Способ получения биомассы Советский патент 1979 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ НОИ среде, содержащей окисленные углеводороды в. качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли при 45-65°С, предпочтительно при 50-60°С. Концентрацию субстрата в ферментере поддерживают на уровне 0,01-5 объем/об.% для ис слючения торможения роста бактерий. Кислород подают в культуральную среду в любом виде, способном легко ассимилировать ся внесенными микроорганизмами. Можно использовать молекулярный кислород, которьш содержится в воздухе, например при атмосфер ном или повышенном давлении, или в воздухе обогащенном кислородом, или из другого доступного источника в зависимости от условий проведения процесса. Воздух с нормальным содержанием кислорода подают в количестве 0,1-10, предпочтительно 0,7-2,5 объем/мин на объем жидкости и ферменте или в пересчете на кислород, соответственно 0,02-2,1 и 0,14-0,55. Давление в процессе микробиологической ко1шерсии поддерживают от 0,1 до 100 ат, предпочтительно от 1 до 30 ат, а еще предпочтительнее немного выше атмосферного, учитывая растворимость кислорода. Использование давления немного выше атмос ферного способствует повышению концентрации кислорода, растворенного в водной культуральной среде, что в свою очередь способствует повыше шю скорости роста клеток. В качестве окисленных углеводородов исполь зуют спирты, кетоны, сложные и простые зфиры, кислоты и альдегиды, по существу водорас воримые, но содержащие до 10 углеродных ато мов в молекуле. Из окисленных углеводородов используют следуюцще соединения: метанол, этанол, пропанол,бутанол,пентанол,гексанол,гептандиол-1,7; гептанол-2; 2-метилпентанол-4; пептановая кислота; 2-метилбутановая кислота; пентанол-2; 2-метилбутанол-4,2-метилбутанол-3; бутанол-2; 2-метш1пропанол-1,2-метилпропанолпро1 ол-2; муравьиная, уксусная, пропановая кислоты; формальдегид; ацетальдегид; про паналь; бутаналь; 2-метил-пропаналь ; бутановая кислота; 2-мегилпропионовая кислота; пентановая кислота; глутаровая кислота; гексанов кислота; 2-метилпентановая кислота; гептадионовая ютслота; гептановая кислота; гептанон-4; гептанон-2; октановая кислота; 2-этил-гексановая кислота; глицерин; эхиленгликоль; пропиленгяиколь; метил-зталовый эфир; диметиловый эфир; ди-н.пропиловый эфир; пропанон-2; бутанон-2; диэтиловый зфир; н.пронилизопропиловьш эфир, включая смеси двух или более из них, а также материал под названием меггиловое топливо, представляющий собой смесь метанола и регулируемого количества высших спиртов, содержащих до 4 атомов углерода в молекуле. Источником азота может слулсить азотосодержшцее соединение в виде, пригодном для метаболического использования микроорганизмами. Используют также различные источники органического азота, например, белки, мочевину и т. п., но практически используют неорганические источники азота, например аммиак, едкий аммогшй, различные -соли аммония, в частности цитрат, фосфат, сульфат и пирофосфан аммония Удобен для использования газообразный аммиак путем барботирования через водную куль±уральную среду. рН культуральнойосреды поддерживают от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8, при этом бактерии рода Bacillus штаммы NRRL В-8065 или NRRL В-8066 предпочитают для роста соответственно рН от 6,2-6,8 и от 6,2 до 6,5 причем в среде УМ2. Кроме источников углерода, азота, кислорода Б кульгуральную среду вводят необходимые минеральные соли для обеспечения роста микроорганизмов и доведения до максимальной ассимиляции окисленного углеводорода клетками в процессе микробиологической конверсии. Из минеральных солей используют ионы фос фора, магния, кальция, натрия, марганца, молибдена и меди. Состав среды (УМ2 - твердая), г: монокалийфосфат 2,0; дикалийфосфат 3,0; сернистый. магНИИ семиводный 0,4; хлористый кальций двухррдньш 0,04; шорис1ьш Натрий 0,1; сульфат аммония 2,0; агар. 15,0; дистиллированная во да 1000 мл. Добавляют также раствор следовых минералов,г:сульфат меди 0,06; йодистый калий 0,08; гидрат сульфата марганца 0,3; молибдат натрия двухводньш (Na2MoO4 2Н20) 0,2; рная кислота 0,02; сульфат цинка семиводный 2,0; хлорное железо шестяводное 4,8; дистиллированная вода 1000 и серная кислота (конц) 3 -мл. Перед употреблением вносят в среду стерильный метанол до 1,5 об.%. В случае жидкой среды агар невносят Другие материалы, например дрожжевой, экстракт, витамины, биопш и г. п., илн другие факторы роста добавляют в количествах, извес1ш к:в области ферментации. Бактерии рода Bacillus штаммы NRRL В8065 и NRRL В-8066 хр.анят в коллекции США под номерами 47 и 72 соответственно (департамент сельского хозяйства, служба; сельхознсследования. Исследовательская лаборатория Северных районов, Пеория, Иллинойс, 61604). Эти штаммы являются высокопродук-пшиыми при относительно высокой температуре фер ментации. Культура N 47 NRRL В-8065 грамположитель ная, спорообразующий микроб формы толстой палочки, окрашенного пигмента не имеет. Культура № 72 NRRL В-8066 грамположител йая, спорообразуюший микроб формы толстой палочки, окрашенного пигмента не имеет. Характеристика и свойства используемых бактерий в сравнении со cвoйcтвa ш известных. культур рода. Bacillus приведены в табл. 1. В случае промьппленного продуцирования больших количеств микробных клеток процесс выращивания проводят иепрерьшно, и все оборудование, включая реактор или ферментеры, контейнеры,Трубопроводы, охлаждающие или циркуляционные приспособлеютя, стерилизуют с помощью пара при 121°С, например, 15 лшн. Простерилизованный реакторинокулируют куль турой микроорганизма в присутствии всех необходимых питательных веществ. С началом роста культуры непрерьгено подают раздельно воздух, питательную среду, источник азота и окислеиньш углеводород. Скорость подачи потоков ингредиентов может колебать ся для поддержания возможно быстрого роста клеток при эффективном использовании подаваемого окисленного углеводорода и при обеспечении высокого выхода веса клеток на вес загруженногоисточника углерода. Скорость подачи источника углерода регулируют так, -что подаваемое в ферментер количество равно количеству, потребляемому микроорганизмами для исключения пересьпценности в частности токсическими материалами,напрИ мер спиртом или альдегидом,которые могут тормозить рост или приводят к гибели микроорганизмов. Сырье стерилизуют до момента его подачи в ферментер. В случае, если окисленный углеводород, например метанол, этанол или формальдегид, име ет способность стерилизовать прочие материалы то целесообразно добавлять этот компонент в прочие потоки, например в минеральную среду при этом последнюю в. зтом случае уже не подвергают отдельной стерилизации при помощи тепла и т. п. Выращивание микроорганизмов ведут в ферментере известного типа, предпочтительно заполненном пеной, которая образуется при используемой згемпературе ферментации и обеспечивает высокую степень роста. В этом случае необходимо следить за скоростью роста во избежание выброса пены из ферментера, что может привести к уменьшению в нем объема жидкости и потере.содержимого, Попа Ciivicouorriyoi Гакже высокому содержа П11о в снсюме p:icTi.ioренного кислорода и uoBbiineiinorviy его переносу, необход 1мому для по/шержпичя зысокон плогносш клеток и бысфому росту лгик оор.гаШ13МОВ. Как; клеточный, так н BneK.iCTOiiibiu ,т извлекают известнылш способаг п. Кчеткн выделяют из зфлюешя. фер:1;С1) лутем фугования, фнлыраини и г. п. 3(J)jiiuc;ri, освобожденный от клеток, можмо об;.;;ботать ацетоном и.чи пнзкям спирю ;. мзиример этанолом или метанолом,, дая осяэдяения полученного вне;слсточиогЬ поллмер.мо; о магеришта. Эфлюенг можно также обработать методом сольвентной эксаракнии н/нди эр;сгракц;1ч щелочью дая извлечега других Бие ;легочуых продуктов, нл.11ример хшгменто., В1пал;и1;ов 1ыц оргаштеских кислот, no.Ji}u:}ini-.;x к T poi;cccc выращивания. Пример 1. Лроподяг непрерывньи- ир; цесс ферментации, для берут 500 глл пиокулума водной днсперснк к.петок icy.JMypT. № 72 NRRLjB-S066 и bipaui;-i;iK T 2 м на среде ВК-М с 1,5 о6.% метат;ола. Сое гаи сроды ВН-М, г/л монокалиифосфат 2,0; днка.ппйфосфат 3,0; сульфат магния се ,:мводныГ; 0,4; хлористый кальций двухлодныГ О.ОК су.И.ф.п аммо1шя 2.0. и 10 мл/J ряствпра aic.,. .-Ir нералов. Раствор следовьгх шягерплоп имеет слещющий состав, г/л: сульфат железа семнводпый 0,11; сульфат щшка сгмиподный 0,0.3; с 71ьфат меди пятцводцый 0,02; сульфат маргамп; (гидрат) 0,02 и 1 .Л.п/л концетир фоваинс серной кислоты. Указанный инокулум вносят в ферментер, имеющий перемеашва1оил.ее и аэрг:рую1цее устройства, с 2 л среды (на BOi onpoi o..uHou воде) сл.едующим образом. Состав среды Фосфорная кислота 85%. мл2,0 Хлористый .калий, г1,0 Сульфат магния семиводпый. г1,5 Хлористый.кальций двухводный, г0,2 Хлористый натрий, г0,1 . Раствор следовых минералов, мл10,0 Дистиллирова1шая вода, лдо 1 Состав раствора следовь х минералов, r/jc сульфат меди пятиводный 0,06; иощ{С1ЫЙ кг,лий 0,08; хлорное железо .несгиводное 4,80; сульфат марганца (гидрат) 0,30; мозгибдат натрия двухводный 0,20; сульфат iijiHica семкводный 2,00; борная кислота 0,02; коиценгрированная серная кислота 3 мл и .шкчнл.тироваиная вода до 1 л. Первоначальное coдepжa шe метанола 1,5 об.%/объем рН-6,7,.температура 55°С, скорость перемешивания содеожимого 1000 об/мин, воздух подают со скоростью 2 л/мин.Непрерывно подают едкий аммоний для поддержания jpH в интервале 6,1-6,9 а также.используя его в качестве источника азота. Затем, после хорошего размножения ннокур-м ма, подают непрерьшно питательную среду с со держанием метанола 5% (объемы) и отводят соотеетствуюший объем эфлюента из фермен-, тара. Скорость подачи питательной среды 150800 мл/час в течение 800 ч со средней продолжительностью удержания клеток в ферментере от 2,4 до 5 ч. Из эфлюента через некоторое время отбирают пробы для извлечения клеток, которые сушат, взвешивают и анализируют на белок. / Концентрация клеток составляет от 12 г/л (сух. вес) в начале опыта (24 ч) до 18 г/л че. рез 190 ч и до 24 г/л в конце опыта. Конвер-. сия метанола в извлекаемые клетки достигает 44% (от исходного загружаемого). Таким образом, бактерии рода Bacillus штам NRRL можно легко вьфащивать непрерьшным способом при 55° С на метаноле в качестве источника углерода. Клет1си этого вида содержат высокое процентз1ое содержание белков. Пример 2. В другом типе ферментера непрерьшного действия выращивают культуру NRflL В 8066 как описано в примере 1. Ферментер шюкулируют 500 мл водной дисперсии культуры, выращенйой в течение 26 ч на среде УМ 2 с 1,5 об.% метанола (состав среды опи сан выше). Инокулум вносят Б ферментер, как описано в Примере 1. Ферментер содержит 2 л среды FM--12, описанной в примере 1 затем исключением, что в среду добавляют лишь 5 мл/л раствора следовых минералов. Первоначальное содержание метанола 1,5 аШ.%/объем рН-7,1 и температура 53°С. В течение первых двух часов перемешивания и объем подаваемого воздуха медленно повышают до 800 объем/мин и 2 л/мин соответстве но. Для п одцержанкя рН 7-7,2 и в качестве источ1шка азота вводят едкий аммоний. После установления хорошего роста инокулу ма в течеьше первых 24 ч подают непрерывно питательную среду, содержащую 7,5 об.% метанола и 0,05 г/л гидрата сульфата марганца и отводят соответстаующие эфлюенты из ферментера.. Скорость питагельной среды составля ет 200-400 мл/час в течение 94 ч. Средняя про должительность удерживания в ферментере составляет 3-5 ч. Эфлюент из ферментера периодически проверяют взятием проб, извлекают 1слетки, сушат и взвешивают. Концентрация клеток после 24 ч составляет 17-26 г/л (сух. вес). Конверсия метанола в извлекаемые клетки составляет 43% от загруженного. Пример 3. Проводят непрерывную ферментацию, используя культуру.№ 47 NRRLB-8065. В ферментер загружают 2 л среды FM-12,описанной в примере 2, но с использованием обессоленной воды. Затем загружают 500 мл водной дисперсии культуры № 47 NRRL В-8065, выращенной в течение 11 ч на среде ЗМ2 с 1,5 об.% метанола. Первоначальное соде13жание метанола 1,5 об.%/объем рН-6,45, температура 54°С. Едкий аммоний вносят, как в примерах 1 и 2, для поддержания рН 6,3-6,6 и в качестве источника азота. Перемешивание и подачу воздуха постепенно повышают до 400 об/мин и до 0,5 л/мин соответственно в течение 7ч. После 11 ч непрерьшно подают питательную среду FM-12, приготовленную на водопроводной во- . де с 2,5 об.% метанола и добавлением солей по 1 г/л КН2Р04 и К2НРО4 каждой и небольшого, количества противопенного средства. Через28 ч «подачу изменяют, добавляя гидрат сульфата марганца до увеличения его концентрации (в сырье) в два раза, для стимулирования потреблешя клетками кислорода. В течение 101,5 ч опыта вносят дополнительные количества .сяед;овыхминералов. Как установлено, они не оказьшают стимулирующего действий на рост клеток. Кроме воздуха в ферментер после 24 ч. работы подают кислород со скоростью от 0,12 до 0,4 л/мин. За это время соответственно; повышают скорость перемещивания от 400 до 800 об/мин. Из эфлюента периодически отбирают пробы для извлечения клеток, которые сзоцат и взвещивают. Скорость подачи среды повышают от 300 мл/час при 28 ч до 850 мл/час к 71 ч и 1070 мл/ч к 95 ч. Продолжительность пребьшания клеток колеблется от 1,8 до 2,5 ч в течение последних 30 ч. Концентрация, клеток достигает 7-10 г/л (сухой вес), а конверсия метанола в извлекаемые клетки 50% от загруженного. Таким образом, культура № 47 NRRL В-8065 дает достаточный выход микробных клеток при выращивании на метаноле в качестве единственного источника углерода при относительно высокой температуре ферментации. 97 Пример 4. Содержание белка в клетках новых видов Bacillus 70-85 вес.%, причем эта величина получена умножением весового процента азота (по Къельдалю) в сухих клетках на коэффициент 6,25. При гидролизе высушенных клеток и анализе на аминокислоты методом газовой хроматографии устанавливают, что содержание белков находится в пределах 55-70 вес.%. Распределения аминокислот в образце бактериальных клеток с использованием культуры № 72NRRL В-8066 следующее. Незаменимые аминокислоты, г/100 г сухих клетокутёйцин 5,52;изолейцин 4,68; лизин 5,36; метионин 1,8; цисгин 0,05; треонин 2,93; фенилаланин 2,72; тирозин 2,00; триптофан 0,79; , валин 5,25. Заменимые аминокислоты, г/100 г сухих кле ток: апанин 5,83; аргинин 2,93; аспарагиновая кислота 6,38; глицин 3,76; глутаминовая кисло та 9,95; гистидин 1,18; пролин 2,37; серин 1,9 всего - 65,04. Всего незаменимых аминокислот 30,68, причем содержанке цистина и мегионйна сравнитель но невелико. При этом некоторые образцы клеток имеют 0,00 г цистина на 100 г сухих клеток, что может быть отрегулировано добавлением соответствуютцих количеств синтетического цистина или метионина в рацион. Пример 5. Проводят контрольный опыт, в котором несколько культур термофильных микроорганизмов из рода Bacillus испытывают на рост при 55°С в разнообразных средах, используя при этом Bacillus ( subtilis АТСС 10774, Bacillus stearothermophilis АТСС 12987, Bacillus stearothermophilis NRRL B1102; Bacillus coagulaus NRRL B 1103; Bacillus coagulans NRRL В 1168 H Bacillus licheniformis NRRLBIOOb Результаты испытаний приведены в табл. 2. В качестве питательного бульона (ПБ) служит культуральная жидкость; содержащая 3 г/л мясного экстракта и 5 г/л пентона.; Среда ЗМ2 описана ранее, но в случае жидкой среды не . вводят агар. Результаты опытов показьшают, что бактерии NRRL В-1102 не растут даже на питательном бульоне, АТСС 10744 не растет в присутствии метанола. Прочие культуры, размножаясь в присутствии метанола; не.способны использовать последний в качестве единственного истошика углерода и энергии .для своего роста. Получаемая по предлагаемому способу биомасса является це1шым источником белков или протеинов для людей и животных, при , этом в случае потребления в качестве пищи людьми клетки можно обрабатьюать различнымя веществами для снижения содержания нуклеиновых кислот, а при употреблении же их в качестве кормов для животных подобная обработка не обязательна.

Т а б л и ц а 2

Примечание: (+) - заметный рост

(-) - отсутствие роста,

Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 553281 кл. С 12 D 13/06, 1974.