СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОЙ КОАГУЛОПАТИИ У КРЫС Российский патент 2024 года по МПК A61K31/28 A61K31/4045 A61P43/00 A61M25/01 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, экологии, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции проявлений токсической коагулопатии у экспериментальных животных при длительном воздействии сульфата кадмия.

Кадмий является широко распространенным загрязнителем окружающей среды, потенциальным токсикантом, при контакте с которым развиваются функциональные и морфологические изменения в органах и системах. Ионы кадмия, попадая в организм, связываются с белками переносчиками - металлотионеинами, транспортируясь по организму к органам мишеням (Авцын А.П. 1991). Наряду с основными органами мишенями (почки, миокард, печень) - потенциальной мишенью токсического действия кадмия является кровь. Описываются изменения структуры и функционирования форменных элементов крови, эритроцитов, тромбоцитов, а также фибриновых сетей и эндотелия под влиянием кадмия (NontarachA, SrihirunS, ChaturapanichG, etal. Increased platelet activation in subjects chronically exposed to cadmium: A pilot study. Platelets. 2016; 27(2): 136-142. doi: 10.3109/09537104.2015.1048215; Venter, Chantelle &Oberholzer, Hester Magdalena & Bester, Janette & Van Rooy, Mia-Jeanne & Bester, Megan. Ultrastructural, Confocal and Viscoelastic Characteristics of Whole Blood and Plasma After Exposure to Cadmium and Chromium Alone and in Combination: An Ex Vivo Study // Cellular Physiology and Biochemistry. - 2017. - №43. - P. 1288-1300. 10.1159/000481841), вместе с тем комплексного изучения всех компонентов системы гемостаза при хронической интоксикации кадмием в динамике не проводилось.

Механизмы патогенного действия ионов кадмия связывают со способностью вызывать окислительный стресс. Показано, что ионы Cd2+ не проявляют способности непосредственно генерировать активные формы кислорода, но они могут вызывать окислительное повреждение тканей и органов, путем ослабления антиоксидантной защиты, снижения тиолового статуса(Nemmiche S. Oxidativesignalingresponsetocadmiumexposure //Toxicologicalsciences. - 2017. - Т. 156. - №. 1. - С. 4-10). Многие исследователи подчеркивают взаимосвязь процессов липопероксидации с нарушениями в системе гемостаза (Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Ралъченко И.В. 2005; KattulaS., ByrnesJ.R., WolbergA.S. Fibrinogenandfibrininhemostasisandthrombosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2017. - V. 37, №3. - P. 13-21). Invitro при индуцированном окислении, а также invivo при развитии окислительного стресса показано нарушение пространственной организации фибрина, его вязко-эластических и биохимических свойств, что, в конечном итоге, приводит к образование аномального фибрина с тонкими волокнами и мелкопористой структурой, обусловливает возрастающую резистентность фибриновой сети к фибринолизу (Venter, С., Oberholzer, Н.М., Bester, J., VanRooy, М.J., &Bester, M.J. (2017). Ultrastructural, confocal and viscoelastic characteristics of whole blood and plasma after exposure to cadmium and chromium alone and in combination: An ex vivo study. // Cellular Physiology and Biochemistry. - 2017. - №43. - P. 1288-1300. 10.1159/000481841). Показано,

что мемранотропное влияние может сопровождаться поступлением в кровоток большого количества тромбогенных субстанций,

источниками которых могут выступать компоненты мембран эндотелия, форменных элементов крови,

а также клеточных структур различных органов прикадмиевой интоксикации(Pretorius, L., Taute, H., Van Rooy, М., &Oberholzer, Н.М. Investigating the ultrastructural and viscoelastic characteristics of whole blood after exposure to the heavy metals cadmium, lead and chromium, alone and in combination. Ultrastructural pathology, 2022, 1-11. https://doi. org/10.1080/01913123.2022.2075999).

Перспективным является поиск средств патогенетической профилактики токсического действия кадмия на организм в ряду антиоксидантов(Poli, V., Madduru, R.., Aparna, Y. Amelioration of Cadmium-Induced Oxidative Damage in Wistar Rats by Vitamin C, Zinc and N-Acetylcysteine // Medical sciences (Basel, Switzerland), 2022, 10(1), 7. https://doi.org/10.3390/medscil0010007; M.M. Brzoska, S. Borowska, and M. Tomczyk Antioxidants as a potential preventive and therapeutic strategy for cadmium //Current Drug Targets, 2016, vol. 17, no. 12, pp. 1350-1384).Применение эндогенного вещества, гормона эпифиза мелатонина обладает преимуществом по сравнению с известными антиоксидантами. Наряду с выраженными антиоксидантными свойствами описываются адаптогенные эффекты, десенсибилизирующее, противовоспалительное, гепатопротекторное, антистрессорное действие и др. (Арушанян Э.Б. 2006-2022). Широко изучается роль мелатонина практически во всех процессах жизнедеятельности, влияние на сон, деятельность сердечно-сосудистой, эндокринной, иммунной системы, а также системы гемостаза (Арушанян Э.Б. Влияние мелатонина на тромбоцитарный гемостаз и его циркадную организацию 2013, 76(5); Kumari S, Dash D. Melatonin elevates intracellular free calcium in human platelets by inositol 1,4,5-trisphosphate independent mechanism. FEBSLett. 2011; 585(14):2345-2351.https://doi.org/10.1016/j.febslet.2011.05.067). Можно ожидать высокую эффективность мелатонина при хронической интоксикации, однако данных о возможности его применения с целью профилактики нарушений в системе гемостаза при длительном введении кадмия в организм мы в доступной литературе не обнаружили. Применение мелатонина в дозе 5 мг/кг в качестве профилактического средства в настоящей работе было обусловлено тем, что ранее в экспериментальных исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, была показана профилактическая эффективность мелатонина в данной дозе в условиях длительной интоксикации тяжелыми металлами (Gagloeva E.M., Moldovan N.V., Brin V.B., Botsieva N.V. PreventionofToxicCoagulopathytoEnsureLifeSafetyinlndustrializedRegions / InternationalConferenceonHealthandWell-BeinginModernSociety (ICHW 2019); AdvancesinHealthSciencesResearch, 2019. - Vol. 16. - P. 101-105. doi.org/10.2991/ichw-19.2019.25). Однако, эффективность применения мелатонина при свинцовой интоксикации не подтверждает возможность разработки профилактики кадмиевой коагулопатии, так как ранее не рассматривалось профилактическое влияние мелатонина на свертывающую систему крови при токсическом воздействии кадмия на организм крыс. Известно, что разные металлы имеют различные механизмы биологического действия и имеют преимущественные органы и «мишени» токсического действия (Авцын А.П. Микроэлементозы человека - Этиология, классификация органопатология М.: Медгиз. - 1991. - 496 с.). Соответственно эффективность данного способа при свинцовой интоксикации не доказывает возможность и эффективность профилактического использования мелатонина при длительном воздействии кадмия.

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ профилактики токсической коагулопатии у крыс (Ashour, TariqHelal. Preventative effects of caffeic Acid phenyl ester on cadmium intoxication induced hematological and blood coagulation disturbances and hepatorenal damage in rats //ISRN Hematol. 2014 Mar30; 2014:764754. http://dx.doi.org/10.1155/2014/764754) с внутрибрюшинным введением одного из компонентов прополиса обладающего антиоксидантными и противовоспалительными свойствами (фениловый эфир кофейной кислоты в дозе 10 мкмоль/кг) одновременно с внутрибрюшинным введением хлорида кадмия в дозе 1 мг/кг в день, в течение 21 дня.

Недостатками прототипа являются выбор средств профилактики, а также способы, дозы и сроки введения препаратов.

• компоненты прополиса, обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, однако длительное введение их в организм часто связано с развитием выраженных аллергических реакций. Напротив, мелатонин - эндогенный антиоксидант, который превосходит по своим эффектам известные природные антиоксиданты.

• профилактическое введение антиоксиданта в течение короткого времени не позволяет получить способ профилактики хронической токсической коагулопатии. Проводимый в течение двух месяцев хронический эксперимент позволяет более подробно в разные сроки в динамике изучить механизмы профилактического действия антиоксиданта на формирование нарушений звеньев в системе гемостаза в условиях токсического воздействия и является более информативным, что особенно важно при изучении системы гемостаза.

• Моделирование интоксикации при внутрибрюшинном введении соли кадмия более сложно в техническом исполнении чем внутрижелудочное введение через атравматичный зонд. Внутрижелудочное введение препаратов в нашем эксперименте соответствует естественным условиям интоксикации в условиях техногенного загрязнения окружающей среды, так как попадание в организм кадмия происходит в основном с пищей и водой перорально.

• Внутрибрюшинное введение антиоксиданта также сложно в техническом исполнении, по сравнению с внутрижелудочным введением через атравматичный зонд.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики хронической токсической коагулопатии у крыс под влиянием кадмия.

Решение этой задачи обеспечивает значительное уменьшение патологических сдвигов показателей в системе гемостаза при хроническом токсическом действии сульфата кадмия у крыс.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных отличается тем, что животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок водный раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл и мелатонин в качестве антиоксиданта в дозе 5 мг/кг.

Ежедневное введение мелатонина через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением сульфата кадмия способствует уменьшению степени патологических сдвигов показателей клеточного и плазменного гемостаза, препятствует уменьшению активности антикоагулянтной системы и фибринолитического звена системы гемостаза, уменьшает степень тромбинемии. Положительные эффекты связаны с уменьшением цитотоксичности кадмия, выраженным антиоксидантным и мембранопротекторным действием мелатонина. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической кадмиевой коагулопатии, отличающегося тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением водного раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хронической кадмиевойкоагулопатии, препятствуя патологической активации системы гемостаза и восстановлению противосвертывающего и фибринолитического потенциала крови, уменьшению концентрации маркеров тромбинемии при длительном воздействии кадмия, путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации, восстановления активности антиоксидантной системы, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом: для приготовления токсического вещества в дистиллированной воде растворяют сульфат кадмия таким образом, что в единице раствора, равной 0,3 мл, содержится 0,03 мг кадмия (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,3 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор сульфата кадмия вводится через атравматичный зонд в желудок в дозе 0,3 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней. Раствор мелатонина готовится ежедневно перед введением, для чего в дистиллированной воде растворяют таблетки препарата мелатонина Мелаксен (Unipharm, USA) таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,5 мг мелатонина.

Двум группам животных вводят раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг через атравматичный зонд в желудок ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней. Одновременно с первого дня введения соли кадмия одной из групп каждый день вводят раствор мелаксена в дозе 5 мг/кг через внутрижелудочный зонд.

Материалом для исследования является цельная кровь, а также плазма крови богатая и бедная тромбоцитами. Забор крови, стабилизация и получение образцов плазмы осуществляются с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики, СПб.: Формат, 2006, 208 с.). Исследовали показатели свертывающей системы, состояние противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза и их взаимосвязь с изменением активности процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты.

Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов, исследуется содержание малонового диальдегида в эритроцитах по методу В.Б. Гавриловой, основанному на взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой, гидроперекисей с использованием диагностических наборов Агат-Мед, Россия. О состоянии антиоксидантной защиты свидетельствовал уровень супероксиддисмутазыопределяемый методом аутоокисления адреналина и степень активности каталазы по методу Е. Beutler в сыворотке крови.

Для исследования состояния системы гемостаза определяются следующие показатели с применением стандартных методов: количество тромбоцитов и их агрегационная активность (индуктор АДФ - 10,0 мкг/мл), содержание фибриногена, активность протеина С и антитромбина АТ(III), относительное время полимеризации фибрин-мономеров (ВПФМ), время спонтанного эуглобулинового лизиса (ВСЭЛ), растворимые фибринмономерные комплексы (РФМК) (Елыкомов В.А., Момот А.П. Способ определения количества растворимого комплекса фибрин-мономера в плазме крови/ Авторское свидетельство 1371219, 1987, СССР; Баркаган, З.С, Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза, М.: Нъюдиамед-АО, 2008, 292 с.).

Результаты исследования у крыс с введением мелаксена и сульфата кадмия демонстрируют эффективность применения мелатонина с целью профилактики хронической кадмиевой коагулопатии. Мелатонин способствует уменьшению выраженности изменений клеточного и плазменного гемостаза, уменьшает уровень тромбинемии, восстанавливая активность процессов антикоагулянтной системы и фибринолиза. Положительные эффекты коррелируют с восстановлением антиоксидантной активности в условиях хронической интоксикации сульфатом кадмия.

Пример конкретного выполнения. При проведении экспериментов руководствовались статьей 11-й Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. №199).

Крысам самцам линии Вистар массой 300-350 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг каждый день в течение двух месяцев. Одновременно, с первого дня введения кадмия половине опытных животных каждый день интрагастрально вводили мелаксен в дозе 5 мг/кг. Контролем служили интактные животные (10 крыс), содержащиеся в стандартных условиях вивария. Стандартными методами исследовали показатели свертывающей системы, состояние противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза, активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты.

Состояние ПОЛ оценивали по содержанию МДА в эритроцитах и гидроперекисей с использованием диагностических наборов Агат-Мед, Россия. Антиоксидантный статус оценивали по активностисупероксиддисмутазы (СОД) определяемый методом аутоокисления адреналина и каталазы по методу Е. Beutler в плазме крови (спектрофотометр «PV1251A», Solar, Беларусь).

Для исследования состояния системы гемостаза определяли количество тромбоцитов и их агрегационную активность (индуктор АДФ 10,0 мкг/мл), фибриноген, АЧТВ, ПВ, ВПФМ, активность протеина С и АТ(III), ВСЭЛ, РФМК. Тесты выполнялись на агрегометре Helena (Великобритания), коагулометре автоматическом Helena - АС4, с применением диагностических наборов «Helena» (Великобритания); спектрофотометре «PV1251A», Solar, Беларусь; диагностических наборов «Технология стандарт», Барнаул, Россия.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ "STATISTICA 10.0" (StatSoft) и MicrosoftExcel 2016, с учетом распределения признаков в группах по критерию Шапиро-Уилка. Данные были представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25;Q75) в связи с малым количеством вариантов в выборке. Достоверность различий оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Для оценки статистической зависимости рядов наблюдений использовали коэффициент ранговой корреляции (r_s) Спирмена. Критическим уровнем значимости считали р≤0,05.

Проведенные эксперименты показали, что через две недели и один месяц введения сульфата кадмия выявлялось увеличение концентрации фибриногена, содержания тромбоцитов и их агрегационной активности (таблица 1). Одновременно возрастала активность протеина С и антитромбина III. Через один месяц происходило также укорочение АЧТВ (р≤0,05). Гиперкоагуляционная направленность изменений системы гемостаза компенсировалась активацией противосвертывающей системы и процессов фибринолиза. Время спонтанного эуглобулинового лизиса укорачивалось (р≤0,05). Через два месяца гиперкоагуляционная направленность системы гемостаза сохранялась, но выявлялось истощение противосвертывающей системы и фибринолиза. Активность протеина С сохранялась выше фона, но выявлялось уменьшение активности антитромбина (р≤0,05). Время спонтанного эуглобулинового лизиса укорачивалось (р≤0,001).

На фоне значимого повышения уровня растворимых фибринмономерных комплексов, можно констатировать развитие состояния тромботической готовности. Вместе с тем количество тромбоцитов и их агрегационная активность сохранялись повышенными, уровень фибриногена был значимо выше контроля. Состояние гиперкоагуляции и тромбинемии чаще сопровождаются расходованием фибриногена и тромбоцитопенией, вследствие активации процессов «непрерывного внутрисосудистого свертывания крови». Однако по данным литературы, при длительной стимуляции системы гемостазах при хронических патологических процессах и интоксикациях возможно развитие тромбинемии при сохраняющихся высоких уровнях острофазного белка фибриногена и также увеличения количества тромбоцитов (Момот А.П., Цывкина Л.П., Тараненко И.А. Современные методы распознавания тромботической готовности. Барнаул, 2011), что наблюдалось при хронической интоксикации в наших исследованиях.

При профилактическом применении мелатонина у крыс с длительной интоксикацией сульфатом кадмия было установило уменьшение напряжения в системе гемостаза, снижение вероятности развития состояния тромботической готовности, по сравнению с данными у крыс с изолированным введением кадмия. Об этом свидетельствует уменьшение выраженности изменений РФМК(р≤0,01) восстановление активности физиологических антикоагулянтов и процессов фибринолиза (Таблица 1).

Опыты показали, что ежедневное, на протяжении двух месяцев ведение сульфата кадмия крысам приводит к активации процессов перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует повышение концентрации гидроперекисей в мембранах эритроцитов через 2 недели, один и два месяца по срокам исследования (р≤0,05; р≤0,001 и р≤0,05) и малоновогодиальдегида (р≤0,01; р≤0,01 и р≤0,05). Отмечалось угнетение системы антиоксидантной защиты клеток, понижалась активность и катал азы через один и два месяца (р≤0,05; р≤0,01) и супероксиддисмутазы (р≤0,01; р≤0,01). Профилактическое введение мелатонина снижало процессы пероксидации в клетках относительно значений в группе с изолированным введением соли металла, и способствовало менее выраженному снижению активности каталазы (р≤0,05 через один месяц и р≤0,05 через два месяца) и СОД (р≤0,01 через один месяц и р≤0,05 через два месяца).

Корреляционный анализ показателей процессов перекисного окисления липидов и системы гемостаза выявил достоверные связи через один и два месяца, что отражается на корреляционных матрицах (таблица 2, 3, 4, 5).

Результаты экспериментов позволяют считать, что профилактическое введение антиоксиданта мелатонина крысам линии Вистар на фоне хронической интоксикации солями кадмия препятствует развитию нарушений в системе гемостаза при хронической интоксикации. Профилактическое применение мелатонина оказывает отчетливый профилактический эффект, уменьшая выраженность изменений показателей сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, восстанавливает активность противосвертывающей и фибринолитической систем крови, уменьшает степень тромбинемии и оксидативного стресса. Выявлены корреляционные связи изменения показателей в системе гемостаза с уменьшением уровня продуктов ПОЛ и восстановления активности антиоксидантных ферментов крови под влиянием мелатонина.

Результаты опытов позволяют считать целесообразным применение мелатонина с целью разработки методов профилактики и коррекции коагулопатии, развивающейся при воздействии соединений кадмия.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной токсикологии. Крысам с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок водный раствор мелатонина в дозе 5 мг/кг и водный раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл. Способ обеспечивает уменьшение выраженности изменений показателей сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, восстанавление активности противосвертывающей и фибринолитической систем крови, уменьшение степени тромбинемии и оксидативного стресса, что в свою очередь дает возможность разработать методы профилактики и патогенетической коррекции проявлений токсической коагулопатии у крыс при длительном воздействии кадмия на организм. 5 табл., 1 пр.

Способ профилактики токсической коагулопатии у крыс, включающий ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок водный раствор мелатонина в дозе 5 мг/кг и водный раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл.