СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КАДМИЕВОЙ АНГИОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании патогенетических механизмов токсического действия тяжелых и цветных металлов, в частности кадмия, на формирование функциональных и патоморфологических изменений сосудистой стенки.

В организме существует физиологически нормальный уровень свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ), необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран и ряда биосинтетических процессов. ПОЛ играет важную роль как в нормальной жизнедеятельности клеток, так и в развитии патологических процессов (Айдарханов Б.Б. и соавт., 1989; Ушкалова В.Н. и соавт., 1993). Имеются данные литературы, свидетельствующие о том, что кадмий как металл с переменной валентностью способен инициировать процессы свободнорадикального окисления (Осипова В.П., 2005; Киреев Р.А., 2005; Котельникова С.В. и соавт., 2006). В проведенных исследованиях по изучению действия солей кадмия на свободнорадикальные процессы у крыс было установлено, что нарушается стационарное равновесие между системами, генерирующими активные формы кислорода (АФК) и активностью ферментов антиоксидантной защиты (Шаймарданова Г.М., 2008). Поэтому в условиях кадмиевой интоксикации антиоксидантная защита становится недостаточной (Третьяков A.M., Скридоненко А.Д., 2001; Киреев Р.А., 2005). В экспериментах (Кухта и соавт., 2000) было отмечено активирование процессов ПОЛ в эритроцитах, что подтверждалось увеличением в них концентрации вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) с одновременным увеличением активности каталазы и снижением активности супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах у крыс с экспериментальной кадмиевой интоксикацией.

Наряду с приведенными данными литературы следует отметить, что недостаточно изученным остается вопрос о патогенетической роли перекисного окисления липидов в формировании дисфункции эндотелия, сопровождающейся нарушениями гемодинамики.

У заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: у животных в эритроцитах определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА), активность каталазы в сыворотке крови и супероксиддисмутазы (СОД), и одновременно определяют показатели гемодинамики: брюшную аорту (БА), нижнюю полую вену (НПВ) и почечную артерию (ПА левую, ПА правую), (среднюю скорость кровотока - М; упругоэластические свойства сосудов - PI; общее периферическое сосудистое сопротивление - RI), и при значениях МДА 5,15±0,157 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, и показателях гемодинамики в макрососудах: БА (М - 14,83±1,12 см/с и более, PI - 2,01±0,24 см/с и менее, RI - 0,89±0,02 у.ед. и менее), НПВ (М - 7,82±0,27 см/с и менее, PI - 2,49±0,23 см/с и более, RI - 1,157±0,038 у.ед. и более), ПА лев (М - 6,19±0,62 см/с и более, PI - 3,83±0,37 см/с и менее, RI - 1,12±0,034 у.ед. и менее), ПАпр (М - 5,77±0,43 см/с и более, PI - 3,61±0,48 см/с и менее, RI - 1,09±0,031 у.ед. и менее) и в микрососудах: М - 1,068±0,103 см/с и менее, PI - 17,42±1,28 см/с и более, RI - 1,78±0,07 у.ед. и более соответственно диагностируют кадмиевую ангиопатию.

То есть выявленные изменения МДА, каталазы и СОД сопровождались повышением сосудистого тонуса, нарушениями микроциркуляции и снижением жидкостного обмена - перфузии. На фоне интоксикации сульфатом кадмия определяется повышение средней скорости кровотока (М) в крупных сосудах (БА, ПА), отмечено снижение процессов жидкостного обмена (перфузии) в сосудах микроциркуляции. Данные перфузии тканей показали, что во всех точках локации выявлено снижение средней скорости кровотока (М), что произошло вследствие снижения систолической скорости кровотока (S). Географические показатели характеризовались более высокими значениями индекса Гослинга, отражающего повышение упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки, что может быть связано с повышением общего периферического сосудистого сопротивления (ОПСС) и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. В то же время пульсовой индекс снижается в магистральных сосудах (БА, ПА), но повышается в НПВ. Индекс Пурсело (реографический индекс RI), который отражает удельное периферическое сосудистое сопротивление (УПСС), у животных был статистически достоверно выше, чем в контроле (таб. №1).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в создании способа диагностики кадмиевой ангиопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, что позволяет расширить представление о патогенетической роли перекисного окисления липидов в формировании дисфункции эндотелия, сопровождающейся нарушениями гемодинамики.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение «Способ диагностики кадмиевой ангиопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении» включает следующие существенные признаки: у экспериментальных животных при хроническом отравлении, в эритроцитах определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА), активность каталазы в сыворотке крови и супероксиддисмутазы (СОД), и одновременно определяют показатели гемодинамики: брюшную аорту (БА), нижнюю полую вену (НПВ) и почечную артерию (ПА левую, ПА правую), (среднюю скорость кровотока - М; упругоэластические свойства сосудов - PI; общее периферическое сосудистое сопротивление - RI), и при значениях МДА 5,15±0,157 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, и показателях гемодинамики в макрососудах: БА (М - 14,83±1,12 см/с и более, PI - 2,01±0,24 см/с и менее, RI - 0,89±0,02 у.ед. и менее), НПВ (М - 7,82±0,27 см/с и менее, PI - 2,49±0,23 см/с и более, RI - 1,157±0,038 у.ед. и более), ПА лев (М - 6,19±0,62 см/с и более, PI - 3,83±0,37 см/с и менее, RI - 1,12±0,034 у.ед. и менее), ПАпр (М - 5,77±0,43 см/с и более, PI - 3,61±0,48 см/с и менее, RI - 1,09±0,031 у.ед. и менее) и в микрососудах: М - 1,068±0,103 см/с и менее, PI - 17,42±1,28 см/с и более, RI - 1,78±0,07 у.ед. и более соответственно диагностируют кадмиевую ангиопатию.

