно рецептором эстрогена, или ее метаболит, и связывание лекарственного средства или метаболита с лигандсвязывающим доменом является селективным для лигандсвязывающего домена по сравнению с рецептором человека, в результате связывание лигандсвязывающего домена с лекарственным средством или метаболитом сильнее, необязательно по меньшей мере в 1,5, 2, 3 или 4 раза сильнее, чем связывание с рецептором человека; и/или (с) домен трансактивации содержит домен транс активации р65 или его функциональный вариант; и/или (d) первый промотор содержит один или более сайтов связывания для ДНК-связывающего домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор не содержит другой сайт связывания для любого ДНК связывающего домена, за исключением домена или доменов, присутствующих в активаторе транскрипции; и/или в котором первый промотор представляет собой синтетический химерный промотор и/или активатор транскрипции представляет собой синтетический химерный активатор транскрипции; и/или в котором ДНК-связывающий домен включает ДНК-связывающий домен, присутствующий в ядерном факторе гепатоцитов, который необязательно представляет собой HNF1-альфа или HNF1-бета. В настоящем изобретении предложена система по любому из пп. 1-8, в которой первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой или содержит промотор EF1α или его функциональную часть. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота входит в состав первого вектора, который дополнительно входит в состав системы, и вторая нуклеиновая кислота входит в состав второго вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота, или первый промотор, полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, второй промотор и полинуклеотид, кодирующий трансактиватор, входят в состав вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации системы указанная система входит в состав отдельного упакованного вирусного вектора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный со вторым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор и функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, ингибирующий апоптоз, или полипептид, который ингибирует передачу сигналов с участием отрицательного регулятора контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, который представляет собой конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующий активатор транскрипции, способный индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита или аналога. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный антигенный рецептор, который необязательно представляет собой химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит: а) лигандсвязывающий домен, который связывается с лигандом, который необязательно представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, которая способна опосредовать распознавание и устранение лимфоцитом, b) полипептидный спейсер, причем указанный спейсер необязательно обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, с) трансмембранный домен, и d) внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR и их комбинаций.
[00252] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая систему или упакованный вирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, который способен активировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии, причем указанная система содержит: а) индуцируемый промотор, b) полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, и с) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции способен активировать транскрипцию с индуцируемого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, причем указанный полинуклеотид функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство или его метаболит содержит: (i) лекарственное средство или его метаболит, который переносится при ежедневном или еженедельном введении субъекту-человеку; (ii) молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно с рецептором эстрогена, или ее метаболит; и/или (iii), тамоксифен и/или его метаболит или аналог тамоксифена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит: (а) ДНК-связывающий домен; (b) лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом; и (с) домен трансактивации, которые необязательно соединены и/или гибридизованы в указанном порядке. Согласно некоторым вариантам реализации системы (а) ДНК-связывающий домен содержит участки связывания ДНК не присутствующие в белке, экспрессируемом в природных условиях в лимфоците, или не присутствующие в белке, экспрессируемом в природных условиях в Т-клетке; и/или (b) лекарственное средство или метаболит представляет собой молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно рецептором эстрогена, или ее метаболит, и связывание лекарственного средства или метаболита с лигандсвязывающим доменом является селективным для лигандсвязывающего домена по сравнению с рецептором человека, в результате связывание лигандсвязывающего домена с лекарственным средством или метаболитом сильнее, необязательно по меньшей мере в 1,5, 2, 3, или 4 раза сильнее, чем связывание с рецептором человека; и/или (с) домен транс активации содержит домен трансактивации р65 или его функциональный вариант; и/или (d) первый промотор содержит один или более сайтов связывания для ДНК-связывающего домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор не содержит другой сайт связывания для любого ДНК-связывающего домена, за исключением домена или доменов, присутствующих в активаторе транскрипции; и/или указанный первый промотор представляет собой синтетический химерный промотор и/или активатор транскрипции представляет собой синтетический химерный активатор транскрипции; и/или указанный ДНК-связывающий домен включает ДНК-связывающий домен, присутствующий в ядерном факторе гепатоцитов, который необязательно представляет собой HNF1-альфа или HNF1-бета. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой или содержит промотор EF1α или его функциональную часть. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота входит в состав первого вектора, который дополнительно входит в состав системы, и вторая нуклеиновая кислота входит в состав второго вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота, или первый промотор, полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, второй промотор и полинуклеотид, кодирующий трансактиватор, входят в состав вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система, описанная выше, входит в состав отдельного упакованного вирусного вектора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный со вторым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор и функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, ингибирующий апоптоз, или полипептид, который ингибирует передачу сигналов с участием отрицательного регулятора контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, который представляет собой конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, способный индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита или аналога. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный антигенный рецептор, который необязательно представляет собой химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит: а) лигандсвязывающий домен, который связывается с лигандом, который необязательно представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, которая способна опосредовать распознавание и устранение лимфоцитом, b) полипептидный спейсер, причем указанный спейсер необязательно обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, с) трансмембранный домен, и d) внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR, и их комбинаций.
[00253] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, причем указанная клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит: а) нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичных лимфоцитах человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК-связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с большей аффинностью с любой молекулой, которая присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток.
[00254] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена композиция, причем указанная композиция содержит клетки-хозяева в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит а) нуклеиновую кислоту, включающую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК-связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с более высокой аффинностью с любой молекулой, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток.
[00255] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения клетки-хозяина в условиях in vitro, причем указанный способ включает введение системы в отдельную выделенную популяцию Т-лимфоцитов и размножение каждой популяции Т-лимфоцитов в условиях in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит а) нуклеиновую кислоту, включающую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК-связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с более высокой аффинностью с любой молекулой, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим химерный антигенный рецептор, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, который способен активировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии, причем указанная система содержит: а) индуцируемый промотор, b) полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, и с) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции способен активировать транскрипцию с индуцируемого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, причем указанный полинуклеотид функционально соединен с индуцируемым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лекарственное средство или его метаболит содержит: (i) лекарственное средство или его метаболит, который переносится при ежедневном или еженедельном введении субъекту-человеку; (ii) молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно с рецептором эстрогена, или ее метаболит; и/или (iii), тамоксифен и/или его метаболит или аналог тамоксифена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции содержит: (а) ДНК-связывающий домен; (b) лигандсвязывающий домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом; и (с) домен трансактивации, которые необязательно соединены и/или гибридизованы в указанном порядке. Согласно некоторым вариантам реализации системы (а) ДНК-связывающий домен содержит участки связывания ДНК, которые не присутствуют в белке, экспрессируемом в природных условиях в лимфоците, или не присутствуют в белке, экспрессируемом в природных условиях в Т-клетке; и/или (b) лекарственное средство или метаболит приставляет собой молекулу, которая специфично связывается с рецептором человека, необязательно с рецептором эстрогена, или ее метаболит, и связывание лекарственного средства или метаболита с лигандсвязывающим доменом является селективным для лигандсвязывающего домена по сравнению с рецептором человека, в результате связывание лигандсвязывающего домена с лекарственным средством или его метаболитом сильнее, необязательно по меньшей мере в 1,5, 2, 3, или 4 раза сильнее, чем связывание с рецептором человека; и/или (с) домен трансактивации содержит домен трансактивации р65 или его функциональный вариант; и/или (d) первый промотор содержит один или более сайтов связывания для ДНК-связывающего домена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор не содержит другой сайт связывания для любого ДНК-связывающего домена, за исключением домена или доменов, присутствующих в активаторе транскрипции; и/или указанный первый промотор представляет собой синтетический химерный промотор и/или активатор транскрипции представляет собой синтетический химерный активатор транскрипции; и/или указанный ДНК-связывающий домен содержит ДНК-связывающий домен, присутствующий в ядерном факторе гепатоцитов, который необязательно представляет собой HNF1-альфа или HNF1-бета. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 41. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой конститутивный промотор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения второй промотор представляет собой или содержит промотор EF1α или его функциональную часть. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 40. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота входит в состав первого вектора, который дополнительно входит в состав системы, и вторая нуклеиновая кислота входит в состав второго вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота, или первый промотор, полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, второй промотор и полинуклеотид, кодирующий трансактиватор, входят в состав вектора, который дополнительно входит в состав системы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система входит в состав отдельного упакованного вирусного вектора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер, или указанная система дополнительно содержит селектируемый маркер, функционально соединенный со вторым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система содержит а) первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, который представляет собой индуцируемый промотор и функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим цитокин, рецептор хемокина, полипептид, ингибирующий апоптоз, или полипептид, который ингибирует передачу сигналов с участием отрицательного регулятора контрольных точек, и b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй промотор, который представляет собой конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, способный индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита или аналога. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный антигенный рецептор, который необязательно представляет собой химерный антигенный рецептор. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения химерный антигенный рецептор содержит а) лигандсвязывающий домен, который связывается с лигандом, который необязательно представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, которая способна опосредовать распознавание или устранение лимфоцитом, b) полипептидный спейсер, причем указанный спейсер необязательно обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, с) трансмембранный домен, и d) внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, СЕ7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, MAGE A3 TCR и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения размножают популяции Т-лимфоцитов, причем указанный способ дополнительно включает культивирование клеток в присутствии антитела к CD3 и/или антитела к CD28, и по меньшей мере одного гомеостатического цитокина до тех пор, пока не будет получено достаточное количество клеток, пригодное для инфузии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения культивирование клеток в присутствии антитела к CD3 и/или антитела к CD28, и по меньшей мере одного гомеостатического цитокина может осуществлять перед или после введения системы.
[00256] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение клетки-хозяина или композиции в комбинации с лекарственным средством или его метаболитом для лечения рака или вирусной инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит а) нуклеиновую кислоту, включающую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК-связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с более высокой аффинностью с любой молекулой, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом наполнителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит а) нуклеиновую кислоту, включающую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с более высокой аффинностью с любой молекулой, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток и хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток.
[00257] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка и лекарственное средство для применения в лечении или ингибировании рака или вирусной инфекции, причем указанная клетка содержит: (а) полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который специфично связывается с антигеном, связанным с раком или вирусной инфекцией, (b) индуцируемый синтетический промотор, и (с) активатор транскрипции, содержащий домен связывания ДНК, который специфично связывается с синтетическим промотором, и домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и способен индуцировать транскрипцию с синтетического промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак представляет собой солидную опухоль или гематологическое злокачественное новообразование. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рак легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников.
[00258] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего рак или вирусную инфекцию, причем указанный способ включает введение композиции или клетки-хозяина субъекту и введение лекарственного средства или его метаболита, индуцируя тем самым экспрессию с промотора. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит а) нуклеиновую кислоту, включающую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК-связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который специфично связывается с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с более высокой аффинностью с любой молекулой, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита, и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает клетку-хозяина в фармацевтически приемлемом наполнителе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой первичный лимфоцит человека, причем указанная клетка-хозяин содержит а) нуклеиновую кислоту, включающую первый промотор, который представляет собой индуцируемый синтетический промотор, содержащий сайт связывания для ДНК-связывающего домена, который не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и b) полинуклеотид, кодирующий активатор транскрипции, причем указанный активатор транскрипции содержит i) ДНК-связывающий домен, причем указанный ДНК-связывающий домен не связывается специфично с последовательностью ДНК, которая не присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека; ii) домен, который связывается специфично с лекарственным средством или его метаболитом и не связывается или не связывается с аналогичной аффинностью с любой молекулой, которая присутствует в природных условиях в первичном лимфоците человека, и iii) домен трансактивации, причем указанный активатор транскрипции способен индуцировать транскрипцию с первого промотора в присутствии лекарственного средства или его метаболита и/или после связывания лекарственного средства или его метаболита с доменом, указанным в (ii). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который необязательно функционально соединен с первым промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка дополнительно содержит второй промотор, который функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим активатор транскрипции, причем указанный второй промотор необязательно является конститутивным. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция включает цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток, и хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рак выбран из солидной опухоли или гематологического злокачественного новообразования. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения солидная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников.
[00259] Другой аспект настоящего изобретения включает генетическую систему для обеспечения экспрессии трансгена, регулируемей лекарственным средством, в клетках, например, экспрессии рекомбинантного белка, регулируемой лекарственным средством, такого как рекомбинантный антигенный рецептор и/или молекулы, экспрессируемой клеткой, экспрессирующей рекомбинантный антигенный рецептор. В другом варианте реализации настоящего изобретения системы для регулируемой экспрессии трансгена конструируют и/или содержатся в клетках, таких как лимфоциты, например, для применения в адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная иммунотерапия. Указанные системы обеспечивают хорошие показатели безопасности для видов клеточной терапии, таких как адоптивные терапевтические стратегии на основе химерного антигенного рецептора (CAR), как правило, без ухудшения лечебного предназначения. В некоторых аспектах указанные особенности позволяют клиницисту контролировать в режиме реального времени экспрессию рекомбинантного белка, например, экспрессию CAR, в условиях in vivo. С помощью конструирования векторов, которые обеспечивают восприимчивый к лекарственному средству контроль транскрипции рекомбинантного гена, например, CAR, экспрессия, активность рекомбинантного гена, например, CAR, и/или других клеточных медиаторов может быть включена в состояние «ON» и «OFF» в условиях in vivo, например, на основании введения фармацевтического лекарственного средства, назначенного клиницистом, который проявляет клинически приемлемую фармакокинетику, тканевое распределение и разделение между внеклеточным пространством и цитозолем лимфоцитов. Генетическая система обеспечивает экспрессию трансгенов, регулируемую лекарственным средством, чтобы обеспечить функциональное состояние «OFF» в отсутствие лекарственного средства и функциональное состояние «ON» экспрессии трансгена в присутствии лекарственного средства.
[00260] Одним из вариантов подходящего лекарственного средства является тамоксифен. Тамоксифен является антагонистом эстрогена/частичным агонистом, который одобрен FDA и является коммерчески доступным лекарственным средством. Тамоксифен предназначен для приема внутрь и его можно вводить ежедневно в течение длительного периода времени. Тамоксифен имеет доказанные показатели безопасности, благоприятный фармакокинетический профиль, превосходное распределение в тканях и низкий коэффициент распределения между внеклеточным пространством и цитозолем. Помимо этого, могут быть использованы функциональные аналоги тамоксифена. Другие лекарственные средства могут быть выбраны, например, на основе показателей безопасности, благоприятного фармакокинетического профиля, превосходного распределения в тканях, низкого коэффициента распределения между внеклеточным пространством и цитозолем и/или низкой токсичности.
[00261] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в системе применяется синтетический регулятор транскрипции, например, синтетический активатор транскрипции, который в присутствии тамоксифена может быть индуцирован для связывания с синтетическим промотором, функционально соединенным, например, в направлении 5'-конца относительно трансгена, чтобы вызвать экспрессию с промотора, например, трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, описанным в настоящем документе, активатор транскрипции регулируется лекарственным средством или его метаболитом, таким как тамоксифен-регулируемый активатор транскрипции или фактор транскрипции, который может регулироваться, например, индуцироваться под действием тамоксифена или его аналога, или его метаболита. Типичные факторы транскрипции, регулируемые тамоксифеном, представляют собой химерные факторы транскрипции, такие как те, которые содержат ДНК-связывающий домен, который специфичен в отношении синтетического промотора системы, домен, который специфично связывается с тамоксифеном и/или его метаболитом(ми), например, с аффинностью, превышающей аффинность домена в отношении природной молекулы, такой как эстроген, и домен трансактивации, такой как активный домен трансактивации. Один фактор транскрипции, регулируемый тамоксифеном («TamR-tf», также обозначаемый «НЕА-3»), представляет собой химерный фактор транскрипции, состоящий из субъединиц человека, включая N-концевой ДНК-связывающий домен ядерного фактора 1-альфа гепатоцитов (HNF-1α), гибридизованный в одной открытой рамке считывания с мутированной (G521R) тамоксифен-специфичной формой лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD), который связывается с метаболитами тамоксифена с высокой аффинностью, по сравнению с эстрогеном, который в свою очередь гибридизован с доменом активации р65 NF-κВ (р65). Типичная аминокислотная последовательность TamR-tf приведена в таблице 10 и определена как SEQ ID NO: 40. В указанной последовательности мутированная тамоксифен-специфичная форма лигандсвязывающего домена из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD) находится на участке с 282 по 595 остаток аминокислотной последовательности TamR-tf и содержит мутацию в положении 521, по сравнению с лигандсвязывающим доменом рецептора эстрогена дикого типа. Домен активации р65 NF-κВ (р65) находится на участке с 596 по 862 остаток аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40. Изменения могут быть внесены в активатор транскрипции, например, для увеличения свойств фактора транскрипции, включая, но не ограничиваясь ими, изменение одной или более аминокислот в лигандсвязывающем домене рецептора эстрогена для увеличения аффинности фактора в отношении аналогов эстрогена и изменение одной или более аминокислот в домене трансактивации р65. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в активатор транскрипции внесены изменения, которые позволяют получить измененный фактор транскрипции, который сохраняет или по существу сохраняет одну или более функций tamR-tf, таких как тамоксифен-специфичное связывание и/или аналогичную или по существу аналогичную или по меньшей мере аналогичную специфичность в отношении тамоксифена или метаболита по сравнению с любой природной молекулой, по меньшей мере аналогичную или приблизительно аналогичную функцию специфичного связывания ДНК, и/или аналогичную или по меньшей мере аналогичную степень активности трансактивации.
[00262] В отсутствие тамоксифена активатор транскрипции, например, TamR-tf, как правило, исключен из ядра вследствие связывания цитозольного белка теплового шока 90 (HSP90) с активным сайтом связывания тамоксифена, в результате этого экспрессия трансгена, функционально соединенного с tamR-tf-индуцируемым промотором, находится в состоянии «OFF». Тамоксифен, присутствующий в наномолярных концентрациях в цитозоле, активно конкурирует с HSP90 за связывание с ER-LBD, что приводит к транслокации TamR-tf в ядро. После ядерной транслокации TamR-tf становится легко доступен для связывания со специфичным синтетическим промотором (например, 7×HBD/EF1αp). В присутствии тамоксифена связывание TamR-tf с синтетическим промотором, например, промотором 7×HBD/EF1αp, индуцирует состояние «ON» экспрессии трансгена, функционально соединенного с синтетическим промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный регулятор транскрипции может быть изменен, чтобы обеспечить ту или иную степень контроля экспрессии трансгена. Аминокислотные замены в LBD TamR-tf обеспечивают селективную восприимчивость к тамоксифену и его метаболитам, причем 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ) является наиболее фармакологически активным метаболитом, в отношении активности TamR-tf, при этом взаимодействие с эндогенным эстрогеном отсутствует. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена система для индуцируемой экспрессии химерного антигенного рецептора, причем указанная система содержит: первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый промотор, индуцируемый лекарственным средством, функционально соединенный с полинуклеотидом, например, кодирующим химерный антигенный рецептор, химерный антигенный рецептор, необязательно содержащий лигандсвязывающий домен, причем лигандсвязывающий домен связывается с лигандом, при этом лиганд представляет собой опухолеспецифичную молекулу, вирусную молекулу или любую другую молекулу, экспрессируемую на популяции клеток-мишеней, которая способна опосредовать распознавание и устранение лимфоцитом, полипептидный спейсер, причем указанный спейсер необязательно обеспечивает увеличение пролиферации Т-клеток и/или выработки цитокинов в ответ на лиганд по сравнению с эталонным химерным рецептором, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения система дополнительно содержит вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор транскрипции для индуцируемого промотора, который способен модулировать, например, активировать, транскрипцию с первого промотора, например, в присутствии лекарственного средства или его метаболита; как правило, система содержит второй конститутивный или индуцируемый промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей модулятор транскрипции.
[00263] Согласно некоторым вариантам реализации индуцируемой системы первый промотор функционально соединен с полинуклеотидом, кодирующим ген, который способствует выживанию и пролиферации клеток, ген, который предотвращает апоптоз, и/или ген, который ингибирует передачу сигналов с участием отрицательного регулятора контрольных точек. Подходящие гены включают гены, кодирующие ИЛ-2, ИЛ-15, рецепторы хемокинов, Bcl2, CA-Akt, dn-TGFbetaRIII, dn-SHP1/2 или химеры PD-1CD28.
[00264] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в системе применяется синтетический активатор транскрипции, который, в присутствии лекарственного средства (например, тамоксифена) или его метаболита, например, после введения лекарственного средства, подвергается индукции и приобретает возможность связываться с синтетическим промотором, расположенным в направлении 5'-конца относительно трансгена для индукции экспрессии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции представляет собой TamR-tf (НЕА-3) или другой тамоксифен-индуцируемый активатор транскрипции с аналогичными доменами. Регулируемый тамоксифеном фактор транскрипции («TamR-tf», также обозначаемый «НЕА-3») представляет собой химерный фактор транскрипции, состоящий из субъединиц человека, включая N-концевой ДНК-связывающий домен ядерного фактора 1-альфа гепатоцитов (HNF-1α) (например, аминокислоты 1-281 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40), гибридизованный в одной открытой рамке считывания с мутированным тамоксифен-специфичным лигандсвязывающим доменом из лигандсвязывающего домена рецептора эстрогена (ER-LBD), который, в свою очередь, гибридизован с доменом активации р65 NF-κВ (р65).
[00265] Согласно некоторым вариантам реализации композиций, описанных в настоящем документе, хелперный CD4+ Т-лимфоцит представляет собой наивные CD4+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки центральной памяти, CD4+ Т-клетки эффекторной памяти или клетку из общей популяции CD4+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения хелперный CD4+ Т-лимфоцит представляет собой наивную CD4+ Т-клетку, причем указанная наивная CD4+ Т-клетка включает CD45RO-, CD45RA+ и/или представляет собой CD62L+ CD4+ Т-клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% клеток в композиции представляют собой CD4+ клетки; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% клеток в композиции или CD4+ клетки в композиции представляют собой наивные CD4+ Т-клетки, CD4+ Т-клетки центральной памяти, CD4+ Т-клетки эффекторной памяти или общую популяцию CD4+ Т-клеток.
[00266] Согласно некоторым вариантам реализации композиций, описанных в настоящем документе, цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой наивную CD8+ Т-клетку, CD8+ Т-клетку центральной памяти, CD8+ Т-клетку эффекторной памяти и/или общую популяцию CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой Т-клетку центральной памяти, причем указанная Т-клетка центральной памяти содержит CD45RO+, CD62L+ и/или CD8+ Т-клетку. В других вариант цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит представляет собой Т-клетку центральной памяти и хелперный CD4+ Т-лимфоцит представляет собой наивную CD4+ Т-клетку или CD4+ Т-клетку центральной памяти. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% клеток в композиции представляют собой CD8+ клетки; согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% клеток в композиции или CD8+ клеток в композиции представляют собой наивные CD8+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки центральной памяти, CD8+ Т-клетки эффекторной памяти или общую популяцию CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% клеток в композиции, и/или CD4+ и/или CD8+ клеток в композиции экспрессируют трансген или рекомбинантную молекулу, такую как CAR, и/или содержат систему экспрессии.
[00267] В настоящем изобретении также предложены способы получения композиций, включая композиции для адоптивной иммунотерапии, такие как те, которые содержат системы, а также применение или способы применения указанных композиций, например, для проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего заболевание или расстройство.
[00268] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способ изготовления композиции включает получение модифицированной наивной клетки или клетки, полученной из наивной клетки или клетки центральной памяти, или клетки, полученной из клетки центральной памяти, хелперной CD4+ Т-клетки или популяции, содержащей указанные клетки, причем препарат указанных модифицированных хелперных Т-лимфоцитов содержит CD4+ Т-клетки, которые содержат химерный рецептор, такой как тот, который содержит лигандсвязывающий домен, специфичный в отношении поверхностной молекулы опухолевых клеток, спейсерный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен под контролем индуцируемого промотора, описанного в настоящем документе. В других вариантах реализации CD4+ клетки содержат цитокин или рецептор хемокина под контролем индуцируемого промотора.
[00269] Согласно некоторым вариантам реализации способов, описанных в настоящем документе, Т-клетки вводят с другими Т-клетками, которые не экспрессируют CAR, и/или вырабатывают Tam-индуцируемые белки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активатор транскрипции для CAR содержит ДНК-связывающий домен, тамоксифен/метаболит-связывающий домен или домен трансактивации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один или более, как правило, все домены синтетического активатора транскрипции принадлежат или получены из белков человека, например, доменов человека или по существу доменов человека. Такие признаки могут уменьшить иммуногенность конструкций при введении в организм субъектам-людям, например, при клеточной терапии.
Экспрессия в клетках Jurkat.
[00270] Исследовали состояние «ON» и «OFF» Т-клеток Jurkat, экспрессирующих TamR ZsGreen.
Конструкции
[00271] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения описанная система включает два компонента: 1) конститутивную экспрессию НЕА-3, соединенного с одним трансгеном или набором трансгенов с помощью домена Т2А, обеспечивающего перескок рибосом, и 2) условную экспрессию трансгена, который находится под контролем синтетического промотора 7×HBD/mEF1ap, специфичного в отношении НЕА-3, благодаря этому индукция трансгенов происходит в ответ на тамоксифен. В зависимости от желаемого применения генетического контроля TamRLV может быть использована комбинация систем доставки и векторных композиций. Создание конструкций описано выше.
[00272] В другом варианте система TamR-LV обеспечивает конститутивную экспрессию НЕА-3 и индуцируемую экспрессию ZsGreen или химерных антигенных рецепторов, что позволяет осуществлять кинетический анализ и контроль биологического эффекта в состояниях «OFF» и «ON» с помощью присутствия или отсутствия тамоксифена. Для этих целей применяли две конструкции: 1) НЕА-3, индуцируемый промотором EF1a человека и соединенный с усеченным трансмембранным маркерным белком EGFR (EGFRt) с помощью линкерной последовательности Т2А, обеспечивающей перескок рибосом, который клонировали в третье поколение самоинактивирующейся лентивирусной упаковывающей плазмиды epHIV7 (конструкция А), (см. таблицу 10; SEQ ID NO: 39; таблицу 1: SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9), и 2) 7×HBD/mEF1ap, который контролирует тамоксифен-зависимую экспрессию ZsGreen, клонировали в вектор pcDNA3.1(-), который был модифицирован, чтобы удалить коммерчески используемый промотор CMV (конструкция В) (см. таблицу 12; SEQ ID NO: 41). ZsGreen1 представляет собой вариант ZsGreen, кодоны которого оптимизированы для экспрессии у человека, кодирующий самый яркий, коммерчески доступный зеленый флуоресцентный белок. (Доступен у Clontech).
Способы
[00273] Клетки Jurkat трансдуцировали при MOI=5 упаковывающими лентивирусными конструкциями, описанными выше, с применением подхода двойной упаковки, при котором каждую плазмиду котрансфицировали в клетки 293Т во время получения лентивирусов. Молярное соотношение конструкция А : конструкция В составило 1:2. Конструкция А кодирует химерный фактор транскрипции НЕА-3, соединенный посредством рибосомальной расщепляющейся последовательности, Т2А, с маркером для отслеживания и отбора EGFRt Конструкция В кодирует синтетический, НЕА-3-восприимчивый промотор, 7×HBD/mE1b, который регулирует экспрессию трансгена ZsGreen-DR1, гена короткоживущего зеленого флуоресцентного репортера.
[00274] После трансдукции клетки размножали в культуре, обогащали для экспрессии EGFRt с помощью отбора с использованием магнитных гранул Miltenyi до чистоты >99%. После дальнейшего размножения в культуре клетки собирали и обрабатывали этанолом (носитель) в качестве отрицательного контроля или 500 нМ 4-гидрокситамоксифена (4-ОНТ) в течение 24 ч, затем собирали, окрашивали эрбитуксом-биотином с последующим мечением SA-APC, и анализировали для оценки экспрессии АРС и экспрессии ZsGreen методом проточной цитометрии. Результаты представлены на фигуре 1.
Дозозависимый ответ
[00275] Клетки собирали и затем подвергали обработке 4-ОНТ, концентрация которого варьировалась в пределах от 0 нМ-1000 нМ, как указано. Образцы собирали, промывали и окрашивали EGFRt-биотином, затем стрептавидином-АРС, и анализировали для оценки экспрессии ZsGreen методом проточной цитометрии. Результаты представлены на фигуре 2. Кинетики активации и подавления
[00276] Популяцию стимулировали 500 нМ 4-ОНТ в течение 48 часов, и затем сортировали ZsGreen+ клетки с использованием FACS со степенью чистоты популяции ZsGreen+ >99% в немедленном анализе после сортировки. Клетки затем размножали в культуре в течение 3-х недель и готовили для кинетических исследований. Клетки разделяли на 3 группы: (1) только 4-ОНТ, (2) 200 нМ 4-ОНТ (добавляли каждые 48 часов), (3) 24 часа 200 нМ 4-ОНТ с последующим промыванием в 1× ФСБ, после этого культивировали в средах, не содержащих 4-ОНТ, в течение 14 дней с последующей 24-часовой повторной стимуляцией 200 нм 4-ОНТ и промывали в 1× ФСБ. В каждой временной точке образцы собирали и анализировали методом проточной цитометрии для оценки экспрессии ZsGreen. Результаты показаны на фигуре 3, и представлены как % ZsGreen+.
Результаты
[00277] Результаты на фигуре 1 указывают на то, что в присутствии 4-гидрокситамоксифена (4-ОНТ) приблизительно 50% клеток экспрессируют ZsGreen, это свидетельствует о том, что клетки несут обе конструкции А и В, и что 4-ОНТ индуцировал экспрессию конструкции В. Результаты исследования зависимости ответа от дозы свидетельствую о том, что концентрации 4-ОНТ 200 нМ или более была эффективной для индукции экспрессии трансгена в трансдуцированных клетках. (Фигура 2). Результаты на фигуре 3 указывают на то, что при вымывании 4-ОНТ из культуры экспрессия ZsGreen снижается до менее чем 10% от максимальной активности ZsGreen в течение 5 дней. После того как 4-ОНТ добавляли повторно, активность ZsGreen возвращалась к приблизительно 100% максимальной активности в течение 2-х дней.
Обсуждение
[00278] Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что Т-клетки Jurkat человека можно трансдуцировать двойным упакованным лентивирусом с конститутивным компонентом и индуцируемым компонентом. Экспрессия гена ZsGreen индуцируется в присутствии 4-ОНТ дозазависимым образом. Помимо этого, вымывание 4-ОНТ из культуры клеток приводило к снижению экспрессии ZsGreen, которая могла быть повторно стимулирована добавлением 4-ОНТ к клеткам.
Экспрессия в первичных CD4-клетках центральной памяти и CD8+ клетках центральной памяти
[00279] Исследовали состояние «ON» и «OFF» в CD4 и CD8 Т-клетках центральной памяти, экспрессирующих TamR ZsGreen.
Конструкции
[00280] Согласно некоторым вариантам реализации система включает два компонента: 1) конститутивную экспрессию НЕА-3, соединенного с одним трансгеном или набором трансгенов с помощью линкерных доменов Т2А, обеспечивающих перескок рибосом (конструкция А) (см. таблицу 10, SEQ ID NO: 39; таблицу 1 SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9), и 2) условную экспрессию трансгена, который находится под контролем синтетического промотора 7×HBD/mEF1ap, специфичного в отношении НЕА-3, благодаря этому индукция трансгенов происходит в ответ на тамоксифен (конструкция В) (см. таблицу 12, SEQ ID NO: 41). В зависимости от желаемого применения генетического контроля TamRLV можно применять комбинацию систем доставки и векторных конструкций. Конструкции получали, как описано выше.
Способы
[00281] CD4 клетки центральной памяти получали из периферической крови путем отбора клеток с помощью проточной цитометрии, которые были положительны в отношении маркеров CD4 и CD62L и отрицательны в отношении CD45RO. Клетки культивировали с гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28, в течение 3-х дней.
[00282] CD8+ клетки центральной памяти получали из периферической крови путем отбора клеток с помощью проточной цитометрии, которые были положительны в отношении маркеров CD8 и CD62L и отрицательны в отношении CD45RO. Клетки культивировали с гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28, в течение 3-х дней.
[00283] Через 3 дня CD4 или CD8 клетки центральной памяти трансдуцировали при MOI=5 с лентивирусными упаковывающими конструкциями, описанными выше, полученными с использованием подхода двойной упаковки, при котором каждую плазмиду котрансфицируют в клетки 293Т во время наработки лентивирусов. Молярное соотношение конструкция А : конструкция В составило 1:2. Конструкция А кодирует химерный фактор транскрипции НЕА-3, соединенный посредством рибосомальной расщепляющейся последовательности, Т2А, с маркером для отслеживания и отбора EGFRt. Конструкция В кодирует синтетический, НЕА-3-восприимчивый промотор, 7×HBD/mE1b, который регулирует экспрессию трансгена ZsGreen-DR1, гена короткоживущего зеленого флуоресцентного репортера.
[00284] На 21-й день после трансдукции клетки обогащали в отношении EGFRt и размножали с фидерными клетками, ИЛ-2 и ИЛ-15. После размножения клетки разделяли на 3 группы, только 4-ОНТ (А), 4-ОНТ в комбинации с гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28 (В), или только 4-ОНТ в течение 48 часов, с последующим добавлением гранул, специфичных в отношении CD3/CD28 (С). Соответствующие образцы без 4-ОНТ также получали для сравнения. Все образцы собирали в указанные моменты времени после обработки 4-ОНТ, окрашивали антителом EGFRt-биотин, с последующим мечением SA-APC и анализировали методом проточной цитометрии. Результаты представлены на фигуре 4 (CD4 центральной памяти) и фигуре 5 (CD8 центральной памяти).
Результаты
[00285] Результаты указывают на то, что CD4 клетки, трансдуцированные двойным плазмидным вектором, нуждаются в присутствии активационного стимула для экспрессии ZsGreen даже в присутствии тамоксифена. См. фигуру 4В. Приблизительно 70% первичных трансдуцированных CD4 клеток в присутствии тамоксифена и гранул, специфичных в отношении CD3/CD28, экспрессировали ZsGreen. Экспрессию генов наблюдали в том случае, если активация происходила после 48-часовой обработки тамоксифеном. См. фигуру 4С.
[00286] Результаты указывают на то, что CD8 клетки, трансдуцированные двойным плазмидным вектором, нуждаются в присутствии активационного стимула для экспрессии ZsGreen даже в присутствии тамоксифена. См. фигуру 5В. Приблизительно 37% первичных трансдуцированных CD8 клеток в присутствии тамоксифена и гранул, специфичных в отношении CD3/CD28, экспрессировали ZsGreen. Экспрессию генов наблюдали в том случае, если активация происходила после 48-часовой обработки тамоксифеном. См. фигуру 5С.
[00287] Полученные результаты свидетельствуют о том, что первичные Т-клетки центральной памяти, трансдуцированные индуцируемой конструкцией, могут экспрессировать трансген в присутствии индуктора при активации гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28. Тем не менее, неактивированные клетки, экспрессирующие трансген, могут быть легко выделены с помощью иммуномагнитной сортировки или сортировки методом проточной цитометрии.
Конструирование TamR-CD19CAR LV.
[00288] Конструирование вектора осуществляли путем двойной упаковки плазмид-переносчиков, несущих конструкции, описанные выше, при молярном соотношении плазмид 1:1. (См. фигуры 6С и 7С). Конструкция А под контролем конститутивного промотора EF-1α кодирует TamR-TF (НЕА-3), соединенный посредством рибосомальной расщепляющейся последовательности, Т2А, с маркером для отслеживания и отбора EGFRt (см. таблицу 10; SEQ ID NO: 39, таблицу 1: SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9). Конструкция В содержит промотор 7×HBD/mE1b, после которого расположена кДНК трансгена, включая CD19CAR, соединенный с помощью расщепляющейся последовательности 2а с Her2t, маркером для отслеживания и отбора (см. таблицу 12, SEQ ID NO: 41; таблицу 2 SEQ ID NO: 10; таблицу 13, SEQ ID NO: 44). Другую конструкцию получали путем добавления дополнительного селективного маркера DHFRdm (таблица 14, SEQ ID NO: 46).
[00289] Клетки Jurkat человека трансдуцировали при MOI=2, затем размножали в культуре и отбирали EGFRt+ клетки посредством магнитной селекции с использованием гранул. После дальнейшего размножения клетки обрабатывали только носителем (этанол) или 500 нМ 4-ОНТ, и собирали для анализа методом проточной цитометрии. Образцы окрашивали антителом EGFRt-APC и герцептином-биотином и затем метили SA-PE. Также получали образцы для вестерн-блоттинга, использованное первичное антитело представляло собой мышиное моноклональное антитело к CD247, которое распознает внутриклеточную дзета-цепь CD3 на CD19CAR (~48 кДа). Эндогенная дзета-цепь CD3 мигрирует при ~ 23 кДа. Результаты представлены на фигуре 6.
Т-клетки Jurkat трансдуцированные TamR-CD19CAR LV, содержащим селективный маркер
[00290] TamR CD19CAR LV конструировали с использованием подхода двойной упаковки конструкции А и В. Конструкция А содержит НЕА-3, соединенный посредством рибосомальной расщепляющейся последовательности, Т2А, с маркером для отслеживания и отбора EGFRt. Конструкция В содержит промотор 7×HBD/mE1b, после которого расположен трансген, состоящий из CD19CAR, соединенного с помощью расщепляющейся последовательности 2а с Her2t, маркером для отслеживания и отбора, соединенным с помощью другой расщепляющейся последовательности 2а (Р2А) с DHFRdm, геном устойчивости к метотрексату.
[00291] Клетки трансдуцировали лентивирусом TamR CD19CAR при MOI=1, размножали в культуре, отбирали EGFRt-положительные клетки с помощью магнитной сортировки с использованием гранул. После дальнейшего размножения клетки обрабатывали только вектором (этанол) или 500 нМ 4-ОНТ, и собирали для проточной цитометрии (верхняя панель). Фигура 7. Образцы окрашивали антителом EGFRt-APC и герцептином-биотином и затем метили PE-SA. Исходные клетки (нетрансдуцированные Jurkat) представлены для сравнения. Также получали образцы для вестерн-блоттинга, использованное первичное антитело представляло собой мышиное моноклональное антитело к CD247, которое распознает внутриклеточную дзета-цепь CD3 на CD19CAR (~48 кДа). Эндогенная дзета-цепь CD3 мигрирует при ~ 23 кДа.
Результаты
[00292] Результаты свидетельствуют о том, что EGFRt детектируется у 94,6% клеток, трансдуцированных конструкцией, не включая дополнительный селективный маркер DHFRdm. См. фигуру 6В. На фигуре 6С показано, что в присутствии тамоксифена приблизительно 42,6% клеток, трансдуцированных конструкцией, не включая DHFRdm, экспрессировали EGFRt и Her2t. Клетки, экспрессирующие оба маркера, экспрессировали дзета-цепь CD3 как часть конструкции CAR (48 кДа), согласно результатам детектирования с помощью вестерн-блоттинга. См. фигуру 6В.
[00293] На фигуре 7 показано, что 85,9% клеток Jurkat, трансдуцированных конструкцией, содержащей другую расщепляемую последовательности 2а (Р2А) перед DHFRdm, экспрессируют EGFRt в отсутствие тамоксифена. В присутствии тамоксифена приблизительно 7,5% клеток экспрессировали EGFRt и Her2t. Клетки, экспрессирующие оба маркера, экспрессировали дзета-цепь CD3 как часть конструкции CAR (48 кДа), согласно результатам детектирования с помощью вестерн-блоттинга. См. фигуру 7В.
[00294] Индуцируемая экспрессия CD19 CAR показана в трансдуцированных клетках Jurkat. Индукция может быть измерена путем детектирования экспрессии маркера Her2t, а также детектирования экспрессии CD19CAR с использованием вестерн-блоттинга. Добавление дополнительного селективного маркера, DHFRdm, к индуцируемой конструкции не улучшало индуцируемую экспрессию гена.
CD4 ТСМ Т-клетки человека, трансдуцированные TamR CD19CAR LV
[00295] CD4 клетки центральной памяти получали из периферической крови путем отбора клеток с помощью проточной цитометрии, которые были положительными в отношении маркеров CD4 и CD62L и отрицательными в отношении CD45RO. Клетки культивировали с гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28, в течение 3-х дней. Через 3 дня CD4 клетки центральной памяти трансдуцировали при MOI=5 лентивирусом, содержащим конструкции А и В. (фигура 8В). Конструкция А кодирует химерный фактор транскрипции НЕА-3, соединенный посредством рибосомальной расщепляющейся последовательности, Т2А, с маркером для отслеживания и отбора EGFRt. (См. таблицу 10, SEQ ID NO: 39; таблицу 1; SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9). Конструкция В кодирует синтетический НЕА-3-восприимчивый промотор, 7×HBD/mE1b, который регулирует экспрессию трансгена CD19CAR, соединенного посредством Т2А с Her2t для отслеживания и отбора, а также с помощью второй последовательности 2а, Р2А, с селективным геном устойчивости к метотрексату, DHFRdm. (см. таблицу 12; SEQ ID NO: 41, таблицу 2 SEQ ID NO: 10, таблицу 13; SEQ ID NO: 44; таблицу 14; SEQ ID NO: 46).
[00296] Ha 21-й день после транедукции клетки обогащали EGFRt-положительными клетками с помощью отбора с использованием магнитных гранул и затем размножали с облученными фидерными клетками, ИЛ-2 и ИЛ-15. Через две недели после размножения клетки криоконсервировали. В эксперименте, представленном выше, CD4+ СЕМ клетки, которые транедуцировали контрольным вирусом, или CD4+TamR CD19CAR LV оттаивали и культивировали с гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28, ИЛ-2, ИЛ-15. CD4+TamRCD19CAR LV обрабатывали контрольным носителем или 500 нМ 4-ОНТ в течение 24 часов. Все образцы собирали, промывали и затем окрашивали антителом EGFRt-APC и Her2t-биотином, с последующим мечением SA-PE, и анализировали методом проточной цитометрии. Результаты представлены на фигуре 8.
Результаты
[00297] Результаты на фигуре 8 свидетельствуют о том, что в отсутствие тамоксифена 75,6% трансдуцированных первичных CD4 клеток центральной памяти экспрессируют EGFRt, это указывает на конститутивную экспрессию конструкции А. В присутствии тамоксифена и активирующего стимула (например, гранулами, специфичными в отношении CD3/CD28), приблизительно 14,7% первичных клеток экспрессируют оба белка, EGFRt и Her2t.
[00298] Первичные CD4 клетки, трансдуцированные индуцируемым вектором в присутствии индуктора и активирующего стимула, экспрессируют трансген под контролем индуцируемого промотора, согласно результатам детектирования экспрессии маркерного гена Her2t. Однако неактивированные клетки, экспрессирующие трансген, могут быть легко выделены с помощью иммуномагнитной сортировки или сортировки методом проточной цитометрии. Дальнейшая характеристика этих клеток будет включать детектирование экспрессии CD19CAR.
[00299] Приведенное выше описание иллюстрирует настоящее изобретение и не должно быть истолковано как ограничивающее. Объем настоящего изобретения определен нижеследующей формулой изобретения, которая включает эквиваленты формулы изобретения. Все ссылки и документы, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в него посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Seattle Children's Hospital
dba Seattle Children's Research Institute
Jensen, Michael C.
<120> ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСГЕНОВ, РЕГУЛИРУЕМАЯ ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ
<130> SCRI.053WO
<140> PCT/US2015/024947
<141> 2015-04-08
<150> 62/058,973
<151> 2014-10-02
<150> 61/977,751
<151> 2014-04-10
<150> 61/986,479
<151> 2014-04-30
<150> 62/089,730
<151> 2014-12-09
<150> 62/090,845
<151> 2014-12-11
<150> 62/088,363
<151> 2014-12-05
<160> 94
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 2528
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GMCSFss-Her2scFv-IgG4шарнир-CD28tm-41BB-Zeta-T2A-EG
FRt
<400> 1
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 120
gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag 180
aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc 240
ccttctcgct tctctggttc cagatctggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 300
cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc 360
ggacagggta ccaaggtgga gatcaaaggc agtactagcg gcggtggctc cgggggcgga 420
tccggtgggg gcggcagcag cgaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag 480
ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct tcaacattaa agacacctat 540
atacactggg tgcgtcaggc cccgggtaag ggcctggaat gggttgcaag gatttatcct 600
acgaatggtt atactagata tgccgatagc gtcaagggcc gtttcactat aagcgcagac 660
acatccaaaa acacagccta cctgcagatg aacagcctgc gtgctgagga cactgccgtc 720
tattattgtt ctagatgggg aggggacggc ttctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
accctggtca ccgtctcgag gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctatgt 840
tctgggtgct ggtggtggtc ggaggcgtgc tggcctgcta cagcctgctg gtcaccgtgg 900
ccttcatcat cttttgggtg aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac 960
catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag 1020
aagaagaaga aggaggatgt gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg 1080
cctaccagca gggccagaat cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agggaagagt 1140
acgacgtcct ggataagcgg agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga 1200
agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca 1260
gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg 1320
gcctgtccac cgccaccaag gatacctacg acgccctgca catgcaggcc ctgcccccaa 1380
ggctcgaggg cggcggagag ggcagaggaa gtcttctaac atgcggtgac gtggaggaga 1440
atcccggccc taggatgctt ctcctggtga caagccttct gctctgtgag ttaccacacc 1500
cagcattcct cctgatccca cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag 1560
actcactctc cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg 1620
gcgatctcca catcctgccg gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc 1680
tggatccaca ggaactggat attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga 1740
ttcaggcttg gcctgaaaac aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac 1800
gcggcaggac caagcaacat ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat 1860
ccttgggatt acgctccctc aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca 1920
aaaatttgtg ctatgcaaat acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga 1980
aaaccaaaat tataagcaac agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc 2040
atgccttgtg ctcccccgag ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc 2100
ggaatgtcag ccgaggcagg gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa 2160
gggagtttgt ggagaactct gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca 2220
tgaacatcac ctgcacagga cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg 2280
acggccccca ctgcgtcaag acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg 2340
tctggaagta cgcagacgcc ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg 2400
gatgcactgg gccaggtctt gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg 2460
ccactgggat ggtgggggcc ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct 2520
tcatgtga 2528
<210> 2
<211> 66
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GMCSFRss
<400> 2
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atcccc 66
<210> 3
<211> 735
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD19scFv ДНК
<400> 3
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 4
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG4-шарнир
<400> 4
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 5
<211> 84
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен CD28
<400> 5
atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtg 84
<210> 6
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая домен 41BB
<400> 6
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 7
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая домен CD3Zeta
<400> 7
cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336
<210> 8
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Саморасщепляющийся T2A
<400> 8
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta gg 72
<210> 9
<211> 1074
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EGFRt
<400> 9
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600
cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660
ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720
aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780
acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840
gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900
gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960
ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020
ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074
<210> 10
<211> 2529
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Белок, содержащий домены, связанные как GMCSFRss -
CD19scFv - IgG4-шарнир - CD28tm - 41BB - CD3Zeta -
T2A - EGFRt
<400> 10
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cgagagcaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840
ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900
gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080
gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140
tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320
ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380
aggctcgagg gcggcggaga gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag 1440
aatcccggcc ctaggatgct tctcctggtg acaagccttc tgctctgtga gttaccacac 1500
ccagcattcc tcctgatccc acgcaaagtg tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa 1560
gactcactct ccataaatgc tacgaatatt aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt 1620
ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt aggggtgact ccttcacaca tactcctcct 1680
ctggatccac aggaactgga tattctgaaa accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg 1740
attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata 1800
cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca 1860
tccttgggat tacgctccct caaggagata agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac 1920
aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag 1980
aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc 2040
catgccttgt gctcccccga gggctgctgg ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc 2100
cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg gacaagtgca accttctgga gggtgagcca 2160
agggagtttg tggagaactc tgagtgcata cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc 2220
atgaacatca cctgcacagg acggggacca gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt 2280
gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg 2340
gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac 2400
ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc 2460
gccactggga tggtgggggc cctcctcttg ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc 2520
ttcatgtga 2529
<210> 11
<211> 842
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GMCSFRss - CD19scFv - IgG4-шарнир - CD28tm - 41BB
- CD3Zeta - T2A - EGFRt
<400> 11
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
275 280 285
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
290 295 300
Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
305 310 315 320
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
325 330 335
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
340 345 350
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
370 375 380
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
385 390 395 400
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
405 410 415
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
420 425 430
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
435 440 445
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly
450 455 460
Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
465 470 475 480
Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys
485 490 495
Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn
500 505 510
Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr
515 520 525
Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His
530 535 540
Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro
545 550 555 560
Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr
565 570 575
Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His
580 585 590
Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly
595 600 605
Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu
610 615 620
Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn
625 630 635 640
Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly
645 650 655
Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser
660 665 670
Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly
675 680 685
Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser
690 695 700
Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro
705 710 715 720
Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys
725 730 735
Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn
740 745 750
Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr
755 760 765
Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr
770 775 780
Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr
785 790 795 800
Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys
805 810 815
Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu
820 825 830
Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
835 840
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер (G4S)3
<400> 12
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 13
<211> 327
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Uniprot P0861 IgG4-Fc
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 14
<211> 220
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> трансмембранный домен CD28
<400> 14
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 15
<211> 240
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> домен 4-1BB
<400> 15
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
<210> 16
<211> 164
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Изоформа 3 CD3 Zeta человека
<400> 16
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG1 человека
<400> 17
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG2 человека
<400> 18
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 19
<211> 61
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG3 человека
<400> 19
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG4 человека
<400> 20
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный IgG4 человека
<400> 21
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02649
<400> 22
atcaaaagaa tagaccgaga tagggt 26
<210> 23
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02648
<400> 23
ccgtaccttt aagaccaatg acttac 26
<210> 24
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02650
<400> 24
ttgagagttt tcgccccg 18
<210> 25
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02651
<400> 25
aatagacaga tcgctgagat aggt 24
<210> 26
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02652
<400> 26
caggtatccg gtaagcgg 18
<210> 27
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02653
<400> 27
cgaccagcaa ccatagtcc 19
<210> 28
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02654
<400> 28
tagcggtttg actcacgg 18
<210> 29
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02655
<400> 29
gcagggagct agaacgattc 20
<210> 30
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02656
<400> 30
attgtctggt atagtgcagc ag 22
<210> 31
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02657
<400> 31
tcgcaacggg tttgcc 16
<210> 32
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02658
<400> 32
aggaagatat cgccacctac t 21
<210> 33
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02601
<400> 33
cgggtgaagt tcagcagaag 20
<210> 34
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02735
<400> 34
actgtgtttg ctgacgcaac 20
<210> 35
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> oJ02715
<400> 35
atgcttctcc tggtgacaag 20
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный линкер IgG4 человека
<400> 36
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный IgG4 человека
<400> 37
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный IgG4 человека
<400> 38
Glu Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 39
<211> 2586
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TamR-tf(HEA3)
<400> 39
atggtgtcca agctgtccca gctgcagaca gaactgctgg cagcactgct ggaaagcggc 60
ctgagcaaag aggccctgat tcaggcactc ggcgaacctg gaccttatct gctcgctggc 120
gaaggccctc tggataaggg cgagagctgt ggcggaggaa gaggagagct ggccgagctg 180
cctaacggcc tgggcgagac aagaggcagc gaggacgaga cagacgacga cggcgaggac 240
ttcacccccc ccatcctgaa agagctggaa aacctgagcc ccgaggaagc cgcccaccag 300
aaagccgtgg tggagacact gctgcaggaa gatccctggc gggtcgccaa gatggtcaag 360
agctacctgc agcagcacaa catcccccag cgggaggtgg tggacaccac cggcctgaac 420
cagagccacc tgagccagca cctgaacaag ggcaccccca tgaaaaccca gaagagagcc 480
gccctgtaca cttggtacgt gcggaagcag agagaggtgg cccagcagtt tacacacgcc 540
ggccagggcg gcctgatcga ggaacctacc ggcgacgagc tgcccaccaa gaagggcaga 600
cggacccggt ttaagtgggg ccctgcatct cagcagatcc tgttccaggc ctacgagcgg 660
cagaagaacc ccagcaaaga ggaacgggag acactggtgg aagagtgcaa ccgggccgag 720
tgcatccaga gaggcgtgag cccttctcag gctcagggcc tcggcagcaa tctggtcacc 780
gaagtgcggg tgtacaattg gttcgccaac cggcggaaag aggaagcctt ccggcacaag 840
ctgtctgctg gcgatatgag agccgccaac ctgtggccca gccccctgat gatcaagcgg 900
agcaagaaga acagcctggc cctgagcctg accgccgatc agatggtgtc cgctctgctg 960
gacgccgagc cccctatcct gtacagcgag tacgacccca ccagaccctt cagcgaggcc 1020
agcatgatgg gcctgctgac caacctggcc gaccgggagc tggtgcacat gatcaactgg 1080
gccaagcggg tgcccggctt cgtggacctg accctgcacg accaggtcca cctgctggaa 1140
tgtgcctggc tggaaatcct gatgatcggc ctcgtgtgga gaagcatgga acaccccggc 1200
aagctgctgt tcgcccccaa cctgctcctg gaccggaacc agggaaagtg cgtggagggc 1260
atggtggaga tcttcgacat gctgctggcc acctccagcc ggttccggat gatgaacctg 1320
cagggcgagg aattcgtgtg cctgaagtcc atcatcctgc tgaacagcgg cgtgtacacc 1380
ttcctgtcat ccaccctgaa gtccctggaa gagaaggacc acatccaccg ggtgctggac 1440
aagatcaccg acaccctgat ccacctgatg gccaaggctg gcctgacact ccagcagcag 1500
caccagagac tggcccagct gctgctgatc ctgagccaca tccggcacat gagcaacaag 1560
cggatggaac acctgtacag catgaagtgc aagaacgtgg tgcccctgta cgacctgctg 1620
ctcgagatgc tggatgccca cagactgcac gcccctacaa gcagaggcgg agccagcgtg 1680
gaggaaaccg accagtctca cctggccacc gccggcagca caagcagcca cagcctgcag 1740
aagtactaca tcaccggcga ggccgaggga ttccctgcca ccgtggagtt ccagtacctg 1800
cccgacaccg acgaccggca ccggatcgag gaaaagcgga agcggaccta cgagacattc 1860
aagagcatca tgaagaagtc ccccttcagc ggccccaccg atcccagacc cccccctaga 1920
agaatcgccg tgcccagcag atctagcgcc agcgtgccca agcctgcccc ccagccctac 1980
cctttcacca gcagcctgag caccatcaac tacgacgagt tccctaccat ggtgttcccc 2040
agcggccaga tctctcaggc ctctgctctg gcacctgctc cacctcaggt gctgcctcag 2100
gcccctgctc cagccccagc ccctgccatg gtgtctgcac tggcccaggc tccagctcct 2160
gtgcctgtgc tggcccctgg acctcctcag gctgtggccc ctcctgcccc taaacctacc 2220
caggccgggg agggaacact gtctgaggcc ctgctgcagc tccagttcga cgacgaggat 2280
ctgggagcac tgctgggcaa tagcaccgac cccgccgtgt ttaccgacct ggcctccgtg 2340
gacaacagcg agttccagca gctcctcaac cagggcatcc ctgtcgcccc acacaccacc 2400
gagcccatgc tgatggaata ccccgaggcc atcaccagac tggtcacagg cgcccagagg 2460
cctccagatc cagcaccagc tccactggga gcccctggcc tgcctaatgg gctgctgtct 2520
ggcgacgagg acttctccag cattgccgac atggacttca gcgccctgct gtcccagatc 2580
agcagc 2586
<210> 40
<211> 828
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TamR-tf(HEA3)
<400> 40
Met Val Ser Lys Leu Ser Gln Leu Gln Thr Glu Leu Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ser Gly Leu Ser Lys Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Gly Glu
20 25 30
Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Ala Gly Glu Gly Pro Leu Asp Lys Gly Glu
35 40 45
Ser Cys Gly Gly Gly Arg Gly Glu Leu Ala Glu Leu Pro Asn Gly Leu
50 55 60
Gly Glu Thr Arg Gly Ser Glu Asp Glu Thr Asp Asp Asp Gly Glu Asp
65 70 75 80
Phe Thr Pro Pro Ile Leu Lys Glu Leu Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu
85 90 95
Ala Ala His Gln Lys Ala Val Val Glu Thr Leu Leu Gln Glu Asp Pro
100 105 110
Trp Arg Val Ala Lys Met Val Lys Ser Tyr Leu Gln Gln His Asn Ile
115 120 125
Pro Gln Arg Glu Val Val Asp Thr Thr Gly Leu Asn Gln Ser His Leu
130 135 140
Ser Gln His Leu Asn Lys Gly Thr Pro Met Lys Thr Gln Lys Arg Ala
145 150 155 160
Ala Leu Tyr Thr Trp Tyr Val Arg Lys Gln Arg Glu Val Ala Gln Gln
165 170 175
Phe Thr His Ala Gly Gln Gly Gly Leu Ile Glu Glu Pro Thr Gly Asp
180 185 190
Glu Leu Pro Thr Lys Lys Gly Arg Arg Asn Arg Phe Lys Trp Gly Pro
195 200 205
Ala Ser Gln Gln Ile Leu Phe Gln Ala Tyr Glu Arg Gln Lys Asn Pro
210 215 220
Ser Lys Glu Glu Arg Glu Thr Leu Val Glu Glu Cys Asn Arg Ala Glu
225 230 235 240
Cys Ile Gln Arg Gly Val Ser Pro Ser Gln Ala Gln Gly Leu Gly Ser
245 250 255
Asn Leu Val Thr Glu Val Arg Val Tyr Asn Trp Phe Ala Asn Arg Arg
260 265 270
Lys Glu Glu Ala Phe Arg His Lys Leu Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala
275 280 285
Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn
290 295 300
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
305 310 315 320
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
325 330 335
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
340 345 350
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
355 360 365
Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu
370 375 380
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly
385 390 395 400
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
405 410 415
Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
435 440 445
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
450 455 460
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
485 490 495
Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
500 505 510
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Arg Met Glu His Leu Tyr Ser Met
515 520 525
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu
530 535 540
Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val
545 550 555 560
Glu Glu Phe Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu
565 570 575
Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys
580 585 590
Ser Pro Phe Ser Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile
595 600 605
Ala Val Pro Ser Arg Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln
610 615 620
Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr Asp Glu Phe
625 630 635 640
Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu
645 650 655
Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro
660 665 670
Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro
675 680 685
Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys
690 695 700
Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu
705 710 715 720
Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp
725 730 735
Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln
740 745 750
Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro
755 760 765
Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala
770 775 780
Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu
785 790 795 800
Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp
805 810 815
Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser
820 825
<210> 41
<211> 119
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 7xHBD/mEF1-альфа
<400> 41
tagttaataa tctacaatag ttaataatct acaatagtta ataatctaca atagttaata 60
atctacaata gttaataatc tacaatagtt aataatctac aatagttaat aatctacaa 119
<210> 42
<211> 2586
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TamR-tf (HEA4)
<400> 42
atggtgtcca agctgtccca gctgcagaca gaactgctgg cagcactgct ggaaagcggc 60
ctgagcaaag aggccctgat tcaggcactc ggcgaacctg gaccttatct gctcgctggc 120
gaaggccctc tggataaggg cgagagctgt ggcggaggaa gaggagagct ggccgagctg 180
cctaacggcc tgggcgagac aagaggcagc gaggacgaga cagacgacga cggcgaggac 240
ttcacccccc ccatcctgaa agagctggaa aacctgagcc ccgaggaagc cgcccaccag 300
aaagccgtgg tggagacact gctgcaggaa gatccctggc gggtcgccaa gatggtcaag 360
agctacctgc agcagcacaa catcccccag cgggaggtgg tggacaccac cggcctgaac 420
cagagccacc tgagccagca cctgaacaag ggcaccccca tgaaaaccca gaagagagcc 480
gccctgtaca cttggtacgt gcggaagcag agagaggtgg cccagcagtt tacacacgcc 540
ggccagggcg gcctgatcga ggaacctacc ggcgacgagc tgcccaccaa gaagggcaga 600
cggaaccggt ttaagtgggg ccctgcatct cagcagatcc tgttccaggc ctacgagcgg 660
cagaagaacc ccagcaaaga ggaacgggag acactggtgg aagagtgcaa ccgggccgag 720
tgcatccaga gaggcgtgag cccttctcag gctcagggcc tcggcagcaa tctggtcacc 780
gaagtgcggg tgtacaattg gttcgccaac cggcggaaag aggaagcctt ccggcacaag 840
ctgtctgctg gcgatatgag agccgccaac ctgtggccca gccccctgat gatcaagcgg 900
agcaagaaga acagcctggc cctgagcctg accgccgatc agatggtgtc cgctctgctg 960
gacgccgagc cccctatcct gtacagcgag tacgacccca ccagaccctt cagcgaggcc 1020
agcatgatgg gcctgctgac caacctggcc gaccgggagc tggtgcacat gatcaactgg 1080
gccaagcggg tgcccggctt cgtggacctg accctgcacg accaggtcca cctgctggaa 1140
tgtgcctggc tggaaatcct gatgatcggc ctcgtgtgga gaagcatgga acaccccgtg 1200
aagctgctgt tcgcccccaa cctgctcctg gaccggaacc agggaaagtg cgtggagggc 1260
atggtggaga tcttcgacat gctgctggcc acctccagcc ggttccggat gatgaacctg 1320
cagggcgagg aattcgtgtg cctgaagtcc atcatcctgc tgaacagcgg cgtgtacacc 1380
ttcctgtcat ccaccctgaa gtccctggaa gagaaggacc acatccaccg ggtgctggac 1440
aagatcaccg acaccctgat ccacctgatg gccaaggctg gcctgacact ccagcagcag 1500
caccagagac tggcccagct gctgctgatc ctgagccaca tccggcacat gagcaacaag 1560
ggaatggaac acctgtacag catgaagtgc acgaacgtgg tgcccctgta cgacctgctg 1620
ctcgaggctg ccgatgccca cagactgcac gcccctacaa gcagaggcgg agccagcgtg 1680
gaggaaaccg accagtctca cctggccacc gccggcagca caagcagcca cagcctgcag 1740
aagtactaca tcaccggcga ggccgaggga ttccctgcca ccgtggagtt ccagtacctg 1800
cccgacaccg acgaccggca ccggatcgag gaaaagcgga agcggaccta cgagacattc 1860
aagagcatca tgaagaagtc ccccttcagc ggccccaccg atcccagacc cccccctaga 1920
agaatcgccg tgcccagcag atctagcgcc agcgtgccca agcctgcccc ccagccctac 1980
cctttcacca gcagcctgag caccatcaac tacgacgagt tccctaccat ggtgttcccc 2040
agcggccaga tctctcaggc ctctgctctg gcacctgctc cacctcaggt gctgcctcag 2100
gcccctgctc cagccccagc ccctgccatg gtgtctgcac tggcccaggc tccagctcct 2160
gtgcctgtgc tggcccctgg acctcctcag gctgtggccc ctcctgcccc taaacctacc 2220
caggccgggg agggaacact gtctgaggcc ctgctgcagc tccagttcga cgacgaggat 2280
ctgggagcac tgctgggcaa tagcaccgac cccgccgtgt ttaccgacct ggcctccgtg 2340
gacaacagcg agttccagca gctcctcaac cagggcatcc ctgtcgcccc acacaccacc 2400
gagcccatgc tgatggaata ccccgaggcc atcaccagac tggtcacagg cgcccagagg 2460
cctccagatc cagcaccagc tccactggga gcccctggcc tgcctaatgg gctgctgtct 2520
ggcgacgagg acttctccag cattgccgac atggacttca gcgccctgct gtcccagatc 2580
agcagc 2586
<210> 43
<211> 862
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TamR-tf (HEA4)
<400> 43
Met Val Ser Lys Leu Ser Gln Leu Gln Thr Glu Leu Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Glu Ser Gly Leu Ser Lys Glu Ala Leu Ile Gln Ala Leu Gly Glu
20 25 30
Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Ala Gly Glu Gly Pro Leu Asp Lys Gly Glu
35 40 45
Ser Cys Gly Gly Gly Arg Gly Glu Leu Ala Glu Leu Pro Asn Gly Leu
50 55 60
Gly Glu Thr Arg Gly Ser Glu Asp Glu Thr Asp Asp Asp Gly Glu Asp
65 70 75 80
Phe Thr Pro Pro Ile Leu Lys Glu Leu Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu
85 90 95
Ala Ala His Gln Lys Ala Val Val Glu Thr Leu Leu Gln Glu Asp Pro
100 105 110
Trp Arg Val Ala Lys Met Val Lys Ser Tyr Leu Gln Gln His Asn Ile
115 120 125
Pro Gln Arg Glu Val Val Asp Thr Thr Gly Leu Asn Gln Ser His Leu
130 135 140
Ser Gln His Leu Asn Lys Gly Thr Pro Met Lys Thr Gln Lys Arg Ala
145 150 155 160
Ala Leu Tyr Thr Trp Tyr Val Arg Lys Gln Arg Glu Val Ala Gln Gln
165 170 175
Phe Thr His Ala Gly Gln Gly Gly Leu Ile Glu Glu Pro Thr Gly Asp
180 185 190
Glu Leu Pro Thr Lys Lys Gly Arg Arg Asn Arg Phe Lys Trp Gly Pro
195 200 205
Ala Ser Gln Gln Ile Leu Phe Gln Ala Tyr Glu Arg Gln Lys Asn Pro
210 215 220
Ser Lys Glu Glu Arg Glu Thr Leu Val Glu Glu Cys Asn Arg Ala Glu
225 230 235 240
Cys Ile Gln Arg Gly Val Ser Pro Ser Gln Ala Gln Gly Leu Gly Ser
245 250 255
Asn Leu Val Thr Glu Val Arg Val Tyr Asn Trp Phe Ala Asn Arg Arg
260 265 270
Lys Glu Glu Ala Phe Arg His Lys Leu Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala
275 280 285
Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn
290 295 300
Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu
305 310 315 320
Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro
325 330 335
Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
340 345 350
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val
355 360 365
Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu
370 375 380
Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Val
385 390 395 400
Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys
405 410 415
Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu
435 440 445
Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser
450 455 460
Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His Ile His Arg Val Leu Asp
465 470 475 480
Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr
485 490 495
Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Leu Ile Leu Ser
500 505 510
His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met
515 520 525
Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Ala Ala
530 535 540
Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser Arg Gly Gly Ala Ser Val
545 550 555 560
Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ser
565 570 575
His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Gly Phe Pro
580 585 590
Ala Thr Val Glu Phe Gln Tyr Leu Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg
595 600 605
Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met
610 615 620
Lys Lys Ser Pro Phe Ser Gly Pro Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg
625 630 635 640
Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg Ser Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala
645 650 655
Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr Asp
660 665 670
Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser
675 680 685
Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro
690 695 700
Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro
705 710 715 720
Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala
725 730 735
Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu
740 745 750
Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser
755 760 765
Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu
770 775 780
Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr
785 790 795 800
Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr
805 810 815
Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro
820 825 830
Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile
835 840 845
Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ser Ser
850 855 860
<210> 44
<211> 408
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2t
<400> 44
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccatgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 120
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 180
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 240
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 300
ggctgccccg ccgagcagag agccagccct ctgacgtcca tcatctctgc ggtggttggc 360
attctgctgg tcgtggtctt gggggtggtc tttgggatcc tcatctga 408
<210> 45
<211> 135
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2t
<400> 45
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
20 25 30
Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala
35 40 45
His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val
50 55 60
Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp
85 90 95
Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
100 105 110
Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly
115 120 125
Val Val Phe Gly Ile Leu Ile
130 135
<210> 46
<211> 561
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DHFRdm
<400> 46
atggttggtt cgctaaactg catcgtcgct gtgtcccaga acatgggcat cggcaagaac 60
ggggacttcc cctggccacc gctcaggaat gaatccagat atttccagag aatgaccaca 120
acctcttcag tagaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaagaagac ctggttctcc 180
attcctgaga agaatcgacc tttaaagggt agaattaatt tagttctcag cagagaactc 240
aaggaacctc cacaaggagc tcattttctt tccagaagtc tagatgatgc cttaaaactt 300
actgaacaac cagaattagc aaataaagta gacatggtct ggatagttgg tggcagttct 360
gtttataagg aagccatgaa tcacccaggc catcttaaac tatttgtgac aaggatcatg 420
caagactttg aaagtgacac gttttttcca gaaattgatt tggagaaata taaacttctg 480
ccagaatacc caggtgttct ctctgatgtc caggaggaga aaggcattaa gtacaaattt 540
gaagtatatg agaagaatga t 561
<210> 47
<211> 187
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> DHFRdm
<400> 47
Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly
1 5 10 15
Ile Gly Lys Asn Gly Asp Phe Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Ser
20 25 30
Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln
35 40 45
Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys
50 55 60
Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu
65 70 75 80
Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp
85 90 95
Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met
100 105 110
Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His
115 120 125
Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu
130 135 140
Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu
145 150 155 160
Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp
180 185
<210> 48
<400> 48
000
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<400> 50
000
<210> 51
<400> 51
000
<210> 52
<400> 52
000
<210> 53
<400> 53
000
<210> 54
<400> 54
000
<210> 55
<400> 55
000
<210> 56
<400> 56
000
<210> 57
<400> 57
000
<210> 58
<400> 58
000
<210> 59
<211> 98
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> домен CH3
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнирный домен
<400> 60
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 61
<211> 110
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> домен CH2
<400> 61
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> домен белка CH3
<400> 62
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
100 105
<210> 63
<400> 63
000
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сигнальный белок
<400> 64
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro
1 5 10
<210> 65
<211> 134
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внеклеточный домен
<400> 65
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro
130
<210> 66
<211> 27
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Трансмембранный домен
<400> 66
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 67
<211> 50
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внутриклеточный домен
<400> 67
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
1 5 10 15
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
20 25 30
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
35 40 45
Arg Ser
50
<210> 68
<400> 68
000
<210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальный белок
<400> 69
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser
20
<210> 70
<211> 166
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внеклеточный домен
<400> 70
Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe
1 5 10 15
Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser
20 25 30
Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys
35 40 45
Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala
50 55 60
Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser
65 70 75 80
Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly
85 90 95
Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile
100 105 110
Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val
115 120 125
Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp
130 135 140
Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu
145 150 155 160
Pro Gly His Ser Pro Gln
165
<210> 71
<211> 27
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Трансмембранный домен
<400> 71
Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val
20 25
<210> 72
<211> 42
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внутриклеточный домен
<400> 72
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 73
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальный белок
<400> 73
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala
20
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внеклеточный домен
<400> 74
Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys
1 5
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Трансмембранный домен
<400> 75
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 76
<211> 113
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внутриклеточный домен
<400> 76
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 77
<211> 29
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ITAM I
<400> 77
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
1 5 10 15
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
20 25
<210> 78
<211> 29
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ITAM 2
<400> 78
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
1 5 10 15
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
20 25
<210> 79
<211> 29
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ITAM 3
<400> 79
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
1 5 10 15
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
20 25
<210> 80
<211> 66
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Лидерная
<400> 80
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 81
<211> 734
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2scFV
<400> 81
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gttccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa aggcagtact agcggcggtg gctccggggg cggatccggt 360
gggggcggca gcagcgaggt tcagctggtg gagtctggcg gtggcctggt gcagccaggg 420
ggctcactcc gtttgtcctg tgcagcttct ggcttcaaca ttaaagacac ctatatacac 480
tgggtgcgtc aggccccggg taagggcctg gaatgggttg caaggattta tcctacgaat 540
ggttatacta gatatgccga tagcgtcaag ggccgtttca ctataagcgc agacacatcc 600
aaaaacacag cctacctgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 660
tgttctagat ggggagggga cggcttctat gctatggact actggggtca aggaaccctg 720
gtcaccgtct cgag 734
<210> 82
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Шарнирный спейсер
<400> 82
gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 83
<211> 84
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD28tm
<400> 83
atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtg 84
<210> 84
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 4-1BB
<400> 84
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 85
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 85
cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336
<210> 86
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T2A
<400> 86
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta gg 72
<210> 87
<211> 1074
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> tEGFR
<400> 87
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600
cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660
ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720
aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780
acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840
gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900
gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960
ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020
ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированный ScFv, содержащий вариабельную легкую цепь,
содержащую последовательность CDRL1
<400> 88
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRL2
<400> 89
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRL3
<400> 90
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH1
<400> 91
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH2
<400> 92
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH3
<400> 93
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 94
<211> 18
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гибкий линкер между цепью VH и цепью VL в
scFv
<400> 94
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<---
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой систему для индуцируемой экспрессии полинуклеотида, кодирующего химерный антигенный рецептор (CAR). Указанная система включает индуцируемый промотор, конститутивный промотор, активирующий стимулятор, включающий анти-CD3 и/или анти-CD28 антитела и тамоксифен, метаболит тамоксифена или аналог тамоксифена. Настоящее изобретение раскрывает также клетку-хозяина, содержащую указанную систему, для клеточной иммунотерапии, способ её получения, фармацевтическую композицию, содержащую указанную клетку, а также способ осуществления иммунотерапии с использованием указанной клетки. Настоящее изобретение позволяет получать генетические конструкции, содержащие CAR, для лечения рака, которые обеспечивают повышенную выживаемость и эффективность в условиях in vivo, сводя при этом к минимуму нежелательные побочные эффекты. 6 н. и 25 з.п. ф-лы, 19 ил., 14 табл.
1. Система для индуцируемой экспрессии полинуклеотида, содержащая:
a) первую нуклеиновую кислоту, содержащую индуцируемый первый промотор, содержащий последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:41, причем указанный первый промотор функционально связан с указанным полинуклеотидом;
b) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую конститутивный второй промотор, функционально соединенный с нуклеиновой кислотой, кодирующей активатор транскрипции для первого промотора, причем указанный активатор транскрипции содержит полипептид HEA-3;
с) активирующий стимулятор, включающий анти-CD3 и/или анти-CD28; и
d) тамоксифен, метаболит тамоксифена или аналог тамоксифена.
2. Система по п. 1, отличающаяся тем, что указанный второй промотор представляет собой промотор EF1α.
3. Система по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный активатор транскрипции содержит полипептид, по меньшей мере на 95% идентичный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40.
4. Система по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный активатор транскрипции содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
5. Система по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанная первая нуклеиновая кислота дополнительно включает первый вектор, и вторая нуклеиновая кислота дополнительно включает второй вектор.
6. Система по п. 5, отличающаяся тем, что первый и второй векторы упакованы в вирусный вектор.
7. Система по п. 6, отличающаяся тем, что указанный вирусный вектор представляет собой лентивирус.
8. Система по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что указанные первая и вторая нуклеиновые кислоты включают вектор.
9. Система по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что указанная первая нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер.
10. Система по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что указанная вторая нуклеиновая кислота дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую селективный маркер.
11. Система по любому из пп. 1-10, отличающаяся тем, что указанный первый промотор находится в противоположной ориентации по отношению ко второму промотору.
12. Система по любому из пп. 1-11, отличающаяся тем, что указанный полинуклеотид кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), причем указанный CAR содержит лигандсвязывающий домен.
13. Система по п. 12, отличающаяся тем, что указанный лигандсвязывающий домен представляет собой фрагмент антитела.
14. Система по п. 12 или 13, отличающаяся тем, что указанный лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент.
15. Система по любому из пп. 12-14, отличающаяся тем, что указанная опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR.
16. Клетка-хозяин для клеточной иммунотерапии, содержащая систему по любому из пп. 12-15.
17. Клетка-хозяин по п. 16, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой цитотоксический CD8+ Т-лимфоцит, выбранный из группы, состоящей из наивных CD8+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток центральной памяти, CD8+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD8+ Т-клеток.
18. Клетка-хозяин по п. 16, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой хелперный CD4+ Т-лимфоцит, который выбран из группы, состоящей из наивных CD4+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток центральной памяти, CD4+ Т-клеток эффекторной памяти и общей популяции CD4+ Т-клеток.
19. Клетка-хозяин по п. 16, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку-предшественника Т-лимфоцитов.
20. Клетка-хозяин по п. 16, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку.
21. Фармацевтическая композиция для клеточной иммунотерапии, содержащая эффективное количество клетки-хозяина по любому из пп. 16-20 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
22. Способ для получения популяции клеток для клеточной иммунотерапии в условиях in vitro, включающий:
a) обеспечение системы по любому из пп. 12-15; и
b) введение указанной системы в отдельную выделенную популяцию Т-лимфоцитов,
c) размножение популяции Т-лимфоцитов в условиях in vitro, и
d) культивирование популяции Т-лимфоцитов в присутствии (i) указанного тамоксифена, метаболита тамоксифена или аналога тамоксифена, (ii) указанного активирующего стимулятора, включающего анти-CD3 и/или анти-CD28, и (iii) по меньшей мере одного гомеостатического цитокина таким образом, что популяция Т-лимфоцитов значительно увеличивается, для применения в виде клеточной инфузии.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанная популяция Т-лимфоцитов представляет собой CD8+ или CD4+.
24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что выделенная популяция Т-лимфоцитов содержит клетки-предшественники Т-лимфоцитов.
25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанные клетки-предшественники Т-лимфоцитов представляют собой гемопоэтические стволовые клетки.
26. Применение клетки-хозяина по любому из пп. 16-20 в комбинации с тамоксифеном, метаболитом тамоксифена или аналогом тамоксифена для лечения рака, причем указанная опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR.
27. Применение по п. 26, отличающееся тем, что указанный рак представляет собой солидную опухоль или гематологическое злокачественное новообразование.
28. Применение по п. 26 или 27, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака мозга, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников.
29. Способ осуществления клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего рак, включающий: введение клетки-хозяина по любому из пп. 16-20 субъекту в комбинации с тамоксифеном, метаболитом тамоксифена и аналогом тамоксифена, причем указанная опухолеспецифичная молекула выбрана из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, CE7, EGFR, hB7H3, мезотелина, c-Met, PSMA, Her2, GD-2 и MAGE A3 TCR.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанный рак выбран из солидной опухоли или гематологического злокачественного новообразования.
31. Способ по п. 29 или 30, отличающийся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, рака мозга, рака легких, рака толстой кишки, рака почек, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и рака яичников.
| JENSEN M.C., et al., Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor‐modified T cells, Immunological reviews, 2013, 257(1), 127-144 | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| US 7709253 B2, 04.05.2010 | |||
| Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор | 1923 |
|
SU2005A1 |
| ПРОЦЕНКО С.А., Поиски путей индивидуализации противоопухолевой терапии, Практическая онкология, Т | |||
