СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ АЭРОБНОРАСТУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для организации высокоэффективных производств биомассы микроорганизмов.

Существующие периодические процессы с добавлением субстрата [1, 2] характеризуются тем, что производится одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации или в анаэробных условиях и дробное введение субстрата. Эти процессы реализуются либо для поддержания физиологических условий культивирования (например, дробное внесение глюкозы или аммиака при поддержании роста и pH), либо для обеспечения сверхсинтеза каких-либо продуктов, но не для значительного увеличения выхода биомассы, так как в этом случае потребуется сбалансированная по основным компонентам среда.

Существующий периодический процесс получения биомассы с подпиткой сбалансированной питательной средой [3], выбранной в качестве прототипа, характеризуется тем, что производятся одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации, регулируемых в таком режиме, чтобы избежать лимитирования кислородом, подпитка выращиваемой культуры сбалансированной питательной средой. Этим достигается увеличение выхода биомассы.

Сопоставление энергетико-конструктивных возможностей на перемешивание показывает, что выходы биомассы могут быть увеличены настолько же, как и в прототипе, но без увеличения массообмена. В этом случае рост культуры клеток лимитируется только кислородом, что в свою очередь позволяет, наряду с урожаем, повысить и устойчивость клеток к неблагоприятным факторам внешней среды, хотя может несколько увеличиться продолжительность культивирования.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы аэробно растущих клеток и повышение их устойчивости к неблагоприятным внешним воздействиям. Эта цель достигается тем, что проводится культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене по кислороду в пределах 0,4 - 1,5 ммоль O₂/л•мин, или уменьшением его в последние три часа на 50%, подпитка концентрированной средой при соотношении C:N:P:Mg в пределах (7±2): (1,2±0,5): (0,5±0,2): (0,15±0,09), обеспечивающая конечный расход субстратов в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двукратной от обычной концентрации, если неизвестна ингибирующая.

Таким образом предлагаемый способ при увеличении в несколько раз выхода биомассы микроорганизмов позволяет повысить устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям, не прибегая к увеличению затрат мощности на перемешивание.

Сущность изобретения заключается в том, что с целью повышения урожая биомассы и устойчивости клеток к неблагоприятным внешним воздействиям на стадиях технологической переработки и выживаемости при хранении проводится культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене по кислороду в пределах 0,4 - 1,5 ммоль O₂/л•мин или уменьшением его в последние три часа на 50%, подпитка концентрированной средой при соотношении C:N:P:Mg в пределах (7 ± 2):(1,2 ± 0,5):(0,5 ± 0,2)::(0,15 ± 0,09), обеспечивающая конечный расход субстратов в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двукратной от обычной концентрации, если неизвестна ингибирующая.

Пример 1. Культивирование Pseudomonas fluorescens.

Pseudomonas fluorescens выращивают на синтетической питательной среде с глюкозой и минеральными веществами при следующем их содержании, кг/м³:
Глюкоза - 25,00
Источник азота (по азоту) - 1,00
Фосфат (по фосфору) - 0,50 кг/м³
Сульфат магния семиводный (по магнию) - 0,06
Урожай биомассы при этом не превышал 50 • 10⁹ кл/мл живых клеток, время выращивания 24 ± 2 ч, при посевной дозе не ниже 0,1 ± 10⁹ кл/мл, выживаемость клеток в культуральной жидкости, хранящейся при температуре 22^oC, через трое суток хранения составляла 7% от исходного числа живых клеток.

При дробном внесении концентрированной среды при соотношении основных компонентов питания 5,0:0,7:0,3:0,06 и массообмене 0,4 ммоль O₂/л•мин за 32 ± 2 ч. получали культуру с урожаем 70 • 10⁹ кл/мл, но выживаемость при тех же условиях хранения составила 15%.

При дробном внесении концентрированной питательной среды по показаниям pO₂ и pH, сбалансированной по основным компонентам в соотношении 5,0:0,7: 0,3: 0,06 и при использовании массообмена по O₂, равного 1,5 ммоль O₂/л • мин, получали культуру с содержанием 120 • 10⁹ кл/мл культурной жидкости за 42 ± 2 ч. культивирования, с выживаемостью через трое суток хранения при 22^oC 16%. Конечный расход глюкозы 60 кг/м³.

При использовании подпитки, но при соотношении C:N:P:Mg равном 9,0:1,7: 0,7: 0,24 и при уменьшении масообмена 0,75 ммоль O₂/л•мин на 50% в последние три часа выращивания было получено 15% выживших клеток от исходного 100 • 10⁹ кл/мл.

Пример 2.

Культивирование Yersinia pestis шт. EV.

Yersinia pestis шт. EV. выращивают на среде, приготовленной на основе солянокислотного гидролиза казеина с аминным азотом 140 мг•%, при t = 27^oC и дробном внесении глюкозы по pH и pO₂ и следующем содержании минеральных компонентов, - кг/м³:
Глюкоза (сумм. расход по углероду) - 5,00
Фосфат (по фосфору) - 0,70
Сульфат магния семиводный (по магнию) - 0,12
Тиосульфат натрия двухводный - 0,60
При этом выход клеток по числу живых не превышал 35•10⁹ кл/мл, а время культивирования 28 ± 2 ч. с посевной дозой 0,6 • 10⁹ кл/мл. После технологических стадий концентрирования и приготовления вакцины потеря по числу живых клеток составила 60% от исходного числа.

При дробном внесении концентрированной питательной среды той же основы, но с содержанием аминного азота 800 мг•%, сбалансированной по C: N: P: Mg в соотношении 5,0:0,7:0,3:0,06 и при использовании массообмена 0,75 ммоль O₂/л • мин. получали культуру с содержанием живых клеток 80•10⁹ кл/мл при потерях после технологической обработки, составлявших 30% от исходного числа живых клеток.

При дробном внесении концентрированной питательной среды, но с соотношениями компонентам 9,0: 1,7: 0,7: 0,24 и массообмене 0,75 получали культуры Yersinia pestis шт. EV. с содержанием 75•10⁹ кл/мл, а потери при переработке составляли 25% от общего числа живых клеток. Время выращивания составило 44 ± 4 ч.

Анализ получаемых культур циторефрактометрическим методом [4] и с помощью электронной микроскопии показал наличие 93 ± 5% интактных клеток. Суммарная концентрация аминного азота составила 300 мг•%, а глюкозы - до 40 кг/м³.

Преимущество данного способа заключается в том, что с его помощью возможно получение культур с повышенной устойчивостью к неблагоприятным внешним воздействиям при концентрациях биомассы в несколько раз больше чем те, которые получаются с использованием традиционных периодических способов.

Пример 3.

Определение ингибирующих концентраций глюкозы и азота для Pseudomonas fluorescens, шт. АТС 13525.

Определены ингибирующие концентрации компонентов среды для глубинного выращивания псевдомонад. Исследования выполнены во встряхиваемых колбах. В среде, состав которой приведен в примере 1 заявки, изменяли концентрацию глюкозы и азота. Для определения ингибирующей концентрации компонентов среды определяли удельную скорость роста (μ) и экономический коэффициент (Y). Ингибирующей называют такую концентрацию компонента, при увеличении которой снижается удельная скорость роста и экономический коэффициент.

Данные табл. 1 и 2 показывают, что рост псевдомонад ингибируется при концентрации глюкозы и азота в среде более 20 кг/м³ и 0,6 кг/м³ соответственно. Фактически концентрации этих компонентов в исходной среде находятся в ингибирующей области. Как видно из примера, при использовании подпитки расход глюкозы увеличен в три раза (до 60 кг/м³) при пропорциональном увеличении выхода клеток и повышении устойчивости.

При дробном внесении концентрированной питательной среды по показаниям pO₂ и pH, сбалансированной по основным компонентам C: N: P: Mg в соотношении 7,0: 1,2: 0,5: 0,15 и при использовании массообмена по O₂, равного 1,5 ммоль O₂/л•мин, за 44 ч. получали культуру с содержанием 120•10⁹ кл/мл при суммарном расходе глюкозы 60 кг/м³.

Таким образом, использование подпитки позволило увеличить выход клеток пропорционально увеличению расхода глюкозы.

Использование: в микробиологической и медицинской промышленности и касается способа получения биомассы аэробно растущих микроорганизмов. Сущность изобретения: способ включает периодическое культивирование и подпитку сбалансированной по основным компонентам питания средой, причем эта подпитка ведется при условиях кислородного лимитирования, достигаемого при массообмене в пределах 0,40 - 1,50 моль О₂•м^-3•мин^-1, либо путем уменьшения его в последние 3 ч культивирования на 50%, а подпитка ведется концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева по показаниям pO₂, pH, или eH при соотношении C: N: P:Mg, равном (7,0±2,0) : (1,2±0,5) : (0,5±0,2) : (0,15±0,09). 2 табл.

Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов, включающий периодическое культивирование и подпитку питательной средой, отличающийся тем, что проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене 0,40 - 1,50 моль О₂ • м^- 3мин^- 1 или уменьшением его в последние 3 ч культивирования на 50%, и подпитку концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09), обеспечивающую конечный расход компонентов среды в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двухкратной от обычной концентрации.