СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И КОРРЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ПРИ СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЯХ АЛЛОКСАНОВОГО ДИАБЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 G01N33/48 A61K31/122 A61P5/48 A61P9/08 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, в частности к эндокринологии, и касается лечения ангиопатии при экспериментальном аллоксановом диабете.

Для защиты полиеновых жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран от перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме имеются биологические эндогенные липофильные антиоксиданты: коэнзим Q и α-токоферол (витамин Е). Коэнзим Q₁₀ занимает центральное место в антиоксидантной системе. Лекарственный препарат убихинон (синоним коэнзима Q₁₀) представляет собой жирорастворимое витаминоподобное соединение из класса бензохинонов, активно участвует в жизнедеятельности всех органов и систем в организме человека, как электронный переносчик в дыхательной цепи митохондрий - «фабрики» энергетических субстратов (АТФ) (см. Morton R.A., Wilson G.M., Lowe J.S. et аl., 1957). Его существенная роль в биоэнергетике установлена в рамках хемиосмотической теории транспорта энергии нобелевским лауреатом Питером Митчеллом в 1978 г.

Коэнзим Q₁₀ синтезируется в организме из аминокислоты тирозина при участии витаминов В₂, В₃, В₆, В₁₂ с фолиевой и пантотеновой кислотами, ряда микроэлементов. Постоянное присутствие этого соединения в клетках человека в физиологических концентрациях является необходимым. Установлено, что дефицит коэнзима Q₁₀ на 25% является предпосылкой для развития патологических состояний, а дефицит на 75% несовместим с жизнью. Будучи компонентом дыхательной цепи, участвует в одноэлектронном и двухэлектронном переносе, обнаруживается в высоких концентрациях в сердечной мышце, что обусловлено аэробным типом метаболизма в кардиомиоците (см. Littarru G.P., Но L., Folkers К., 1972). С возрастом (после 30 лет) содержание убихинона в миокарде снижается в 1,5-2 раза.

За последние 10-20 лет накопились сведения в литературе, свидетельствующие об эффективности убихинон-коэнзим Q₁₀ в клинике у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями (см. Шабалин А.В., Никитин Ю.П., 1999 г.). Его применяют у больных с застойной сердечно-сосудистой недостаточностью различной этиологии (см. Капелько В.И., Руите Э.К., 2002 г.), при ИБС. У крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом содержание коэнзим Q₁₀ в митохондриях печени и сердца снижено и повышено образование микрогемодинамики (МДА) (см. Kucharska J., Braunova Z., Ulicna О., 2000 г.).

Исследования изменений в митохондриальной биоэнергетике на изолированной почечной корковой митохондрии у крыс со стрептозотоциновым диабетом показали понижение процесса окислительного фосфорилирования, снижение активности третьего комплекса цепи переноса электронов. В этих условиях изолированные митохондрии производили повышенное количество супероксида (O₂ ^-) и показали проявления оксидативного поражения. Это вызвало посттрансляционные модификации митохондриальных белков eNOS, что играет патогенетическую роль при поражении сосудистого эндотелия и функции висцеральных органов оксидативным стрессом в хронической стадии диабета (см. Rosca М.G, Mustata Т.G., Kinter М.Т. et al., 2005 г.). Данные источники информации указывают на то, что антиоксиданты (АО), действующие избирательно на митохондрии, обладают корригирующим эффектом.

Однако препарат убихинон-коэнзим Q₁₀ не использовали для коррекции эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений сахарного диабета.

Поэтому весьма актуальным является исследование показателей активности ПОЛ, антиокислительной системы (АОС), концентрации NO в крови и клетках висцеральных органов, а также разработка возможного пути коррекции нарушений с применением митохондриально ориентированного антиоксиданта - убихинон-коэнзим Q₁₀, при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД). Вместе с тем следует отметить, что в доступной литературе отсутствуют данные по изучению влияния убихинона-коэнзима Q₁₀ на биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции и состояние висцеральных органов печени и сердца при экспериментальном аллоксановом диабете.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ диагностики и лечения нефроангиопатии при аллоксановом диабете в эксперименте, включающий моделирование заболевания и определение уровня глюкозы в крови крысы через две-четыре недели, а также способ коррекции, включающий введение лекарственного препарата, в условиях окислительного стресса, сопутствующего развитию диабета через четыре недели после моделирования заболевания в дозе, рассчитанной на 100 г живого веса крысы, один раз в день на протяжении 30 дней (см. патент №2372898, опубл. 20.11.2009 г.).

Недостатками прототипа являются узкий арсенал распространения, отсутствие данных по диагностике и коррекции эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений аллоксанового диабета на экспериментальной модели сахарного диабета типа -1, не высокая достоверность и точность оценки наличия эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений аллоксанового диабета.

Технический результат заключается в повышении точности и достоверности диагностики и коррекции экспериментального аллоксанового диабета в состоянии окислительного стресса, воспроизводимости, удобства, доступности, безопасности и невысокой стоимости проведения эксперимента на животных.

Технический результат достигается тем, что в способе диагностики эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений аллоксанового диабета в эксперименте, включающем моделирование заболевания и определение уровня глюкозы в крови крысы, согласно изобретению, при увеличении уровня глюкозы в крови, по крайней мере, в два раза, на фоне окислительного стресса определяют показатели антиоксидантной системы, концентрацию суммарных метаболитов NO, активность eNOS и состояние микро- и макрогемодинамики, концентрацию МДА и активность Na+ К+ АТФ-азы в мембранах клеток миокарда и печени и по изменению этих показателей судят о наличии эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений аллоксанового диабета у животных.

Технический результат достигается также способом коррекции эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений аллоксанового диабета в эксперименте, включающим диагностику таких осложнений до и после введения лекарственного препарата, в условиях окислительного стресса, сопутствующего развитию диабета после моделирования заболевания в дозе, рассчитанной на 100 г живого веса крысы, один раз в день на протяжении 30 дней, согласно изобретению, эндотелиальную дисфункцию при сосудистых осложнениях диабета устанавливают способом по п.1, а в качестве лекарственного препарата используют убихинон-коэнзим Q₁₀, который вводят крысам в количестве 0,11 мкл/100 г живого веса.

Данный способ позволит расширить представление о патофизиологических механизмах развития ангиопатии при хроническом аллоксановом диабете, предложить лечение ангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных, повышающий воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и невысокую стоимость проведения эксперимента на животных.

Сущность заявляемого способа подтверждена графически и таблицами, где на фиг.1 изображена - динамика показателей ПОЛ в эритроцитах, печени и миокарде в норме, при ЭСД и на фоне лечения убихинон-коэнзим Q₁₀, на фиг.2 - изменение активности СОД в эритроцитах и сыворотке крови в норме, при ЭСД и на фоне лечения убихинон-коэнзим Q₁₀, на фиг.3 - показатели активности каталазы и концентрация церулоплазмина в плазме крови в норме, при ЭСД и на фоне лечения убихинон-коэнзим Q₁₀, на фиг.4 - показатели активности Na⁺, K⁺ - АТФ-азы в печени и миокарде в норме, при ЭСД и на фоне лечения убихинон-коэнзим Q₁₀, на фиг.5 - содержание суммарных метаболитов NO в норме, при ЭСД и на фоне лечения убихинон-коэнзим Q₁₀, на фиг.6 - характер изменений микрогемодинамики у крыс в норме, при ЭСД и на фоне лечения убихинон-коэнзим Q₁₀.

В таблице 1 - динамика изменения показателей макрогемодинамики при экспериментальном сахарном диабете, в таблице 2 - динамика изменения показателей макрогемодинамики при экспериментальном сахарном диабете на фоне корригирующей терапии с убихинон-коэнзим Q₁₀.

Способ диагностики и коррекции эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений сахарного диабета в эксперименте осуществляют следующим образом.

Для поражения инсулиногенных β-клеток островков Лангерганса экспериментальный сахарный диабет (аллоксановый) вызывали путем внутрибрюшинного введения 5% водного раствора аллоксана (синтезированного в лаборатории отдела патобиохимии ИБМИ ВИЦ РАН и РСО-А) в дозе 15 мг/кг веса животного натощак, на фоне 24-48 часового голодания при свободном доступе к воде. Через 48-72 часа натощак забирали кровь из хвоста (микроколичество) и определяли уровень глюкозы глюкозооксидазным методом (тест наборы). При повышении сахара крови в 2 раза определяли показатели антиоксидантной системы, состояние микро- и макрогемодинамики, а также концентрацию суммарных метаболитов NO и активность eNOS в условиях окислительного стресса, и по изменению этих показателей, судили о наличии эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений сахарного диабета у животных.

Для коррекции нарушений ПОЛ, АОС, показателей диабетической ангиопатии в течение месяца крысам с экспериментальным сахарным диабетом подкожно через 14-21 день после введения 5% водного раствора аллоксана вводили убихинон-коэнзим Q₁₀ в дозе 0,11 мкл/100 гр массы тела.

По истечении срока эксперимента изучали перфузию в различных точках локации тканей (жидкостный обмен) прозвучиванием датчиком 10 МГц, работающим по принципу «слепого» допплера у наркотизированных животных. Затем крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве амтикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА для определения концентрации малонового диальдегида (МДА) и сыворотку для определения активности СОД, каталазы, церулоплазмина и NO. Извлекали печень, сердце для определения в гомогенатах тканей активности Na⁺, K⁺ - АТФ-азы, интенсивности ПОЛ. В эндотелии аорты определяли активность eNOS.

Пример. Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 190-210 грамм, находящихся на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к воде и естественным световым режимом в весенний сезон года. Экспериментальный сахарный диабет, характеризующийся инсулиновой недостаточностью, вызывали путем внутрибрюшинного введения 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг массы тела натощак на фоне 24-48 часового голодания при свободном доступе к воде. Через 48-72 часа натощак забирали кровь из хвоста (микроколичество) и определяли уровень глюкозы глюкозооксидазным методом (тест наборы). При повышении сахара крови в 2 раза, определяли показатели антиоксидантной системы, состояние микро- и макрогемодииамики, а также концентрацию суммарных метаболитов NO и активность eNOS в условиях окислительного стресса, и по изменению этих показателей (см. фиг.1-6), судили о наличии эндотелиальной дисфункции сосудистых осложнений сахарного диабета у животных.

Для коррекции нарушений ПОЛ, АОС, микрогемодинамики вводили через 14-21 день крысам с экспериментальным сахарным диабетом в течение месяца подкожно убихинон-коэнзим Q₁₀ в дозе 0,11 мкл/100 гр массы тела.

По истечении периода введения исследовали показатели, микрогемодинамики, ПОЛ, АОС, активность Na⁺, K⁺ - АТФ-азы в миокарде и печеночной ткани.

У крыс с ЭСД развивается окислительный стресс, который приводит к сниженной продукции NO эндотелиальными клетками, либо его ускоренному распаду, превращаясь в пероксинитрид. Данные показали, что у крыс с ЭСД концентрация суммарных метаболитов NO оказалась статистически достоверно пониженной сравнительно с контрольными животными, что сопровождалось преобладанием вазоконстрикторных влияний (см. фиг.5). Это проявлялось повышением сосудистого тонуса и нарушениями микроциркуляции, о чем свидетельствуют данные гемодинамики, представленные в этой же таблице. Данные перфузии тканей показали, что при ЭСД во всех точках локации выявлено снижение средней скорости кровотока (М) вследствие снижения систолической скорости кровотока (S), при повышении диастолической скорости кровотока (D). Географические показатели характеризуются более высокими значениями индекса Гослинга, отражающего повышение упруго-эластических свойств (плотности) сосудистой стенки и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело (реографический индекс RI), который отражает удельное периферическое сосудистое сопротивление (УПСС), у животных с ЭСД был статистически достоверно выше, чем в контроле (см. фиг.6). Эти результаты свидетельствует о преобладании вазоконстрикторных влияний в микроциркуляторном русле, обусловленных по нашим данным, снижением содержания метаболитов оксида азота в крови (с 51,07±0,53 до 32,54±1,42) у диабетических крыс. В результате эндотелиальной дисфункции нарушение микрогемодинамики у экспериментальных животных в хронической стадии аллоксанового диабета сопровождается статистически достоверным снижением активности ион-транспортирующего фермента Na⁺, K⁺ - АТФ-азы в гомогенатах тканей печени и миокарда (см. фиг.4). Для коррекции избыточного процесса ПОЛ, нарушений системы антиоксидантной защиты и активности Na⁺, K⁺ - АТФ-азы в печеночной ткани, а также сердечной мышце крысам с ЭСД в течение месяца вводили убихинон-коэнзим Q₁₀ в дозе 0,11 мкл/100 г массы тела. Введение препарата сопровождалось существенным снижением концентрация МДА в эритроцитах, в гомогенатах тканей печени и миокарда (см. фиг.1). На фоне введения препарата повысилась и активность ферментов антиоксидантной защиты. Активность СОД в сыворотке крови и эритроцитах практически восстановилась до уровня контроля (см. фиг.2), а каталазы - статистически значимо снизилась, но не достигла уровня, характерного для контрольных животных (см. фиг.3). Проведен корреляционный анализ для выяснения эффективности действия антиоксидантов на процессы ПОЛ и ферменты антиоксидантной защиты. Показано наличие прямой сильной корреляционной связи между концентрацией МДА и активностью каталазы (r=+0.64, р<0.001), и отрицательной сильной связи между уровнем снижения концентрации МДА и повышением активности СОД (r=-0,54; р=0,03). Введение животным с ЭСД препарата Убихинон композитум сопровождалось повышением активности Na, K - АТФ-азы в корковом и мозговом веществе почечной ткани, гепатоцитах и кардиомиоцитах. Этому способствовала нормализация липидного микроокружения фермента в результате иигибирования ПОЛ в мембранах клеток висцеральных органов, повышение эффективности использования кислорода в цепи переноса электронов и энергообразования. Препарат - убихинон-коэнзим Q₁₀ положительно влиял на функциональную активность сосудистого эндотелия, способствовал повышению концентрации метаболитов NO в сыворотке крови у животных с ЭСД в течение месяца и повышением активности СОД (r=-0,54; р=0,03). Введение животным с ЭСД препарата Убихинон композитум сопровождалось повышением активности Na, K - АТФ-азы в печеночной и миокардиальной тканях. Этому способствовала нормализация липидного микроокружения фермента в результате ингибирования ПОЛ в мембранах клеток висцеральных органов, повышение эффективности использования кислорода в цепи переноса электронов и энергообразования. Препарат - убихинон-коэнзим Q₁₀ положительно влиял на функциональную активность сосудистого эндотелия, способствовал повышению концентрации метаболитов NO в сыворотке крови у животных с ЭСД, в течение месяца получавших этот препарат. Коррекция дисфункции эндотелия препаратом убихинон-коэнзим Q₁₀, сопровождалась статистически достоверным снижением удельного периферического сосудистого сопротивления и упруго-эластических свойств сосудов микроциркуляторного русла и повышением перфузии, вследствие возрастания средней и систолической скоростей кровотока (табл.2). Корреляционный анализ показал отрицательную связь средней силы между концентрацией метаболитов NO и скоростью кровотока (r=-0.41; р=0.03).

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом повысить точность, достоверность диагностики по концентрации МДА в клетках печени и сердца, активности АОС по данным СОД в эритроцитах и сыворотке крови, каталазы и церулоплазмина в плазме крови, по концентрации суммарных метаболитов NO и активности eNOS, а также повысить эффективность лечения с использованием убихинон-коэнзим Q₁₀, воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и низкую стоимость проведения эксперимента на животных.

Таблица 1 и 2 Динамика изменения показателей макрогемодинамики в норме, при экспериментальном сахарном диабете и на фоне корригирующей терапии с убихинон-коэнзим Q₁₀.(M±m) Точка локации М S D PI GD RI Средняя скорость кровотока Систолическая скорость кровотока Диастолическая скорость кровотока Индекс Гослинга Градиент давления Географический индекс см/с см/с см/с см/с мм рт.ст. у.ед. КОНТРОЛЬ БА 13,468 38,834 2,083 2,814 0,548 0,948 ±0,473 ±1,223 ±0,232 ±0,155 ±0,020 ±0,011 НПВ 9,420 15,868 1,223 1,692 0,118 1,042 ±0,440 ±1,754 ±0,137 ±0,121 ±0,008 ±0,008 ПА левая 5,052 20,019 4,638 5,036 0,148 1,191 ±0,304 ±0,880 ±0,415 ±0,297 ±0,012 ±0,029 ПА правая 4,377 19,599 5,651 4,830 0,127 1,24 ±0,402 ±1,020 ±0,521 ±0,467 ±0,011 ±0,044 НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА БА 15,710¹¹¹¹) 40,292 2,95¹¹¹¹) 2,804 0,65¹¹¹¹¹) 0,932 ±0,518 ±0,855 ±0,372 ±0,149 ±0,018 ±0,010 НПВ 9,871 18,204 2,162¹¹¹¹) 1,793 0,124 1,12¹¹¹¹ ±0,426 ±0,544 ±0,219 ±0,092 ±0,008 ±0,013 ПА левая 5,308 22,59¹¹) 4,09¹¹¹¹) 3,746¹¹¹¹) 0,2¹¹¹¹) 1,145 ±0,245 ±0,500 ±0,303 ±0,259 ±0,010 ±0,021 ПА правая 4,946 20,025 5,495 3,973 0,15¹) 1,207 ±0,276 ±0,485 ±0,378 ±0,282 ±0,008 ±0,029 НА ФОНЕ КОРРИГИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ С УБИХИНОН-КОЭНЗИМ Q₁₀. БА 14.07²²²) 38,9 2.17²) 2,81 0,57²²²) 0,937 ±0,36 ±1,31 ±0,14 ±0,09 ±0,023 ±0,01 НПВ 9,57 16,9²²) 1,²²²) 1,714 0,119 1,57²²²²) ±0,029 ±0,72 ±0,11 ±0,086 ±0,009 ±0,009 ПА левая 5,14 20,8²²²) 4,47 4,75²²²) 0,16²²) 1,18 ±0,27 ±0,32 ±0,39 ±0,28 ±0,013 ±0,034 ПА правая 4,56 19,78 5,58 4,51²²) 0,132 1,23 ±0,35 ±0,62 ±0,46 ±0,35 ±0,009 ±0,031 Примечание: БА - брюшная аорта, НПВ - нижняя полая вена, ПА - почечная артерия (правая и левая) ¹¹¹¹) - р<0,001; ¹¹¹) - р<0,01; ¹¹) - р<0,02; ¹) - р<0,05 достоверность относительно контроля ²²²²) - р<0,001; ²²²) - р<0,01;²²) - р<0,02; ²) - р<0,05 достоверность относительно экспериментального сахарного диабета.

Группа изобретений относится к экспериментальной медицине, в частности к эндокринологии, и касается разработки способа диагностики и лечения ангиопатии при экспериментальном аллоксановом диабете. Диагностику эндотелиальной дисфункции проводят при увеличении уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза. Способ включает определение показателей антиоксидантной системы, концентрации суммарных метаболитов NO, активность eNOS, состояние микро- и макрогемодинамики, концентрации МДА и активности Na+ К+ АТФ-азы в мембранах клеток миокарда и печени. По изменению этих показателей судят о наличии эндотелиальной дисфункции при аллоксановом диабете. Коррекцию такой дисфункции проводят введением препарата убихинон-коэнзим Q₁₀ подкожно в количестве 0,11 мкл/100 г веса животного один раз в сутки в течение 30 дней. Предложенный способ исследования обеспечивает повышение точности и достоверности диагностики сосудистых нарушений при данном виде диабета, а эффективная коррекция этих нарушений, в т.ч. за счет выбранных доз препарата, обеспечивает также воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и невысокую стоимость проведения эксперимента. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 6 ил., 1 пр.

1. Способ диагностики эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях аллоксанового диабета в эксперименте, включающий моделирование заболевания и определение уровня глюкозы в крови крысы, отличающийся тем, что при увеличении уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза, на фоне окислительного стресса определяют показатели антиоксидантной системы, концентрацию суммарных метаболитов NO, активность eNOS, состояние микро- и макрогемодинамики, концентрацию МДА и активность Na+ К+ АТФ-азы в мембранах клеток миокарда и печени, и по изменению этих показателей судят о наличии эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях аллоксанового диабета у крыс.

2. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях на фоне аллоксанового диабета в эксперименте, включающий диагностику таких осложнений до и после введения лекарственного препарата, в условиях окислительного стресса, в дозах, рассчитанных на 100 г живого веса крысы, один раз в день на протяжении 30 дней, отличающийся тем, что эндотелиальную дисфункцию при сосудистых осложнениях диабета устанавливают способом по п.1, а в качестве лекарственного препарата используют убихинон-коэнзим Q₁₀, который вводят крысам в количестве 0,11 мкл/100 г живого веса.