СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И НАРУШЕНИЯ NO ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЯХ САХАРНОГО ДИАБЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/00 A61K31/415 A61P9/00 A61P39/06 A61P43/00 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, в частности к эндокринологии, и касается лечения ангиопатии и патологии внутренних органов при экспериментальном аллоксановом диабете.

Исследование биохимических показателей гемодинамических сосудистых осложнений сахарного диабета остается одной из наиболее актуальных проблем современной медико-биологической науки. Среди нескольких гипотез, объясняющих патогенез сосудистых диабетических поражений, особое место занимает развитие окислительного стресса, вследствие повышенной генерации активных метаболитов кислорода (АМК), и нарушения антиоксидантной защиты (АОЗ) клеток. Фактором риска в условиях окислительного стресса становится нарушение функции эндотелия, основными механизмами которой могут быть изменения активности и/или экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), сниженный синтез NO из L-аргинина, чувствительность гладкомышечных клеток (ГМК) к NO или усиленная его деградация за счет взаимодействия с активными формами кислорода (АФК), включая супероксид-анион, а также другими продуктами ПОЛ.

Учитывая важную роль в развитии сахарного диабета (СД) окислительного стресса, и нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия, можно полагать, что необходимой составляющей патогенетической терапии диабетических ангиопатии является новый методологический подход, основанный на применении препарата, обладающего антиоксидантными свойствами и способностью нормализовать метаболизм NO (Зенина Т.А., Силкина И.В., Серединин С.Б., Мирзоян Р.С. Экспериментальная и клиническая фармакологии. - 2006. - №4. - С.45-47; Balasanyan M.G., Kanayan A.S., Jhopchayan A.V. Acta Physiol. Hung. 2002. vol.89, №1-3, p.198).

По данным литературы селективный анксиолитик афобазол, синтезированный в ГУНИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, обладает способностью позитивно модулировать продукцию NO, ингибируя индуцибельную изоформу NO-синтазы и стимулируя конститутивную эндотелиальную NO-синтазу (NOS-3) и одновременно обладает антиоксидантными свойствами (Середенин С.Б., Мелкумян Д.С., Вальдман Е.А. Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах мозга инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2006. - Т.69. - №3. - С.3-6). Однако препарат афобазол ранее не использовали для коррекции эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях нейроангиопатиях, вызванных экспериментальным сахарным диабетом.

Весьма актуальным является исследование в эксперименте у крыс с сахарным диабетом типа 1 показателей активности ПОЛ, антиокислительной системы (АОС), концентрации суммарных метаболитов оксида азота (NOx), роли уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), липидного спектра крови и на основе этих фундаментальных данных разработка возможного пути коррекции нарушений с применением афобазола при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) у крыс. Вместе с тем следует отметить, что в доступной литературе отсутствуют данные о биохимических маркерах нарушения функции эндотелия и изучение влияния афобазола на метаболические показатели эндотелиальной дисфункции при экспериментальном сахарном диабете.

Известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях аллоксанового диабета в эксперименте, включающий использование в качестве лекарственного препарата убихинон-коэнзим Q₁₀, который вводят в количестве 0,11 мкл/100 г живого веса (см. патент РФ №2455702, МПК⁹ G09D 23/28, G01N 33/48, A61K 31/122, A61P 5/48, A61P 9/08, опубл. 10.07.2012 г.).

Недостатком данного способа является то, что не приводились данные экспрессии NOS-3 и не исследовалось участие L-аргинина - субстрата синтеза NO и стимулятора экспрессии NOS-3, а также влияние ингибитора энзима - L-NAME у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. На фоне L-аргинина и L-NAME и их комбинации с коэнзимом Q10 не исследовались показатели системы ПОЛ-АОС и характер изменений гемодинамики.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ лечения нефроангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных, включающий предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного, с последующим введением лекарственного препарата (см. патент РФ №2372898, МПК⁹ A61K 31/197, A61P 13/12, G09B 23/28, опубл. 20.11.2009 г.).

Недостатками прототипа являются отсутствие исследований по изучению влияния донора NO - L-аргинина и ингибитора энзима L-NAME на эти показатели, тогда как исследование этих веществ позволило бы выяснить новые звенья патогенеза сосудистых осложнений участие субстрата фермента L-аргинина и его ингибитора - L-NAME. Более того не представлены сведения о нарушении метаболизма холестерина и его влиянии на биодоступность оксида азота. Во всех этих условиях эксперимента отсутствуют данные о характере гемодинамических нарушений.