Между признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: при вышеуказанных концентрациях МДА в мембранах эритроцитов, снижается антиоксидантный потенциал клеток, нарушается функция эндотелия и изменяются гемодинамические показатели, т.е. развивается кадмиевая ангиопатия.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется выше указанный способ диагностики кадмиевой ангиопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном способе диагностики кадмиевой ангиопатии. Учитывая то, что эритроцит является наиболее доступной моделью для исследования в организме животных и человека, и процессы перекисного окисления липидов в нем протекают аналогично тканевым, содержание МДА в эритроцитах можно использовать для диагностики кадмиевой ангиопатии не только у экспериментальных животных, но и у людей. Все это позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом.

Сульфат кадмия растворяется в дистиллированной воде таким образом, что на 0,1 мл раствора приходится 0,08 мг кадмия для введения подкожно дозы 0,8 мг/кг веса и 0,1 мг для дозировки 1,0 мг/кг веса и 0,15 мг для дозировки 1,5 мг/кг веса, Т.е. 0,8 мг/кг веса = 0,08/100 г/0,1 мл раствора; 1,0 мг/кг веса = 0,1/100 г/0,1 мл раствора; 1,5 мг/кг веса = 0,15/100 г/0,1 мл раствора. На каждые 100 г веса крысы вводится 0,1 мл раствора сульфата кадмия подкожно, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Полученный раствор сульфата кадмия вводится ежедневно 1 раз в сутки в течение 1 месяца.

По истечении срока эксперимента для изучения активности ПОЛ и антиоксидантной системы крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА. Активность перекисного окисления липидов изучалась по концентрации МДА (конечного продукта ПОЛ) по методу Asakava. Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности каталазы в сыворотке крови, определяемую методом М.А.Королюка и соавт., (1988) и СОД по методу аутоокисления адреналина. Макро- и микрогемодинамику исследовали ультразвуковым допплерографом ММ-Д-Ф фирмы «МИНИМАКС» (Санкт-Петербург, Россия). Использовали датчик с частотой 10 МГц. Для каждой зоны локации прибор регистрировал основные параметры кровотока: среднюю (М), систолическую (S) и диастолическую (D) скорости кровотока, пульсовой индекс (Pi), реографический индекс (RI), градиент давления (GD). У наркотизированных животных использовали 6 основных точек локации: брюшная аорта (БА), нижняя полая вена (НПВ), почечная артерия (ПАпр, ПАлев), микроциркуляторное звено. Исследовали перфузию тканей (жидкостный обмен) в различных точках локации (конечности, основание хвоста).

Пример 1. Крысам-самцам линии Вистар в течение 1 месяца ежедневно 1 раз в сутки вводили раствор сульфата кадмия подкожно в дозе 0,8; 1,0 и 1,5 мг/кг веса животного. По истечении срока эксперимента определяли концентрацию МДА в эритроцитах, активность каталазы и СОД, а также исследовали показатели гемодинамики. Сравнение полученных в ходе эксперимента данных проводили с группой интактных животных (контрольная группа).

В таблице 1 представлены данные по содержанию МДА, как показателя интенсивности ПОЛ, а также активности ферментов СОД и каталазы, обеспечивающих антиоксидантную защиту организма. Из таблицы видно, что кадмиевая интоксикация сопровождается активацией процессов ПОЛ клеточных мембран, о чем свидетельствует статистически достоверное повышение концентрации МДА в мембранах эритроцитов, снижение активности СОД и возрастание активности каталазы. Иными словами, развивается окислительный стресс. Причем изменения, отмечаемые в дозе 1,5 мг/кг веса животного, наиболее выражены, т.е. отмечается дозозависимость.

Таблица 1 Показатели ПОЛ в эритроцитах (по концентрации МДА) и активности АОС (по концентрации каталазы и СОД в сыворотке крови) у крыс с введением сульфата кадмия подкожно в дозе 0,8 мг/кг; 1,0 мг/кг; 1,5 мг/кг веса (M±m). Группы животных Концентрация МДА в эритроцитах Активность каталазы в сыворотке крови СОД нмоль/мл мкат/л ед/мг белка Контрольная Группа 4,54±0,16 225,56±29,09 2,386±0,25   Cd - 0,8 мг/кг веса 2 нед, п/к 4,98±0,14*) 308,04±17,83*) 1,73±0,07*) Cd - 0,8 мг/кг веса 1 месяц, п/к 5,15±0,157*) 375,17±20,44*) 1,65±0,045*)   Cd - 1,0 мг/кг веса, 2 нед, п/к 5,08±0,1*) 367,53±18,15*) 1,64±0,02*) Cd - 1,0 мг/кг веса, 1 месяц, п/к 5,63±0,11*) 399,35±20,72*) 1,59±0,07*)   Cd - 1,5 мг/кг веса, 2 нед, п/к 5,4±0,137*) 464,7±22,52*) 1,71±0,06*) Cd - 1,5 мг/кг веса, 1 месяц, п/к 6,05±0,16*) 498,9±20,58*) 1,51±0,03*) *) - достоверность результатов опытных групп относительно контроля.

Наряду с этим, используя ультразвуковой допплерограф, исследовали основные параметры кровотока: среднюю (М), систолическую (S) и диастолическую (D) скорости кровотока, пульсовой индекс (Pi), реографический индекс (RI), градиент давления (GD). У наркотизированных животных использовали 6 основных точек локации: брюшная аорта (БА), нижняя полая вена (НПВ), почечная артерия (ПАпр, ПАлев), микроциркуляторное звено. Исследовали перфузию тканей (жидкостный обмен) в различных точках локации (конечности, основание хвоста). Как видно из таблицы 2 (показатели гемодинамики), выявленные изменения МДА, каталазы и СОД, сопровождались повышением сосудистого тонуса и нарушениями микроциркуляции. Анализ перфузии тканей показал, что при интоксикации сульфатом кадмия во всех точках локации выявлено снижение средней скорости кровотока (М) в среднем на 20%. Это произошло преимущественно за счет снижения систолической скорости кровотока (S) - на 15%, при повышении диастолической скорости кровотока (D) на 10%. Географические показатели характеризуются более высокими значениями индекса Гослинга, отражающего повышение упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело (реографический индекс RI), который отражает общее периферическое сосудистое сопротивление (ОПСС), был достоверно выше, чем в контроле.

Снижение средней и систолической скорости кровотока в сосудах микроциркуляторного русла отражает уменьшение скорости тканевого обмена (перфузии), что объясняется утолщением базальных мембран сосудов, пролиферацией и набуханием эндотелиальных клеток.

Таблица 2 Показатели гемодинамики у крыс с кадмиевой интоксикацией Точка локации Контроль Сульфат кадмия М S D PI GD М М S D PI GD RI см/с см/с см/с см/с мм рт.ст. у.ед. см/с см/с см/с см/с мм рт.ст. у.ед. Перфузия 1,41 9,37 6,94 13,16 0,039 1,59 1,068*) 6,78*) 6,91 17,42*) 0,028 1,78*) 0,14 0,39 0,27 0,43 0,003 0,061 0,103 0,98 0,12 1,28 0,008 0,07 БА 11,72 36,14 2,07 2,98 0,51 0,98 14,83*) 39,57*) 1,39*) 2,01*) 0,59*) 0,89*) 0,97 0,89 0,11 0,191 0,021 0,03 1,12 1,27 0,17 0,24 0,032 0,02 НПВ 8,87 15,91 1,073 1,692 0,112 1,052 7,82*) 14,10*) 1,13 2,49*) 0,214*) 1,157*) 0,41 0,53 0,82 0,29 0,018 0,031 0,27 0,61 0,49 0,23 0,041 0,038 ПА левая 4,78 20,01 4,41 4,96 0,12 1,26 6,19*) 22,18*) 3,97 3,83*) 0,21*) 1,12*) 0,29 0,74 0,49 0,187 0,031 0,037 0,62 0,59 0,36 0,37 0,026 0,034 ПА правая 4,47 19,45 4,68 4,72 0,15 1,24 5,77*) 21,43*) 4б12 3,61*) 0,24*) 1,09*) 0,35 0,69 0,51 0,27 0,019 0,037 0,43 0,48 0,42 0,48 0,038 0,031 *) - достоверность результатов опытных групп относительно контроля.

Все вышеописанные изменения вызваны сульфатом кадмия, так как исследования по его содержанию в почечной ткани и в моче выявило достоверное его повышение как в почках, так и в моче при введении всех дозировок. Причем выраженность изменений зависит от дозировки поступающего в организм сульфата кадмия, т.е. отмечается прямая корреляционная связь между дозой вводимого сульфата кадмия и его содержанием в биосубстратах.

Таким образом, на фоне кадмиевой интоксикации активные формы кислорода инициируют процессы ПОЛ, в результате которых снижается антиоксидантный потенциал клеток, нарушается функция эндотелия и изменяются гемодинамические показатели. Т.е. использование в качестве диагностического критерия кадмиевой ангиопатии вышеуказанных исследований вполне обосновано.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии. Способ заключается в том, что у животных в эритроцитах определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА), активность каталазы в сыворотке крови и супероксиддисмутазы (СОД), и одновременно определяют показатели гемодинамики: брюшную аорту (БА), нижнюю полую вену (НПВ) и почечную артерию (ПА левую, ПА правую), среднюю скорость кровотока - М; упругоэластические свойства сосудов - PI; общее периферическое сосудистое сопротивление - RI. При значениях МДА 5,15±0,157 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, значениях СОД - 1,73±0,07 ед/мг белка и менее, каталазы - 308,04±17,83 мкат/л и более, а также данных гемодинамики в макрососудах: БА (М - 14,83±1,12 см/с и более, PI - 2,01±0,24 см/с и менее, RI - 0,89±0,02 у.ед. и менее), НПВ (М - 7,82±0,27 см/с и менее, PI - 2,49±0,23 см/с и более, RI - 1,157±0,038 у.ед. и более), ПА лев (М - 6,19±0,62 см/с и более, PI - 3,83±0,37 см/с и менее, RI - 1,12±0,034 у.ед. и менее), ПА пр (М - 5,77±0,43 см/с и более, PI - 3,61±0,48 см/с и менее, RI - 1,09±0,031 у.ед. и менее) и в микрососудах: М - 1,068±0,103 см/с и менее, PI - 17,42±1,28 см/с и более, RI - 1,78±0,07 у.ед. и более соответственно диагностируют кадмиевую ангиопатию. Способ позволяет оценить патогенетические механизмы токсического действия тяжелых и цветных металлов, в частности, кадмия на формирование функциональных и патоморфологических изменений сосудистой стенки. 2 табл., 1 пр.

Способ диагностики кадмиевой ангиопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что у животных в эритроцитах определяют концентрацию малонового диальдегида (МДА), активность каталазы в сыворотке крови и супероксиддисмутазы (СОД), и одновременно определяют показатели гемодинамики: брюшную аорту (БА), нижнюю полую вену (НПВ) и почечную артерию (ПА левую, ПА правую), среднюю скорость кровотока - М; упруго-эластические свойства сосудов - PI; общее периферическое сосудистое сопротивление - RI, и при значениях МДА 5,15±0,157 нмоль/мл эритроцитарной массы и более, значениях СОД - 1,73±0,07 ед/мг белка и менее, каталазы - 308,04±17,83 мкат/л и более, а также данных гемодинамики в макрососудах: БА (М - 14,83±1,12 см/с и более, PI - 2,01±0,24 см/с и менее, RI - 0,89±0,02 у.ед. и менее), НПВ (М - 7,82±0,27 см/с и менее, PI - 2,49±0,23 см/с и более, RI - 1,157±0,038 у.ед. и более), ПА лев (М - 6,19±0,62 см/с и более, PI - 3,83±0,37 см/с и менее, RI - 1,12±0,034 у.ед. и менее), ПА пр (М - 5,77±0,43 см/с и более, PI - 3,61±0,48 см/с и менее, RI - 1,09±0,031 у.ед. и менее) и в микрососудах: М - 1,068±0,103 см/с и менее, PI - 17,42±1,28 см/с и более, RI - 1,78±0,07 у.ед. и более соответственно диагностируют кадмиевую ангиопатию.