СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12R1/02 

Использование: Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологической промышленности, и может быть использовано для получения грамицидина С высокоэффективным микробиологическим способом,

Сущность изобретения: способ включает периодическое культивирование продуцента грамицидина С Bacillus brevis штамм 101 на сбалансированной по составу среде и дополнительную подпитку концентратом питательного раствора в процессе выращивания, ввод которого производят при значениях аминного (восстановленного) азота в культуральной жидкости (КЖ) ниже 1,4 г/л до достижения значения не более 1,75 г/л при кислородном лимитировании в условиях обеспечения развивающихся культур кислородом за счет плавного повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10^-3 до 1·10^-3 моль O₂/л·мин и скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин при поддержании парциального содержания растворенного кислорода в культуре, близкого к нулю (0-10%), поддержания значения рН на уровне 6,5-6,8 и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы, о чем свидетельствует изменение концентрации биомассы (прирост или убыль) по оптической плотности на величину не более чем на 1 г/л.

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для организации высокоэффективного производства грамицидина С.

Известны способы получения грамицидина С при глубинном выращивании продуцента Bacillus brevis на синтетических средах [1-6].

Существующий периодический процесс получения грамицидина С при выращивании наиболее продуктивных штаммов Bacillus brevis, выбранный в качестве прототипа [8], который использовали для синтеза продукта при выращивании Bacillus brevis штамма 101 [7], характеризуется тем, что производится одноразовая загрузка питательной среды в ферментер, инокуляция посевным материалом, культивирование при аэрации и перемешивании в течение 27 часов до достижения величины рН 6,0 и ниже.

Анализ этого способа показал, что ферментационная среда содержит весь запас питательных субстратов с момента посева. Следовательно, ранее при культивировании Bacillus brevis для роста и биосинтеза грамицидина С не использовали подпитки концентратами питательных растворов оптимизированного состава, как они использовались в [9]. Питательная среда прототипа не оптимальна, поскольку недостаточна по отдельным элементам питания (фосфор и магний), и в то же время содержит в избытке другие (глицерин и щавелевокислый аммоний). В результате высокой ингибирующей концентрации глицерина и аминного азота (2,0-3,0 г/л) в среде рост продуцента замедлен. Вследствие недостатка минеральных компонентов концентрация биомассы составляла всего около 10 г/л в среднем и не более 15 г/л. Высокая концентрация молочной кислоты (10,5 г/л) способствует накоплению клонов, не продуцирующих грамицидин С. При выращивании продуцента на этой среде величину рН не регулировали, и она снижалась до значений ниже 6,0. Низкая скорость массопередачи по кислороду (1,28·10^-2 г О₂/л·мин) при аэрации 0,66 л/л·мин и перемешивании (259-303 об/мин) также не способствовала получению культуры с высокой концентрацией биомассы и продукта. По этой причине содержание грамицидина в культуре в лучшем случае составляло около 2 г/л.

Целью изобретения является увеличение выхода грамицидина С в процессе периодического культивирования Bacillus brevis.

Использование предлагаемого способа позволяет получить более 3,0 г/л грамицидина С. Сущность изобретения заключается в том, что с целью увеличения выхода грамицидина С при глубинном выращивании продуцента Bacillus brevis на синтетической среде выращивание производят на среде следующего состава:

- глицерин - 20 мл/л,

- пищевая 40% молочная кислота - 2-4 мл/л;

- автолизат дрожжей - 0,1 г/л (по аминному азоту);

- гидролизат казеина - 0,2 г/л (по аминному азоту);

- хлористый аммоний, NH₄Cl - 0-3,4 г/л;

- двузамещенный фосфорнокислый аммоний, (NH₄)₂HPO₄(ДАФ) - 0,85-4,5 г/л;

- калий фосфорнокисный однозамещенный, KH₂PO₄ - 0-1,0 г/л;

- магний сернокислый, 7-водный, MgSO₄·7H₂O - 0,9 г/л;

- натрий лимоннокислый, одноводный - 1,0 г/л.

Содержание в среде аминного (восстановленного) азота - 1,3-1,6 г/л.

Способ включает дополнительную подпитку концентрированным питательным раствором, в состав которого входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1: (0,008-0,032):(0,027-0,036):(0-0,008):(0,002-0,008), ввод которого производят при значениях аминного азота в культуральной жидкости ниже 1,4 г/л до достижения концентрации не более 1,75 г/л при ограничении роста недостатком кислорода в условиях плавного повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10^-3 до 1,0·10^-3 моль O₂/л·мин и скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин и поддержания парциального содержания растворенного кислорода в культуре, близкого к нулю (0-10%), поддержания значения рН на уровне 6,5-6,8 и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы, о чем свидетельствует изменение концентрации биомассы (прирост или убыль) по оптической плотности, на величину не более чем на 1 г/л.

Пример 1.

Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л.

Характеристика посевного материала:

- объем 0,5 л,

- типичная морфология,

- биомасса 2,5-3,5 г/л,

- рН 6,4-6,7.

Таблица 1 Состав среды для выращивания в ферментере Компоненты на 1 л среды Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1 Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2 Цитрат натрия, г/л 1,0 КН₂РO₄, г/л 1,0 (NH₄)₂НРO₄, г/л 4,5 MgSO₄·7H₂O, г/л 0,9 Молочная кислота пищевая, 40%-ный р-р, мл/л, 2,0 Глицерин, мл/л 20,0 Вода, л до 1,0 Пеногаситель (лапрол), мл 1,0 КОН (15% раствор)   - подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8 - подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8 НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8

Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода 0,5 л посевного материала) производили по табл.1. В состав концентрированного питательного раствора (концентрата) входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый аммоний и 7-водный сернокислый магний при соотношении глицерина, молочной кислоты, азота и магния 1,0:0,032:0,027:0,002. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного ценообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрированный питательный раствор и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин. Подачу концентрата по ходу ферментации осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывала повышение аминного азота в КЖ на 3,67·10^-2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 461 об/мин, поддерживая рO₂ на уровне 0-10%.

Таблица 2 Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л τ, ч n, об/мин K_La, n·10^-3 моль O₂/л·мин рO₂, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C 0 202 0,25 100 6,9 1,38 0,43 н/о н/о 3 230 0,29 1,4 6,9 1,38 0,78 н/о н/о 6 253 0,32 1,2 6,9 1,41 1,25 н/о н/о 9 270 0,34 1,3 6,8 1,31 2,30 н/о н/о 12 281 0,36 1,4 6,9 1,38 3,34 0,412 5,4 15 300 0,39 0,9 6,7 1,54 4,39 0,655 5,6 18 348 0,49 3,0 6,7 1,68 6,90 1,085 5,8 21 354 0,50 1,7 6,7 1,40 9,57 1,465 5,3 24 393 0,60 1,5 6,6 1,40 12,54 2,346 6,0 27 393 0,60 0,9 6,6 0,91 18,10 2,700 5,8 30 405 0,64 0,8 6,6 0,84 22,60 3,722 8,4 33 450 0,71 9,7 6,7 0,70 27,10 4,287 6,9 36 461 0,83 10,0 6,6 0,49 29,30 4,710 6,4 38 461 0,83 4,5 6,6 0,49 28,20 4,944 6,4

Данные табл.2 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 38 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 461 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рO₂ на уровне 0,9-10%. При этом скорость массопередачи возрастала с 0,25·10^-3 моль O₂/л·мин до 0,83·10^-3 моль О₂/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO₂ 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,68 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.

Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 33-й час. Выращивание было остановлено через 4-5 часов после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 28-29 г/л биомассы и 4,944 г/л грамицидина С с содержанием примесей 6,4% от грамицидина С.

Пример 2.

Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л.

Характеристика посевного материала:

- объем 0,5 л,

- типичная морфология,

- биомасса 2,5-3,5 г/л,

- рН 6,4-6,7.

Таблица 3 Состав среды для выращивания в ферментере Компоненты на 1 л среды Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1 Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2 Глицерин, м/л 20,0 NH₄Cl, г/л 3,4 (NH₄)₂НРO₄, г/л 0,85 MgSO₄·7H₂O, г/л 0,9 Молочная кислота пищевая 40%-ный р-р, мл/л, 4,0 Цитрат натрия, мл/л 1,0 Вода, л до 1,0 Пеногаситель (лапрол), мл 1,0 KОН (15% раствор)   - подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8 - подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8 НСl (10% раствор), при
необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8

Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода посевного материала) производили по табл.3. Использовали концентрированный питательный раствор (концентрат), в состав которого входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорно-кислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1:0,008:0,036:0,005:0,008. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного ценообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин.

Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывает повышение аминного азота, в КЖ на 5,27·10^-2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 500 об/мин, поддерживая рO₂ на уровне 0-10%.

Таблица 4 Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л τ, ч n, об/мин K_La, n·10^-3 моль O₂/л·мин рO₂, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C 0 202 0,25 100 6,7 1,47 0,37 н/о н/о 3 202 0,25 2,4 6,8 1,40 0,68 н/о н/о 6 225 0,28 2,2 6,6 1,26 2,04 н/о н/о 9 247 0,31 3,3 6,7 1,33 3,45 н/о н/о 12 270 0,34 2,2 6,6 1,26 4,81 0,576 4,22 15 298 0,39 1,5 6,6 1,40 7,32 0,998 6,10 18 320 0,43 1,7 6,6 0,91 9,64 1,639 9,30 21 343 0,48 1,8 6,6 0,84 13,49 2,297 8,90 24 393 0,60 2,0 6,6 0,84 16,94 3,163 8,90 27 393 0,60 2,0 6,6 0,84 21,34 3,360 8,28 30 450 0,78 2,2 6,6 0,77 26,15 4,083 8,60 33 500 0,99 2,8 6,6 0,98 28,24 4,162 8,30 36 500 0,99 2,4 6,6 0,77 33,89 4,553 9,10 39 500 0,99 2,4 6,6 1,05 37,68 4,772 8,90 42 500 0,99 63,0 6,8 1,05 38,01 5,282 8,44

Данные табл.4 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 42 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 500 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая pO₂ на уровне 1,5-10%. Скорость массопередачи возрастала с 0,25·10^-3 моль O₂/л·мин до 0,99·10^-3 моль O₂/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO₂ 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,47 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.

Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 38 г/л биомассы и 5,282 г/л грамицидина С с содержанием примесей 8,44% от грамицидина С.

Пример 3.

Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 100 л. Посевной материал готовили в 10-литровом ферментере.

Характеристика посевного материала:

- объем 5,2 л,

- типичная морфология,

- биомасса - 2,93 г/л,

- рН 6,4.

Таблица 5 Состав среды для выращивания в ферментере «Биор 0,1» Компоненты на 1 л среды Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1 Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2 Цитрат натрия, г/л 1,0 КН₂РO₄, г/л 1,0 (NH₄)₂НРO₄, г/л 4,5 MgSO₄·7H₂O, г/л 0,9 Молочная кислота пищевая 40%-ный р-р, мл/л, 2,0 Глицерин, мл/л 20,0 Вода, л до 1,0 Пеногаситель (лапрол), мл 1,0 КОН (15% раствор)   - подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8 - подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8 НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8

Рабочий объем ферментера 60 л, поэтому закладку компонентов на 60 л среды (с учетом ввода 5,2 л посевного материала) производили по табл.5.

В состав концентрированного питательного раствора (концентрата) входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый аммоний и 7-водный сернокислый магний при соотношении глицерина, молочной кислоты, азота и магния 1,0:0,032:0,030:0,002. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15%-ный раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин. Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 100 мл концентрата на 60 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,29·10^-2 г/л.

В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 502 об/мин, поддерживая рO₂ на уровне 0-10%.

Таблица 6 Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 100 л τ, ч n, об/мин K_La,n·10^-3 моль O₂/л·мин рO₂, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C 0 203 0,37 100 6,8 1,40 0,25 н/о н/о 3 203 0,37 0,2 6,8 1,40 0,68 н/о н/о 6 276 0,47 0,4 6,8 1,40 1,26 н/о н/о 9 321 0,55 0,5 6,7 1,40 2,09 н/о н/о 12 350 0,61 0,6 6,6 1,47 3,03 0,474 5,9 15 389 0,69 1,0 6,6 1,40 3,87 0,632 5,7 18 400 0,72 3,2 6,6 1,26 5,02 1,013 5,8 21 431 0,80 1,0 6,6 1,19 7,32 1,503 8,1 24 468 0,91 1,0 6,6 1,19 10,04 1,888 8,6 27 500 1,01 7,1 6,6 0,12 11,94 2,654 8,8 30 502 1,02 0,8 6,6 0,12 15,90 2,892 7,7 33 502 1,02 0,8 6,6 0,91 17,80 3,211 7,2 36 502 1,02 14,8 6,6 0,63 21,70 3,498 7,9 39 502 1,02 0,9 6,7 0,56 22,56 3,807 7,6

Данные табл.6 показывают, что выращивание продуцента в 100-литровом ферментере производили в течение 39 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 502 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рO₂ на уровне 0,2-15%. При этом скорость массопередачи возрастала с 0,37·10^-3 моль О₂/л·мин до 1,02·10^-3 моль O₂/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO₂ (0-10%) и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,4 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.

Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 36-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 22,5 г/л биомассы и 3,807 г/л грамицидина С с содержанием примесей 7,6% от грамицидина С.

Пример 4.

Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л. Характеристика посевного материала:

- объем 0,5 л,

- типичная морфология,

- биомасса 2,5-3,5 г/л,

- рН 6,4-6,7.

Таблица 7 Состав среды для выращивания в ферментере Компоненты на 1 л среды Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1 Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2 Глицерин, м/л 20,0 NH₄Cl, г/л 3,4 (NH₄)₂НРO₄, г/л 0,85 MgSO₄·7H₂O, г/л 0,9 Молочная кислота пищевая, 40%-ный р-р, мл/л, 4,0 Цитрат натрия, мл/л 1,0 Вода, л до 1,0 Пеногаситель (лапрол), мл 1,0 NaОН (15% раствор)   - подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8 - подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8 НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8

Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода посевного материала) производили по табл.7. Использовали концентрированный питательной раствор, в состав которого входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1:0,009:0,038:0,008:0,008. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого натрия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин.

Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,37·10^-2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 472 об/мин, поддерживая рO₂ на уровне 0-10%.

Таблица 8 Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л τ, ч n, об/мин K_La, n·10^-3 моль O₂/л·мин рO₂, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C 0 202 0,25 100 6,7 1,40 0,40 н/о н/о 3 202 0,25 0,4 6,8 1,12 0,84 н/о н/о 6 253 0,32 0,7 6,7 1,05 2,09 н/о н/о 9 292 0,38 2,1 6,9 0,91 3,45 н/о н/о 12 303 0,40 4,1 6,6 1,19 5,44 0,888 5,9 15 332 0,46 1,0 6,7 0,49 7,32 1,425 11,3 18 354 0,50 0,5 6,7 0,63 8,16 2,199 14,6 21 354 0,50 0,6 6,7 0,91 11,13 2,667 9,1 24 399 0,62 0,4 6,7 0,98 14,43 2,847 10,3 27 427 0,71 10,0 6,7 0,77 17,12 3,337 11,1 30 478 0,89 1,2 6,7 0,84 19,68 3,793 11,4 33 472 0,87 2,9 6,7 0,70 23,44 3,674 11,4 36 472 0,87 6,5 6,7 0,63 27,20 3,870 12,3 39 472 0,87 3,7 6,7 0,77 28,80 4,643 11,1 42 410 0,65 1,1 6,7 0,99 29,30 5,366 11,6

Данные табл.8 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 42 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 472 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рО₂ на уровне 1,5-10%. Скорость массопередачи возрастала с 0,25·10^-3 моль O₂/л·мин до 0,87·10^-3 моль O₂/л·мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO₂ 0-10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,4 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.

Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого натрия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 29 г/л биомассы и 5,366 г/л грамицидина С с содержанием примесей 11,6% от содержания грамицидина С.

Пример 5.

Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 100 л.

Посевной материал выращивали в 10-литровом ферментере.

Характеристика посевного материала для 100-литрового аппарата:

- объем 5,0 л,

- отсутствие посторонней микрофлоры,

- типичная морфология вегетативных клеток,

- биомасса 2,82 г/л,

- рН7.

Таблица 9 Состав среды для выращивания в ферментере «Биор 0,1» Компоненты на 1 л среды Дрожжевой экстракт (по аминному азоту), г/л до 0,1 Гидролизат казеина (по аминному азоту), г/л до 0,2 Цитрат натрия, г/л 1 КН₂РO₄, г/л 1 (NH₄)₂НРO₄, г/л 4,5 MgSO₄·7H₂O, г/л 0,9 Молочная кислота пищевая, 40%-ный р-р, мл/л, 2,0 Глицерин, мл/л 20,0 Вода, л до 1,0 Пеногаситель (лапрол), мл 1,0 КОН (15% раствор)   - подтитровать до стерилизации среды до рН 6,7-6,8 - подтитровать после стерилизации среды до рН 6,7-6,8 НСl (10% раствор), при необходимости, после стерилизации, до рН 6,7-6,8

Рабочий объем ферментера 60 л, поэтому закладку компонентов на 60 л среды (с учетом ввода 5,0 л посевного материала) производили по табл.9.

В состав концентрированного питательного раствора (концентрата) входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый аммоний и 7-водный сернокислый магний при соотношении глицерина, молочной кислоты, азота и магния 1,0:0,032:0,030:0,002. Для поддержания рН на уровне 6,6-6,7 использовали 15% раствор едкого калия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 мин.

Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 100 мл концентрата на 60 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,29·10^-2 г/л.

В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 502 об/мин, поддерживая pO₂ на уровне 0-10%.

Таблица 10 Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 100 л τ, ч n, об/мин K_La, n·10^-3 моль O₂/л·мин рO₂, % рН Аминный азот, г/л Биомасса, г/л Грамицидин С, г/л Примеси, % от грамицидина C 0 203 0,37 100 7,1 1,54 0,33 н/опр н/о 3 203 0,37 1,2 7,1 1,47 0,42 н/опр н/о 6 302 0,52 1,1 6,9 1,75 0,78 н/опр н/о 9 321 0,55 1,4 6,9 1,75 1,62 н/опр н/о 12 350 0,61 1,0 6,8 1,75 2,62 0,454 9,3 15 400 0,72 1,0 6,8 1,75 3,66 0,611 8,4 18 450 0,85 1,2 6,6 1,75 5,64 0,881 8,4 21 502 1,02 1,5 6,6 1,61 7,32 1,437 9,7 24 485 0,96 1,4 6,6 1,61 10,00 1,844 10,0 27 491 0,98 1,3 6,6 1,54 13,10 2,352 9,4 30 502 1,02 1,1 6,6 1,54 15,69 2,747 8,0 33 502 1,02 1,1 6,6 1,40 19,66 3,136 8,1 36 502 1,02 1,2 6,6 1,26 23,01 3,532 8,6 39 494 0,99 1,1 6,6 0,91 27,20 4,173 8,3 42 502 1,02 26,3 6,6 0,56 27,60 4,267 8,0

Данные табл.10 показывают, что выращивание продуцента в 100-литровом ферментере производили в течение 41 часа в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 502 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рO₂ на уровне 1,0-1,5. В процессе выращивания скорость массопередачи возрастала с 0,37·10^-3 моль O₂/л·мин до 1,02·10^-3 моль O₂/л·мин. Начиная с 8-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO₂ (0-10%) и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,75 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.

Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого калия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 2 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 27,6 г/л биомассы и 4,267 г/л грамицидина С с содержанием примесей 8,0%.

Источники информации

1. Коршунов В.В. Физиология обмена веществ Bacillus brevis subsp. G.-B. в связи с биосинтезом грамицидина С. - Канд. дисс., 1962, М., МГУ.

2. Коршунов В.В., Егоров Н.С. Синтетическая среда для развития Bacillus brevis и образование граммидина. Микробиология, 1962; 31:3, 515-519.

3. Шапошников В.Н., Работнова И.Л., Силаев А.Б. и др. Способ получения кристаллического грамицидина С. - Авторское свидетельство на изобретение №187243, 1963.

4. Куплетская М.Б. Влияние аэрации на развитие и образование граммидина культурой Bacillus brevis var. G.-B. Микробиология, 1965; 34:5, 905-909.

5. Жарикова Г.Г. Естественная изменчивость споровых бактерий и биосинтез полипептидных антибиотиков. - Докт. дисс., 1972, М., МГУ.

6. Березовская А.И., Выпияч А.Н., Егоров Н.С. и др. Штамм Bacillus brevis 101 - продуцент грамицидина С. - Авторское свидетельство на изобретение №686463, 1978.

7. Юдина Т.П. Физиолого-биохимические особенности продуцентов граммидина Bacillus brevis subsp. G.-B. и их вариантов. - Канд. дисс., 2002, М., МГУ.

8. Удалова Т.П. Особенности роста и развития Bacillus brevis var. G.-B в связи с биосинтезом грамицидина S. - Канд. дисс., 1979, М., МГУ.

9. Дербышев В.В., Глухов Н.Н., Клыков С.П., Набокова А.П., Щербаков Г.Я. Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов. - Патент РФ №2111246, 1992.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ культивирования Bacillus brevis штамм 101 для получения грамицидина С. Осуществляют глубинное выращивание культуры на синтетической питательной среде. Среда содержит автолизат дрожжей и гидролизат казеина в концентрациях 0,1 г/л и 0,2 г/л по аминному азоту, глицерин в концентрации 20 мл/л, пищевую 40%-ную молочную кислоту - 2,0-4,0 мл/л, хлористый фосфорно-кислый аммоний - 0-3,4 г/л, двузамещенный фосфорно-кислый аммоний - 0,85-4,5 г/л, фосфорно-кислый однозамещенный калий - 0-1,0 г/л, сернокислый 7-водный магний - 0,9 г/л, лимонно-кислый натрий - 1,0 г/л. Содержание аминного азота в исходной среде составляет 1,3-1,6 г/л. При снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л среду подпитывают концентрированным питательным раствором до концентрации 1,75 г/л. В состав концентрированного питательного раствора входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1÷(0,008-0,032)÷(0,027-0,036)÷(0-0,008)÷(0,002-0,008). В процессе роста скорость перемешивания увеличивают с 200 до 500 об/мин. Поддерживают рН на уровне 6,5-6,8 введением растворов едкого калия и натрия. Процесс останавливают через 2-6 ч после начала стационарной фазы. Способ позволяет воспроизводимо получать более 3,0 г/л грамицидина С. 10 табл., 5 пр.

Способ культивирования Bacillus brevis штамм 101 для получения грамицидина С, включающий глубинное выращивание культуры на синтетической питательной среде, содержащей автолизат дрожжей и гидролизат казеина в концентрациях 0,1 г/л и 0,2 г/л по аминному азоту соответственно, отличающийся тем, что выращивание производят на среде, в которой концентрации глицерина, пищевой 40%-ной молочной кислоты, хлористого и двузамещенного фосфорно-кислого аммония, фосфорно-кислого однозамещенного калия, сернокислого 7-водного магния и лимонно-кислого натрия составляют 20 мл/л; 2,0-4,0 мл/л; 0-3,4 г/л; 0,85-4,5 г/л; 0-1,0 г/л; 0,9 г/л и 1,0 г/л соответственно, и при содержании аминного азота в исходной среде 1,3-1,6 г/л с подпиткой концентрированным питательным раствором, в состав которого входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорно-кислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1÷(0,008-0,032)÷(0,027-0,036)÷(0-0,008)÷(0,002-0,008), подаваемым в ферментационную среду при значениях аминного азота в культуральной жидкости ниже 1,4 г/л до достижения концентрации не более 1,75 г/л, при ограничении роста недостатком кислорода в условиях повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25·10^-3 моль O₂/(л·мин) до 1,0·10^-3 моль О₂/(л·мин), достигаемого повышением скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин, при поддержании значений рН в диапазоне 6,5-6,8 введением стерильных растворов едкого калия или натрия и при остановке процесса выращивания через 2-6 ч после начала стационарной фазы.