ШТАММ ДРОЖЖЕЙ GEOTRICHUM SP., ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ БИОЛОГИЧЕСКУЮ ДЕГРАДАЦИЮ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/16 C02F3/34 

Изобретение относится к области биологической обработки воды, биоочистки промышленных и бытовых сточных вод. Изобретение может быть использовано в биотехнологиях защиты окружающей среды.

Известно, что интенсивное развитие химической и оборонной промышленности приводит к накоплению в биогеоценозах токсичных, мутагенных и устойчивых загрязнителей, например нитроароматических соединений (ксенобиотиков). Одним из таких токсичных и устойчивых ксенобиотиков является 2,4,6-тринитротолуол (далее по тексту ТНТ), не подвергающийся биодеградации в существенных масштабах. Проблема усугубляется тем, что огромное количество ТНТ было произведено в период Второй мировой войны, и значительная его часть до сих пор обнаруживается в почвах и водах, что ведет к необходимости очистки окружающей среды от загрязнителей - ТНТ и его производных,

Известны штаммы микроорганизмов, осуществляющие трансформацию ТНТ при его различных начальных концентрациях в ТНТ-содержащих объектах.

Известен штамм бактерий Mycobacterium sp.strain HL4-NT-1 [1], трансформирующий молекулу ТНТ.

Недостатком штамма Mycobacterium sp.strain HL4-NT-1 [1] является то, что он неспособен разрушать (разлагать) образующиеся в ходе трансформации ТНТ гидридные комплексы Мейзенхеймера, 4-гидроксиламино-2,6-динитротолуол (4-ГАДНТ) и 4-амино-2,6-динитротолуол (4-АДНТ), что ведет к накоплению этих метаболитов в среде роста. Этот недостаток ограничивает область применения штамма [1] в природоохранной деятельности.

Известен штамм бактерий Rhodococcus erythropolis strain HLPM-1 [1], осуществляющий трансформацию ТНТ.

Недостатком штамма R. erythropolis strain HLPM-1 [1] является его неспособность разрушать образующиеся продукты трансформации ТНТ, например гидридные комплексы Мейзенхеймера, гидроксиламино-динитротолуолы (ГАДНТ) и амино-динитротолуолы (АДНТ), которые аккумулируются в среде роста. Этот недостаток ограничивает область применения штамма [1] в природоохранной деятельности,

Известен штамм бактерий Escherichia coli EPI300 [2], трансформирующий ТНТ.

Недостатком штамма E.соli EPI300 [2] является его неспособность разрушать образующиеся в процессе трансформации АДНТ, тетранитро-азокситолуолы, амино-диметил-тетранитробифенилы. Соединения характеризуются повышенной устойчивостью к разрушению известным штаммом. Это существенно ограничивает применение штамма [2] в промышленных условиях.

Известен штамм гриба Phlebia radiata ATCC 64658 [3], осуществляющий трансформацию TNT.

Недостатком штамма Ph. radiata ATCC 64658 [3] является его низкая устойчивость к повышенным концентрациям ТНТ (более 30 мг/л), а также необходимость проведения биотрансформации ТНТ семисуточной культурой, что приводит к нерациональной затрате времени и ограничивает применение штамма в промышленных условиях. К тому же применение штамма при очистке ТНТ-загрязненных объектов приводит к образованию и накоплению 4-ГАДНТ и 4-АДНТ, которые в дальнейшем не разрушаются известным штаммом.

Известен штамм гриба Bjerkandera adusta DSM 3375 [4], используемый для разложения ТНТ в концентрации не более 20 мг/л.

Недостатком штамма B. adusta DSM 3375 [4] является необходимость его предварительного культивирования в течение 6 суток для последующего осуществления разрушения ТНТ, что продлевает и удорожает биотехнологический процесс. Кроме того, уровень минерализации ТНТ штаммом гриба B. adusta DSM 3375 достигает всего 21% за 23 суток. Такая низкая эффективность разрушения ТНТ делает неприемлемым применение штамма [4] в промышленных условиях.

Наиболее близким к предлагаемому штамму - прототипом, является штамм гриба Irрех lacteus [5], способный осуществлять биологическую деструкцию (деградацию) ТНТ через образование и последующее разрушение гидридных комплексов Мейзенхеймера.

Недостатком прототипа [5] является то, что штамм гриба I. lacteus способен разрушать ТНТ только при концентрации, не превышающей 100 мг/л. Это существенно ограничивает возможность его (штамма) использования для биоочистки в промышленных масштабах, так как в производственных условиях сточные воды содержат гораздо более высокие концентрации ТНТ. К тому же известный штамм неспособен к глубокой деградации исходного ксенобиотика и разлагает только 31% ТНТ в течение длительного времени инкубации (до 77 суток).

Целью изобретения является получение нового штамма микроорганизма, осуществляющего глубокую и ускоренную биологическую деградацию ТНТ, повышение качества работы очистных сооружений, расширение области применения биотехнологий в природоохранной деятельности.

Цели достигают применением штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037.

Штамм дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 выделен из нефтешлама (отстоя сточных вод) нефтехимического предприятия ОАО «Нижнекамскнефтехим» (г.Нижнекамск, Республика Татарстан, Россия). Критерий отбора дрожжевого штамма: его способность синтезировать из ТНТ окрашенные гидридные комплексы Мейзенхеймера с последующим осуществлением их (гидридных комплексов) полной деградации и накоплением нитрит- и нитрат-ионов в качестве конечных минеральных форм азота.

Штамм дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 депонирован в уполномоченной организации ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика (г.Москва, Россия). Документ о национальном депонировании культуры Geotrichum sp., хранящейся под регистрационным номером ВКПМ F-1037, прилагается,

Родовая принадлежность дрожжей установлена с использованием определителя [6].

Характеристика штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037

Средой для получения биомассы дрожжей является агаризованная среда Сабуро, содержащая глюкозу - 10,0 г/л; пептон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; NaCl - 0,25 г/л; агар - 20,0 г/л дистиллированной воды,

Культурально-морфологические признаки

Рассев на агаризованной среде Сабуро дрожжевого штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 сопровождается ростом белых кожистых матовых колоний с ризоидным краем, диаметром колонии от 1 до 2 мм после 48 ч культивирования. При росте в жидкой среде Сабуро в статических условиях (без перемешивания) культура образует муть, осадок и пленку за 24-48 ч. При интенсивной аэрации (скорость перемешивания от 50 до 150 об/мин) пленка не образуется. Хорошо растет в синтетической среде и среде, содержащей сусло.

Световой микроскопией определено, что данная культура образует ветвящийся истинный септированный мицелий, распадающийся на артроконидии (размер клеток 3,5-4,5×6-23 мкм); почкование отсутствует; телеоморфное состояние не обнаружено.

Физиолого-биохимические признаки

Дрожжевой штамм является аэробным микроорганизмом. Оптимальная температура для роста от +25 до +30°С, оптимальный диапазон рН 3,5-7,5.

Штамм неспособен разлагать мочевину, сбраживать сахара, образовывать крахмалоподобные вещества, утилизировать нитриты и нитраты, D-глюкозамин, мальтозу, лактозу, мелибиозу, крахмал, метанол, креатин, креатинин.

Штамм способен к росту на D-галактозе, глицерине, этаноле, этиламине, L-лизине. Реакция с диазониевым синим В отрицательна.

Штамм не патогенен.

Предлагаемое изобретение поясняется следующим примером применения штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 для деградации 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ), среди полинитроароматических соединений особо устойчивого к разрушению биологическими способами. Пример демонстрирует очистку ТНТ-загрязненных объектов, например сточных вод.

Пример применения штамма

Предварительно накапливают биомассу штамма дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037, необходимую для очистки ТНТ-загрязненной среды. Для этого штамм Geotrichum sp. культивируют в течение 24-48 ч, например в жидкой среде Сабуро, следующего состава: глюкоза -10,0 г/л; пептон - 10,0 г/л; дрожжевой экстракт - 5,0 г/л; NaCl - 0,25 г/л дистиллированной воды. Штамм культивируют в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл при объеме среды 150-200 мл и при температуре от +25 до +30°С. Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 8000 g в течение 5 мин и отмывают K-Na-фосфатным буферным раствором (рН 7,0; 16 мМ). Затем клетки дрожжей вносят в синтетическую питательную среду (рН 7,0), содержащую глюкозу - 11,2 мМ, (NH₄)₂SO₄ - 7,6 мМ, МgSO₄ - 2,0 мМ, Na₂HPO₄ - 9,8 мМ, KН₂РO₄ - 6,2 мМ, ТНТ - 0,44-0,66 мМ (100-150 мг/л) и культивируют в колбах Эрленмейера на 250 мл при объеме среды 50 мл. Клетки культивируют в аэробных условиях, например, при скорости перемешивания среды до 150 об/мин и температуре от +28 до +30°С в течение 13-16 ч. Клетки дрожжей вносят в синтетическую питательную среду до конечной оптической плотности А₆₀₀ 4,0.

Биомассу дрожжей оценивают по изменению оптической плотности среды с клетками дрожжей при длине волны 600 нм с помощью УФ-видимого спектрофотометра, например Lambda 35 (Perkin Elmer, USA). В качестве контроля используют освобожденную от клеток культуральную жидкость.

Продукты трансформации ТНТ определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и ионной хроматографии.

ТНТ и продукты его превращения анализируют путем высокоэффективной жидкостной хроматографии, например, на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, USA), в обращенно-фазовом варианте с использованием колонки Supelcosil octyl C-8 (150×4,6 мм; 5 мкМ), с детекцией при 254 и 476 нм. Первоначально мобильная фаза состоит из 99% Na-фосфатного буферного раствора (рН 7,0; 25 мМ) и 1% метанола. В течение 2,0 мин количество метанола увеличивают до 30%, в течение следующих 13,0 мин - до 43%. В последующие 12,5 мин содержание метанола увеличивают с 43 до 100%. Данный градиент оставляют неизменным в течение 0,5 мин. В дальнейшем за 1,0 мин соотношение мобильной фазы возвращают к первоначальному уровню и оставляют постоянным в течение следующих 5,0 мин. Скорость потока 1,0 мл/мин, температура +36 или +50°С.

Нитрит-ион и нитрат-ион, являющиеся продуктами деструкции ТНТ, определяют с использованием ионного хроматографа, например, 761 Compact 1C (Metrohm AG, Швейцария), оснащенного разделительной колонкой Metrosep A Supp 5-150 (6.1006.520). Элюцию проводят растворами 1,0 мМ NаНСО₃ и 3,2 мМ Nа₂СО₃ со скоростью 0,7 мл/мин.

Заявляемый штамм дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 трансформирует ТНТ с образованием гидридных комплексов Мейзенхеймера в качестве главных метаболитов, а в последующем осуществляет их (гидридных комплексов) полную деструкцию с аккумуляцией нитрит- и нитрат-ионов. Время разрушения (деградации, деструкции) ТНТ предлагаемым штаммом зависит от начальной концентрации ТНТ; уровень биодеградации достигает 74% от исходного содержания ксенобиотика. Например, при концентрации ТНТ, равной 100 мг/л, 74%-й уровень разрушения ТНТ достигается за 13 ч, тогда как при концентрации ТНТ, равной 150 мг/л, 74%-й уровень деструкции ТНТ достигается за 16 ч. Заявляемый штамм сохраняет активность по отношению к ТНТ и в присутствии очень высокой концентрации ТНТ, например, при концентрации 200 мг/л (0,88 мМ).

Способность предлагаемого штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 разрушать ТНТ через промежуточное образование гидридных комплексов обусловлена его (штамма) свойством продуцировать органические кислоты. Синтез и экскреция органических кислот дрожжами сопровождается снижением внеклеточного рН от 7,0 до 2,8, стимулирующего активацию клеточных ферментов, ответственных за интенсивную деградацию гидридных комплексов.

Существенным отличием предлагаемого штамма Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 от прототипа является способность заявляемого штамма осуществлять деградацию ТНТ при его (ТНТ) концентрации до 200 мг/л. Заявляемый штамм сохраняет активность при концентрации ТНТ, в 2 раза превышающей допустимую концентрацию ТНТ для прототипа (Irреx lacteus). Другим преимуществом предлагаемого штамма является более глубокая и ускоренная деструкция ТНТ, достигающая 74% в течение 13-16 ч, тогда как прототип подвергает деструкции только 31% ТНТ при концентрации, не превышающей 100 мг/л, за 77 суток.

Устойчивость заявляемого штамма к высоким концентрациям ТНТ, способность заявляемого штамма к ускоренному и глубокому разрушению ТНТ позволяет использовать штамм Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 для биоочистки промышленных отходов, природных и сточных вод, грунтов, загрязненных взрывчатыми веществами. Приведенный пример применения предлагаемого изобретения подтверждает его полезность для биоочистки (биоремедиации) объектов, загрязненных ксенобиотиками нитроароматической природы, повышает качество работы очистных сооружений, расширяет область применения биотехнологий в природоохранной деятельности.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как среди известных микроорганизмов не обнаружен штамм, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения,

Заявляемый штамм имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены микроорганизмы, характеризующиеся одинаковой способностью осуществлять биологическую деградацию нитроароматических ксенобиотиков (на примере ТНТ). Штамм Geotrichum sp. ВКПМ F-1037, разрушающий токсичные соединения, полезен в качестве основы соответствующих природоохранных биотехнологий.

Заявляемый штамм Geotrichum sp. ВКПМ F-1037 можно реализовать в промышленном производстве, например, для очистки промышленных сточных вод, загрязненных нитроароматическими соединениями. Это соответствует критерию "промышленная применимость", предъявляемому к изобретениям.

Использованные источники

1. Vorbeck С., Н.Lenke, P.Fischer, J.-C.Spain, H.-J.Knackmuss. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene // Appl. Environ, Microbiol. -1998. - V. 64. - P. 246-252.

2. Stenuit В., L.Eyers, R.Rozenberg, J.-L.Habib-Jiwan, S.N.Agathos. Aerobic growth of Eschehchia coli with 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) as the sole nitrogen source and evidence of TNT denitration by whole cells and cell-free extracts // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - V.72. - P.7945-7948.

3. Van Aken В., K.Skubisz, Н.Naveau, S.N.Agathos. Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by the white-rot basidiomycete Phlebia radiata // Biotechnol. Lett. - 1997. - V.19. - P.813-817.

4. Eilers A., E.Rüngeling, U.M.Stündl, G.Gottschalk. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by the white-rot fungus Bjerkandera adusta DSM 3375 depends on cytochrome P-450 // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V.53. - P.75-80.

5. Kim H.Y., H-G. Song. Transformation and mineralization of 2,4,6-trinitrotoluene by the white rot fungus Irрех lacteus // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2003. - V.61. - P.150-156.

6. Barnett J., R.Payne, D.Yarrow. Yeasts: characteristics and identification // Great Britain: Cambridge University Press, 1983. - 811 p.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен штамм дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037, осуществляющий биологическую деградацию 2,4,6-тринитротолуола. Предложенный штамм сохраняет высокую активность при концентрации ТНТ до 200 мг/л и обеспечивает его ускоренную деструкцию, достигающую 74% в течение 13-16 ч. 1 пр.

Штамм дрожжей Geotrichum sp. ВКПМ F-1037, осуществляющий биологическую деградацию 2,4,6-тринитротолуола.