Технический результат заключается в определении дозы афобазола, повышении точности и достоверности коррекции экспериментального сахарного диабета по показателям окислительного стресса, NO-продуцирующей функции эндотелия и биодоступности NO.

Технический результат достигается тем, что в способе коррекции окислительного стресса и нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте, включающем предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного, с последующим введением лекарственного препарата, согласно изобретению, в качестве лекарственного препарата используют афобазол, который вводят в условиях окислительного стресса после увеличения уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза, подкожно в количестве 10 мг/кг живого веса один раз в сутки в течение 30 дней на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного или на фоне N^G-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME)-ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного.

Данный способ позволит вскрыть новые звенья патогенеза ангиопатии при хроническом аллоксановом диабете, предложить лечение, повышающее эффективность, воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и невысокую стоимость для проведения эксперимента на животных.

Сущность заявляемого способа подтверждена графически и таблицами: где на фиг.1 (а-г) представлены изменения концентрации общего холестерина и его содержание в липопротеинах различной плотности на фоне корригирующей терапии афобазолом при ЭСД.

Таблица №1. Изменение уровня экспрессии NOS-3 под влиянием афобазола и его комбинации с L-аргинином и L-NAME.

Таблица №2. Изменения системы ПОЛ-АОС на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME).

Таблица №3. Изменения системы ПОЛ-АОС на фоне субстрата L-аргинина.

Таблицы №4, 5, 6. Динамика изменения показателей гемодинамики в норме, при экспериментальном сахарном диабете и на фоне корригирующей терапии с афобазолом на фоне субстрата L-аргинина и ингибитора фермента NOS-3 - L-NAME.

Способ коррекции окислительного стресса и нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте осуществляли следующим образом.

Для поражения инсулиногенных β-клеток островков Лангерганса экспериментальный сахарный диабет (аллоксановый) вызывали путем внутрибрюшинного введения крысам 5% водного раствора аллоксана (синтезированного в лаборатории отдела патобиохимии ФГБУН ИБМИ ВНЦ РАН и РСО-А) в дозе 15 мг/кг веса животного натощак, на фоне 24-48 часового голодания при свободном доступе к воде. Через 48-72 часа натощак забирали кровь из хвоста крысы (микроколичество) и определяли уровень глюкозы глюкозооксидазным методом (тест-наборы). Модель считали состоявшейся при повышении глюкозы в крови в 2 раза. Для коррекции вводили афобазол подкожно в количестве 10 мг/кг веса животного один раз в сутки в течение 30 дней. Для выяснения вопроса о влиянии афобазола на доступность субстрата L-аргинина для эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) вводили афобазол на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного. В другом варианте экспериментов вводили афобазол на фоне N^G-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) - ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного, определяли показатели антиоксидантной системы, липидного спектра крови, состояние микро- и макрогемодинамики, а также концентрацию суммарных метаболитов NO и экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в условиях окислительного стресса, и по изменению этих показателей судили о наличии эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях сахарного диабета у животных.

По истечении срока эксперимента изучали перфузию в различных точках локации тканей (жидкостный обмен) прозвучиванием датчиком 10 МГц, работающим по принципу «слепого» допплера у наркотизированных животных. Затем крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА для определения концентрации малонового диальдегида (МДА) и сыворотку для определения активности СОД, каталазы, церулоплазмина и NO.

Уровень экспрессии NOS-3 в эндотелии аорты определяли методом Метельской В.А., Гумановой Н.Г., Литинской О.А. (Оксид азота: роль в регуляции биологических функций, методы определения в крови человека // Лабораторная медицина. - 2005. - №7. - С.19-24). Аорты извлекали, промывали физиологическим раствором и помещали в пластиковые пробирки, которые хранили в жидком азоте, после чего аорты обрабатывали соответственно методике. Полосу, соответствующую NOS-3, детектировали в соответствии с ее молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Пленку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы X к интенсивности полосы, принятой за контроль на каждой пленке. Аорта экспериментальных крыс подвергалась гистологическому исследованию микроскопически. Количественную оценку гистологических изменений структуры проводили по методу Автандилова с помощью цифрового фотоаппарата "Nikon", совмещенного с микроскопом.

Пример.

Исследование проводили в 9 группах крыс-самцов линии Вистар:

1-я группа - контрольная в количестве 20 голов;

2-я группа - крысы с экспериментальным сахарным диабетом в количестве 30 голов;

3-я опытная группа - интактные крысы+L-аргинин в дозе 10 мг/кг в течение 30 дней в количестве 15 голов;

4-я опытная группа - интактные крысы+L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 15 голов;

5-я опытная группа - крысы с ЭСД+L-аргинин в дозе 10 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов;

6-я опытная группа - крысы с ЭСД+L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов;

7-я опытная группа - крысы с ЭСД+афобазол в дозе 10 мг/кг веса животного в количестве 30 голов;

8-я опытная группа - крысы с ЭСД+афобазол в дозе 10 мг/кг веса животного+L-аргинин 10 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов;

9-я опытная группа - крысы с ЭСД+афобазол в дозе 10 мг/кг веса животного+L-NAME 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов.

Экспериментальный сахарный диабет, характеризующийся инсулиновой недостаточностью, вызывали у крыс опытной группы путем внутрибрюшинного введения 5% водного раствора аллокеана в дозе 15 мг/кг массы тела натощак на фоне 24-48-часового голодания при свободном доступе к воде. Через 48-72 часа натощак забирали кровь из хвоста (микроколичество) и определяли уровень глюкозы глюкозооксидазным методом (тест наборы) и при повышении глюкозы в крови, по крайней мере, в 2 раза.

Для коррекции нарушений ПОЛ, АОС, липидного спектра крови, микро- и макрогемодинамики а также концентрации суммарных метаболитов NO и экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) в условиях окислительного стресса вводили крысам опытной группы с экспериментальным сахарным диабетом в течение месяца подкожно афобазол в дозе 10 мг/кг массы тела.

По истечении периода введения исследовали показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы, липидного спектра крови, состояние микро- и макрогемодинамики, а также концентрацию суммарных метаболитов NO и экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) в условиях окислительного стресса.

Результаты свидетельствуют о существенном снижении концентрации МДА в крови под влиянием афобазола у диабетических крыс (с 8,65±0,031 нмоль/мл до 7,26±0,061 нмоль/мл (p<0,001) (см. строка 1, таблица 2). Анализ активности АОС показал достоверное возрастание активности СОД в сыворотке крови и эритроцитах (соответственно с 1,45±0,044 усл.ед. до 1,78±0,148 усл.ед. (p<0,05) и с 64,4±1,53 ед.акт. до 74,6±1,55 ед.акт. (p<0,001)) (см. строка 4, таблица 2), а повышенные данные каталазы и церулоплазмина достоверно снизились. Вместе с тем следует отметить, что активность каталазы осталась повышенной, что вероятно является проявлением клеточной компенсаторной реакции. В группе крыс на фоне лечения афобазолом статистически достоверно повысилась концентрация суммарных метаболитов NO в сыворотке крови с 32,54±1,56 мкмоль до 48,7±0,844 мкмоль (p<0,001) (см. строка 2, таблица 2). Для выяснения эффективности действия афобазола на процессы ПОЛ и активность ферментов АОЗ провели корреляционный анализ. Полученные данные в этой группе диабетических крыс, получавших лечение афобазолом, показали наличие прямой значимой корреляционной зависимости между концентрацией МДА и активностью каталазы (r=+0,60), и концентрацией церулоплазмина (r=+0,58) и обратной связи между снижением концентрации МДА и повышенной активности СОД в сыворотке крови (r=-0,61). Происходило повышение концентрации суммарных метаболитов NO и корреляционный анализ показал наличие отрицательной связи с МДА (r=-0,57).

Таким образом, афобазол угнетает ПОЛ, коррегирует взаимоотношения между ферментами АОЗ и способствует повышению концентрации суммарных метаболитов NO, хотя уровень их содержания не достигает контрольных значений. Полученные данные демонстрируют мембранопротекторные свойства афобазола in vivo при СД в эксперименте. Наши исследования впервые показали, что in vivo при СД у крыс афобазол, угнетая СРО и восстанавливая АОЗ, способствует повышению экспрессии eNOS и соответственно концентрации NO.

Ряд факторов влияют на экспрессию NOS-3 и эффективность образования NO:

- доступность субстрата L-аргинина

- наличие эндогенного ингибитора фермента NOS-3 - АДМА.

- состояние коферментов: НАДФН₂, ТТБП и т.д.

- влияние окисленных ЛНП, вызывающих атерогенные изменения сосудистой стенки.

Были исследованы изменения показателей обмена ХС: концентрации ОХС, ХС ЛВП, ХС ЛНП, ТАГ на фоне лечения афобазолом у крыс с СД. Анализ содержания общего ХС в сыворотке крови и его распределения в липопротеинах различной плотности показал, что на фоне лечения происходит статистически достоверное снижение концентрации ОХС с 3,896±0,161 ммоль/л до 2,493±0,04 ммоль/л, p<0,001, повышение ХС ЛВП с 0,556±0,012 ммоль/л до 0,601±0,003 ммоль/л, p<0,01 и значительное снижение в ЛНП с 3,124±0,15 ммоль/л до 1,706±0,044 ммоль/л, p<0,001 (см. фиг.1). Одновременно снижалась и концентрация ТАГ в сыворотке крови с 0,476±0,018 ммоль/л до 0,41±0,019 ммоль/л, p<0,02 (см. фиг.1).

Для выяснения взаимосвязи между концентрацией NO и липопротеиновым спектром сыворотки крови провели корреляционный анализ и выявили наличие отрицательной связи между этими показателями (r=-0,69; r=-0,67; r=-0,64; r=-0,71). Следовательно, снижение ОХС и ХС ЛНП в условиях угнетения ПОЛ способствовало повышению биодоступности NO. Для выяснения вопроса о влиянии афобазола на доступность субстрата L-аргинина для NOS-3 в другом варианте исследований вводили афобазол на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса тела в течение 3-х недель диабетическим крысам. По окончании эксперимента определяли в сыворотке крови концентрацию суммарных метаболитов NO и показатели окислительного стресса. Полученные результаты продемонстрировали повышение концентрации NO с 32,54±1,56 мкмоль при ЭСД до 42,27±0,893 мкмоль (p<0,01) при ЭСД+аргинин и до 50,54±0,472 (p<0,001) (см. строка 2, таблица 3) на фоне введения аргинина с афобазолом в этих вариантах исследований. Сопоставительный анализ данных у крыс с ЭСД на фоне L-аргинина и комбинации L-аргинина с афобазолом показал более существенное снижение концентрации МДА и повышение концентрации NO на фоне комбинированного введения L-аргинина и афобазола (см. таблица 3).

Эти данные подтверждают, что афобазол повышает биодоступность субстрата L-аргинина к своему ферменту и соответственно концентрацию суммарных метаболитов NO. Можно полагать, что афобазол в комбинации с L-аргинином оказывает влияние и на сам фермент NOS-3. Для выяснения этого вопроса мы исследовали экспрессию NOS-3 на фоне комбинированного введения L-аргинина и афобазола. Данные показали повышение уровня экспрессии NOS-3 на фоне комбинированного применения L-аргинина и афобазола.

В другом варианте экспериментов вводили афобазол на фоне L-NAME-ингибитора фермента NOS-3, контролем служили исследования на фоне введения одного ингибитора L-NAME. У интактных и диабетических крыс в этих вариантах определили концентрацию МДА, NO и экспрессию NOS-3. Данные показали, что концентрация NO значительно снизилась через 3 недели после введения L-NAME с 51,069±0,50 мкмоль до 33,13±0,595 мкмоль (p<0,001) (см. строка 2, таблица 2), причиной чему могло послужить угнетение экспрессии eNOS. В другом варианте исследований при введении афобазола на фоне L-NAME концентрация суммарных метаболитов NO повысилась с 30,74±0,567 мкмоль до 40,23±0,62 мкмоль, p<0,001, тогда как уровень МДА в крови снизился с 9,186±0,009 нмоль/мл до 8,01±0,053 нмоль/мл, p<0,001 (см. строки 1, 2, таблица 2).

Для подтверждения участия NOS-3 исследовали уровень экспрессии NO продуцирующего фермента в экстрактах аорты у диабетических крыс (см. таблица 1). Экспериментальные данные подтвердили впервые, что анксиолитик - афобазол, угнетая ПОЛ, повышает концентрацию NO и несомненно оказывает стимулирующее влияние на экспрессию NOS-3, тогда как на фоне L-NAME уровень экспрессии NOS-3 в экстрактах аорты был значительно снижен.

Коррекция дисфункции эндотелия, показателей окислительного стресса и метаболизма NO, сопровождалась повышением средней и систолической скоростей кровотока в сосудах микроциркуляторного русла, снижением плотности сосудистой стенки - индекса Гослинга (PI) и удельного периферического сосудистого сопротивления - индекса Пурсело (RI) (см. таблицы 5, 6).

Эти гемодинамические изменения свидетельствуют о повышении процессов перфузии, обусловленные снижением сосудистого сопротивления - реографического индекса и повышением средней и систолической скоростей кровотока на фоне введения афобазола. Для подтверждения эффективности влияния афобазола на гемодинамику в микроциркуляторном русле провели корреляционный анализ между концентрацией NO и скоростью кровотока соответственно средней, систолической и диастолической (r=+0,51; r=+0,56; r=+0,57; p<0,001). Из таблицы видно, что между повышением концентрации NO и процессов микроциркуляции выявлена положительная сильная корреляционная связь.

Исследования кровотока в магистральных артериальных сосудах (БА) показали снижение средней (М), систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока на фоне введения афобазола (см. таблицы 4, 5, 6). Характер изменений гемодинамики в почечных артериях показал аналогичную картину, характеризующуюся снижением средней (М) и систолической (S) скоростей кровотока на фоне лечения афобазолом. Данные реографических показателей выявили повышение индекса Гослинга (PI), следовательно, упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки, а также индекса Пурсело (RI), отражающего регионарное периферическое сосудистое сопротивление на фоне афобазола. В HПB происходит снижение средней (М), систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока, а также понижение реографических индексов: PI - индекса Гослинга и RI - индекса Пурсело (см. таблицы 5, 6). Эти данные свидетельствуют о том, что афобазол, оказывая антиоксидантное действие, повышает концентрацию суммарных метаболитов NO и уровень экспрессии NO - продуцирующего фермента - eNOS в эндотелии сосудов. Эти изменения метаболизма NO способствуют восстановлению функции эндотелия и снижают уровень гиперперфузии в магистральных артериальных сосудах. В противоположность этому восстановление функции регуляторов тонуса сосудов в микроциркуляторном звене способствует увеличению перфузии - жидкостного обмена.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом повысить эффективность лечения, для коррекции экспериментального сахарного диабета в условиях окислительного стресса, что характеризует его влияние на основное патогенетическое звено развивающейся ангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных, повысить воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность, и низкую стоимость проведения эксперимента и эффективность на крысах с экспериментальным сахарным диабетом.

Таблица 1 «Способ коррекции окислительного стресса…» Изменение уровня экспрессии eNOS под влиянием афобазола и его комбинации с L-аргинином и L-NAME   L-name ЭСД+L-name аргинин ЭСД+аргинин ЭСД+L-name+афобазол ЭСД+аргинин+афобазол M 0,567 0,305 1,05 0,65 0,753 1,51 m 0,088 0,003 0,087 0,104 0,199 0,12 Р₁   0,01 0,001 - - 0,001 Р₂     0,001 0,01 0,05 0,001 Р₃       0,01 - 0,01 Р₄         - 0,001 Р₅         0,01 0,01 Примечание: P₁ - достоверность относительно L-name; Р₂ - достоверность относительно ЭСД+L-name; P₂ - достоверность относительно L-аргинина; Р₄ - достоверность относительно ЭСД+L-аргинина; Р₅ - достоверность относительно ЭСД+афобазола

Таблица 2 «Способ коррекции окислительного стресса…” Изменения показателей в системе ПОЛ-АОС на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) при ЭСД Группы показатели   N ЭСД L-name ЭСД+L-name ЭСД+афобазол ЭСД+L-name+афобазол МДА, нмоль/мл M±m 6,87±0,044 8,65±0,031 7,213±0,012 9,186±0,009 7,26±0,061 8,01±0,053 Р₁   0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 Р₂     0,001 0,001 0,001 0,001 Р₃       0,001 - 0,001 Р₄         0,001 0,001 Р₅           0,001 NO, мкмоль M±m 51,069±0,5 32,54±1,56 33,13±0,595 30,74±0,567 48,7±0,844 40,23±0,62 Р₁   0,001 0,001 0,001 0,02 0,001 Р₂     - - 0,001 0,001 Р₃       0,01 0,001 0,001 Р₄         0,001 0,001 Р₅           0,001 каталаза, мкат/л M±m 225,56±25,57 345,33±3,16 310,03±2,054 382,14±1,58 307,6±3,35 338,15±1,84 Р₁   0,001 0,01 0,001 0,01 0,001 Р₂     0,001 0,001 0,001 0,05 Р₃       0,001 - 0,001 Р₄         0,001 0,001 Р₅           0,001 СОД, ед.акт. M±m 88,2±1,07 64,4±1,53 82,1±1,24 61,5±2,63 74,6±1,55 70,1±1,51 Р₁   0,001 0,01 0,001 0,001 0,001 Р₂     0,001 - 0,001 0,01 Р₃       0,001 0,01 0,001 Р₄         0,001 0,01 Р₅           0,05 церулоплазмин, мг/л M±m 338,66±6,365 467,6±8,945 360,2±6,697 497,1±5,25 394,2±4,86 430,1±5,08 P₁   0,001 0,02 0,001 0,001 0,001 Р₂     0,001 0,01 0,001 0,01 Р₃       0,001 0,001 0,001 Р₄         0,001 0,001 Р₅           0,001

Таблица 3 «Способ коррекции окислительного стресса…» Изменения показателей в системе ПОЛ-АОС на фоне субстрата L-аргинина при ЭСД Группы показатели   N ЭСД аргинин ЭСД+аргинин ЭСД+афобазол ЭСД+аргинин+афобазол МДА, нмоль/мл M±m 6,87±0,044 8,65±0,031 6,8±0,017 7,88±0,021 7,26±0,061 7,03±0,014 Р₁   0,001 - 0,001 0,001 0,01 Р₂     0,001 0,001 0,001 0,001 Р₃       0,001 0,001 0,001 Р₄         0,001 0,001 Р₅           0,01 NO, мкмоль M±m 51,069±0,5 32,54±1,56 53,25±0,412 42,27±0,893 48,7±0,80 50,54±0,472 Р₁   0,001 0,01 0,001 0,02 - Р₂     0,001 0,001 0,001 0,001 Р₃       0,001 0,001 0,001 Р₄         0,001 0,001 Р₅           0,05 каталаза, мкат/л M±m 225,56±25,57 345,33±3,16 221,72±1,056 320,2±2,08 307,6±3,35 283,64±1,42 Р₁   0,001 - 0,01 0,01 0,05 Р₂     0,001 0,001 0,001 0,001 Р₃       0,001 0,001 0,001 Р₄         0,01 0,001 Р₅           0,001 СОД, ед.акт. M±m 88,2±1,07 64,4±1,53 88,8±1,031 70,3±1,096 74,6±1,55 82,5±1,276 Р₁   0,001 - 0,001 0,001 0,01 Р₂     0,001 0,01 0,001 0,001 Р₃       0,001 0,001 0,001 Р₄         0,05 0,001 Р₅           0,001 церулоплазмин, мг/л M±m 338,66±6,365 467,6±8,945 336,3±1,43 419,8±6,806 394,2±4,86 351,4±2,676 Р₁   0,001 - 0,001 0,001 - Р₂     0,001 0,001 0,001 0,001 Р₃       0,001 0,001 0,001 Р₄         0,01 0,001 Р₅           0,001

Таблица 4 «Способ коррекции окислительного стресса…» Характер изменений показателей гемодинамики в норме, на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и субстрата L-аргинина у интактных крыс $$\frac{Точкалокации}{\begin{array}{l}Показатели\\ гемодинамики\end{array}}$$ Перфузия БА нпв ПА левая ПА правая   контроль М, см/с 2,518±0,076 13,468±0,473 9,420±0,440 5,052±0,304 4,377±0,402           S, см/с 11,338±0,264 38,8341,223 15,868±1,754 20,019±0,880 19,59±1,020           D, см/с 6,335±0,168 2,083±0,232 1,223±0,137 4,638±0,415 5,651±0,521           PI, см/с 7,668±0,250 2,814±0,155 1,692±0,121 5,036±0,297 4,830±0,467           GD, мм рт.ст. 0,042±0,001 0,548±0,020 0,118±0,008 0,148±0,012 0,27±0,011           RI, усл.ед. 1,490±0,036 0,948±0,011 1,042±0,008 1,191±0,029 1,24±0,044           L-аргинин М, см/с 2,62±0,007 13,12±0,0087 9,21±0,011 4,92±0,0097 4,22±0,0086           S, см/с 11,48±0,01 37,9±0,0097 14,75±0,011 19,76±0,0063 19,16±0,01           D, см/с 6,41±0,009 1,91±0,0086 1,13±0,0073 4,75±0,011 5,73±0,013           PI, см/с 7,5±0,009 2,9±0,0068 1,52±0,0083 5,18±0,0077 4,91±0,012           GD, мм рт.ст. 0,047±0,0028 0,48±0,0058 0,08±0,0068 0,11±0,0089 0,1±0,0061           RI, усл.ед. 1,38±0,0068 0,98±0,0089 0,91±0,0088 1,21±0,0063 1,26±0,01           L-NAME М, см/с 2,42±0,008 13,79±0,011 9,56±0,009 5,1±0,089 4,45±0,01           S, см/с 11,05±0,0097 39,02±0,012 16,54±0,012 20,84±0,01 19,63±0,009             D, см/с 6,27±0,011 2,16±0,008 1,43±0,008 4,51±0,008 5,6±0,008           PI, см/с 8,05±0,008 2,74±0,01 1,71±0,008 4,92±0,008 4,79±0,008           GD, мм рт.ст. 0,041±0,001 0,58±0,011 0,12±0,009 0,154±0,001 0,13±0,007           RI, усл.ед. 1,51±0,008 0,92±0,011 1,08±0,008 1,18±0,008 1,23±0,01          

Таблица 5 «Способ коррекции окислительного стресса…» Характер изменений показателей гемодинамики при ЭСД, на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и субстрата L-аргинина $$\frac{Точкалокации}{\begin{array}{l}Показатели\\ гемодинамики\end{array}}$$ Перфузия БА нпв ПА левая ПА правая ЭСД М, см/с 2,137±0,064 15,710±0,518 9,871±0,426 5,308±0,245 4,946±0,276 ^ПП) ^ПП)       S, см/с 10,48±0,165 40,292±0,855 18,204±0,544 22,59±0,50 20,025±0,485 ^ПП)     ^П)   D, см/с 6,25±0,220 2,95±0,372 2,162±0,219 4,09±0,303 5,495±0,378   ^ПП) ^ПП) ^ПП)   PI, см/с 9,504±0,231 2,804±0,149 1,793±0,092 3,746±0,259 3,973±0,282 ^{ПП)     ПП})   GD, мм рт.ст. 0,04±0,001 0,651±0,018 0,124±0,008 0,2±0,01 0,15±0,008 ¹)         RI, усл.ед. 1,572±0,03 0,932±0,010 1,12±0,013 1,145±0,021 1,207±0,029           ЭСД+L-аргинин М, см/с 2,28±0,0085 15,03±0,013 9,74±0,015 5,27±0,008 4,88±0,0098 ³³³³)²) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) S, см/с 10,78±0,012 39,7±0,0098 17,89±0,013 21,84±0,016 19,99±0,013 ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) D, см/с 6,29±0,0097 2,81±0,027 2,02±0,022 4,16±0,019 5,54±0,018 ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) PI, см/с 8,64±0,014 2,807±0,018 1,75±0,02 3,96±0,013 4,09±0,011 ³³³³)²²²) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) GD, мм рт.ст. 0,05±0,0011 0,61±0,012 0,12±0,0006 0,18±0,009 0,148±0,001 ²²²²) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) RI, усл.ед. 1,53±0,011 0,939±0,0012 1,09±0,0097 1,158±0,001 1,214±0,001 ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ЭСД+L-NАМЕ М, см/с 2,05±0,012 15,98±0,018 9,93±0,011 5,38±0,01 5,02±0,01 ⁴⁴⁴⁴)²²²) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) S, см/с 10,07±0,017 41,16±0,012 18,35±0,01 22,83±0,012 21,08±0,014 ⁴⁴⁴⁴)²²²) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴)²) D, см/с 6,02±0,014 3,07±0,01 2,26±0,008 3,92±0,01 5,35±0,011 ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) PI, см/с 9,74±0,015 2,78±0,014 1,84±0,012 3,47±0,008 3,81±0,013 ⁴⁴⁴⁴)   ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) GD, мм рт.ст. 0,031±0,0011 0,69±0,009 0,131±0,001 0,23±0,006 0,168±0,001 ⁴⁴⁴⁴)²²²²) ⁴⁴⁴⁴)   ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) RI, усл.ед. 1,68±0,017 0,942±0,001 1,18±0,008 1,117±0,001 1,18±0,008 ⁴⁴⁴⁴)²²²) ⁴) ⁴⁴⁴⁴)²²²²) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) Примечание: P_i - относительно нормы; Р₂ - относительно ЭСД; Р₃ - относительно L-аргинина; Р₄ - относительно L-name

Таблица 6 «Способ коррекции окислительного стресса…» Характер изменений показателей гемодинамики при ЭСД на фоне корригирующей терапии с афобазолом и его комбинации с ингибитором NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и субстрата L-аргинина $$\frac{Точкалокации}{\begin{array}{l}Показатели\\ гемодинамики\end{array}}$$ Перфузия БА нпв ПА левая ПА правая ЭСД+афобазол М, см/с 2,43±0,072 14,5±0,23 9,61±0,37 5,1±0,28 4,61±0,24 ²²²) ²)       S, см/с 11,22±0,137 39,08±1,14 16,69±0,85 20,87±0,46 19,92±0,96 ²²²)     ²²)   D, см/с 6,29±0,16 2,14±0,031 1,59±0,18 4,31±0,32 5,51±0,39   ²) ²)     PI, см/с 8,04±0,28 2,81±0,131 1,708±0,11 4,64±0,19 4,17±0,26 ²²²²)     ²²²)   GD, мм рт.ст. 0,042±0,001 0,59±0,02 0,121±0,009 0,16±0,012 0,14±0,01   ²)   ²²)   RI, усл.ед. 1,51±0,01 0,941±0,02 1,063±0,017 1,16±0,022 1,22±0,027 ²)   ²²²)     ЭСД+L-аргинин+афобазол М, см/с 2,44±0,027 13,71±0,105 9,47±0,04 5,086±0,034 4,46±0,04   ³³³³)¹) ³³³³) ³³³³) ³³³³) S, см/с 11,25±0,101 38,92±0,08 16,1±0,03 20,23±0,055 19,69±0,048 ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) D, см/с 6,21±0,028 2,17±0,051 1,4±0,035 4,57±0,034 5,6±0,03 ³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³) PI, см/с 7,91±0,043 2,81±0,062 1,7±0,032 4,97±0,029 4,62±0,036 ³³³³)     ³³³³) ³³³³) GD, мм рт.ст. 0,04±0,002 0,52±0,013 0,119±0,001 0,15±0,002 0,13±0,007 ³³³³) ³³³³)¹)   ³³³) ³³) RI, усл.ед. 1,5±0,013 0,944±0,001 1,052±0,001 1,191±0,001 1,234±0,002   ³³³) ³³³³) ³³³³) ³³³³) ЭСД+L-NAME+афобазол М, см/с 2,34±0,01 15,01±0,011 9,668±0,009 5,178±0,098 4,471±0,01 ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴)¹) ⁴⁴⁴⁴) ⁴) ⁴⁴⁴⁴) S, см/с 10,97±0,007 40,72±0,009 17,13±0,008 21,62±0,009 19,83±0,016 ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) D, см/с 6,22±0,011 2,63±0,009 1,809±0,009 4,34±0,009 5,573±0,016 ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴)¹¹¹¹) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) PI, см/с 8,17±0,01 2,71±0,007 1,744±0,007 4,682±0,009 4,46±0,011 ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) GD, мм рт.ст. 0,38±0,01 0,61±0,008 0,123±0,001 0,169±0,009 0,14±0,009 ⁴⁴⁴⁴)¹¹¹¹) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴) RI, усл.ед. 1,59±0,007 0,91±0,01 1,082±0,006 1,171±0,009 1,221±0,012 ⁴⁴⁴⁴)¹¹¹¹) ⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴⁴) ⁴⁴⁴) Примечание: P₁- относительно ЭСД+афобазола; Р₂ - относительно ЭСД; Р₃ - относительно - ЭСД+L-аргинин; Р₄ - относительно ЭСД+L-NAME

Изобретение относится к области медицины и предназначено для коррекции окислительного стресса и нарушения NO продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте. Способ включает предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного. Затем вводят афобазол в условиях окислительного стресса после увеличения уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза. Афобазол вводят подкожно в количестве 10 мг/кг живого веса один раз в сутки в течение 30 дней на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного или на фоне N^G-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME)-ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного. Заявленный способ позволяет эффективно корректировать окислительный стресс и нарушения NO продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета. 1 ил., 6 табл., 1 пр.

Способ коррекции окислительного стресса и нарушения NO продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте, включающий предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного с последующим введением лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата используют афобазол, который вводят в условиях окислительного стресса после увеличения уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза, подкожно в количестве 10 мг/кг живого веса один раз в сутки в течение 30 дней на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного или на фоне N^G-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) - ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного.