ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492-ДЕСТРУКТОР ТРИНИТРОТОЛУОЛА Российский патент 2012 года по МПК C12N1/16 C02F3/34 

Предлагаемое изобретение относится к области биологии и может быть использовано в биотехнологиях очистки вод и почв, загрязненных полинитроароматическими соединениями.

Известно, что производство и использование различных высокоустойчивых токсичных и потенциально мутагенных синтетических соединений (ксенобиотиков) приводит к загрязнению воздуха, почв, поверхностных и грунтовых вод. Среди ксенобиотиков опасность для окружающей среды представляют полинитроароматические соединения, например α-тринитротолуол (далее по тексту ТНТ) и его производные, интенсивно применяющиеся в оборонной промышленности и в качестве химических интермедиатов при производстве красителей. Постоянное воздействие ТНТ и метаболитов его нитровосстановления на организм человека приводит к развитию заболеваний, например апластической анемии, катаракты, нарушению функционирования печени, образованию опухолей в мочевыводящей системе. Предотвратить поступление данных ксенобиотиков в организм человека можно, создавая и совершенствуя технологии, направленные на их удаление из загрязненных объектов по различным схемам, например деструкцией на менее токсичные и/или нетоксичные соединения, а также минерализацией до безвредных неорганических соединений.

Известен штамм гриба Phanerochaete chrysosporium DSM 1556 [1], используемый для разложения ТНТ в концентрациях от 0,36 до 20,36 мг/л в жидкой ростовой среде. Недостатком штамма [1] является то, что потенциал минерализации ТНТ известным грибом существенно ограничен, так как его (гриба) рост подавляется уже в присутствии относительно низких концентраций ТНТ (в присутствии 25 мг/л и более). К тому же минерализация ТНТ после 18-ти дней культивирования достигает лишь 14% при его исходной концентрации 20,36 мг/л. Невысокая эффективность и низкая устойчивость Phanerochaete chrysosporium DSM 1556 к токсическому действию ТНТ не позволяет применять этот штамм для промышленной биоремедиации (обезвреживание биологическим способом) объектов, загрязненных высокими концентрациями исходного ксенобиотика.

Известен бактериальный штамм Pseudomonas savastanoi [2], преобразующий ТНТ при его начальной концентрации до 70 мг/л. В присутствии ТНТ в качестве единственного источника углерода и азота известный штамм денитрирует ТНТ в 2,4-динитротолуол (2,4-ДНТ), соединение менее устойчивое, нежели ТНТ. Недостатком этого штамма [2] является его существенно ограниченная способность разлагать ТНТ (не более 1% от исходного количества ТНТ).

Известен консорциум микроорганизмов [3], преобразующий ТНТ (при начальной концентрации до 40 мг/л) в аэробном биореакторе. Этот процесс ведет к отщеплению нитрогруппы от молекулы ТНТ и аккумуляции нитрит-иона и 3-метил-4,6-динитрокатехола в биореакторе. Недостатком известного консорциума [3] является значительная продолжительность его воздействия на ТНТ (30 дней) до проявления результата частичной деструкции и неспособность этих микроорганизмов минерализовать более 3% ТНТ.

Известны штаммы вида Escherichia coli [4], осуществляющие частичную деструкцию ТНТ при его исходной концентрации до 100 мг/л. Среди метаболитов преобразования ТНТ идентифицирован дигидридный комплекс Мейзенхеймера, являющийся нестабильным соединением. Разложение последнего метаболита штаммами вида Escherichia coli сопровождается накоплением в среде роста нитрит-иона и 2-гидроксиламино-6-нитротолуола. Недостатком штаммов вида Escherichia coli [4] является их неспособность разлагать образовавшиеся в ходе преобразования молекулы ТНТ углеродсодержащие метаболиты, в частности 2-гидроксиламино-6-нитротолуол. Конечные углеродсодержащие продукты также имеют ароматическую структуру, что ведет к необходимости использования других микроорганизмов для их последующего разрушения до безвредных соединений. Все это существенно замедляет процесс деструкции ТНТ, делая его (процесс) промышленно неприемлемым.

Наиболее близким по существу к предлагаемому изобретению (прототипом) является штамм гриба Penicillium sp. I-2081 [5], используемый для очистки ТНТ-загрязненных объектов. Известный штамм способен разлагать до 75% ТНТ при его исходной концентрации 100 мг/л.

Недостатком прототипа [5] является неспособность гриба разлагать ТНТ, когда его (ТНТ) концентрация превышает 100 мг/л. Способ очистки с использованием прототипа [5] длителен по времени (не менее 10 суток), требует присутствия в очищаемой среде высокой концентрации глюкозы (оптимально 15 г/л) и высокой концентрации биомассы гриба (оптимально 150 г/л). Все это приводит к недостаточной интенсивности и удорожанию процесса очистки известным штаммом. Недостатком известного штамма также является то, что высокие (более 100 мг/л) концентрации ТНТ тормозят рост и развитие культуры и его (штамм) невозможно использовать для биологической очистки объектов с высоким содержанием ТНТ.

Целью изобретения является получение штамма, способного за короткий, приемлемый для практики период очищать объекты, загрязненные ТНТ.

Цели достигают использованием дрожжевого штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492, являющегося активным деструктором ТНТ.

Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 выделен из загрязненных нефтью торфяников (Западная Сибирь, Россия). Критерий отбора штамма: его способность осуществлять деструкцию молекулы ТНТ после присоединения гидрид-ионов к ароматическому кольцу с накоплением нитрит- и нитрат-ионов в качестве конечных минеральных форм азота.

Штамм депонирован в уполномоченном учреждении ВКПМ ФГУПГосНИИгенетика (Москва, Россия). Документ о национальном депонировании штамма Yarrowia lipolytica, хранящегося под регистрационном номером ВКПМ Y-3492,

прилагается.

Родовая и видовая принадлежность дрожжей определена с использованием определителя Барнета с соавторами [6].

Характеристика штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492

Средой для поддержания штамма является агаризованная среда Сабуро [7], содержащая глюкозу 10,0 г/л; пептон 10,0 г/л; дрожжевой экстракт 5,0 г/л; NaCl 0,25 г/л; агар 20,0 г/л дистиллированной воды.

Культурально-морфологические признаки

Колонии дрожжевого штамма при рассеве на агаризованной среде Сабуро пастообразные, складчатые, кремового цвета с ровным краем, диаметром 3-6 мм. При росте на жидкой среде Сабуро в стационарных условиях культура образует муть, осадок и пленку за 24 ч. При интенсивной аэрации (скорость перемешивания от 50 до 200 об/мин) пленка не образуется. Хорошо растет в синтетической среде и среде, содержащей сусло [7].

Световой микроскопией определено, что культура представлена овальными дрожжевыми клетками (6,5×4,5 мкм), размножающимися почкованием. С возрастом клетки образуют хорошо развитый псевдомицелий и истинный мицелий, не распадающийся на артроспоры. Баллистоспоры, телейтоспоры, хламидоспоры и базидиоспоры не обнаружены.

Физиолого-биохимические признаки

Изученный штамм является аэробным микроорганизмом. Оптимальная температура для роста 22-30°C, оптимальный диапазон pH 3,5-7,5.

Выделенный штамм характеризуется слабой уреазной активностью и отсутствием способности сбраживать сахара, синтезировать крахмалоподобные вещества, утилизировать нитриты и нитраты, D-галактозу, L-сорбозу, D-глюкозамин, D-рибозу, D-ксилозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, рафинозу, инулин, крахмал, метанол, креатин, креатинин.

Изученная культура способна к росту на гексадекане, глицерине, эритрите, сукцинате, цитрате, этаноле, L-лизине. Реакция с диазониевым синим В отрицательна.

Штамм не патогенен.

Изобретение поясняется следующим примером использования предлагаемого штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 для очистки объектов, содержащих ТНТ и его производные, наиболее трудно разрушаемые токсичные полинитроароматические соединения.

Для изучения трансформации ТНТ штаммом Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 в периодических условиях используют синтетическую среду [7], содержащую глюкозу 11,2 мМ; (NH4)2SO4 7,6 мМ; MgSO4 2,0 мМ; Na2HPO4 1,94 мМ; KH2РO4 14,06 мМ (pH 6,0). ТНТ вносят из расчета 150 мг/л перед автоклавированием среды.

При изучении динамики деструкции ТНТ дрожжи предварительно культивируют в течение 20-24 ч в жидкой среде Сабуро следующего состава: глюкоза 10,0 г/л; пептон 10,0 г/л; дрожжевой экстракт 5,0 г/л; NaCl 0,25 г/л дистиллированной воды. Предварительное культивирование проводят в конических колбах на 500 мл при объеме среды 150 мл при 30°C. Затем клетки осаждают центрифугированием при 8000 g в течение 5 мин и дважды отмывают K-Na-фосфатным буферным раствором (pH 6,0; 16 мМ) с последующей инокуляцией синтетической среды, содержащей ТНТ (150 мг/л), в конических колбах на 250 мл при объеме среды 50 мл. Культивируют в аэробных условиях во встряхиваемых колбах (скорость перемешивания 150 об/мин) при 30°C в течение 14 ч. Исходная оптическая плотность среды с клетками после инокуляции дрожжей соответствует А600 3,0.

Спектрофотометрические измерения выполняют, например, на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer, USA). Клеточную массу оценивают, измеряя оптическую плотность среды с клетками при длине волны 600 нм. Контролем является освобожденная от клеток культуральная жидкость.

ТНТ и его метаболиты анализируют путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее по тексту ВЭЖХ), например, на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, USA), в обращеннофазовом варианте с использованием колонки Supelcosil octyl C-8 (150×4,6 мм; 5 мкМ), с детекцией при 254 и 476 нм. Первоначально мобильная фаза состоит из 99% Na-фосфатного буфера (pH 7,0; 25 мМ) и 1% метанола. В течение 2,0 мин количество метанола увеличивают до 30%, в течение следующих 13,0 мин - до 43%. Последующие 12,5 мин хроматографии связаны с повышением содержания метанола до 100%, данный градиент оставляют неизменным в течение 0,5 мин. В дальнейшем за 1,0 мин соотношение мобильной фазы возвращают к первоначальному уровню и оставляют постоянным в течение следующих 5,0 мин. Скорость потока 1,0 мл/мин, температура 50°C.

Нитрит- и нитрат-ионы в культуральной жидкости дрожжей определяют с помощью ионного хроматографа, например, Dionex (USA), оснащенного предколонкой IonPac AG9-HC (4×50 мм) и разделительной колонкой IonPac AS9-HC (4×250 мм).

Проведенные исследования выявили способность предлагаемого штамма дрожжей к синтезу восьми гидридных комплексов Мейзенхеймера из ТНТ (150 мг/л), которые впоследствии при участии данного штамма подвергаются полной деградации с освобождением азота в виде нитроанионов.

Предполагаемые пути деструкции ТНТ в направлении его минерализации штаммом Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 следующие:

Первый путь основан на разрушении С-3 моногидридного комплекса (3-Н--ТНТ) при одновременном формировании 2,4-динитротолуола. Второй путь основан на деградации С-1 моногидридного комплекса (1-Н--ТНТ). Третий путь основан на разложении протонированных дигидридных комплексов (изомеры 3,5-2Н--ТНТ·Н+). Все три механизма обеспечивают освобождение углеродного скелета ТНТ от азотсодержащих заместителей, сопровождающееся выделением в среду нитрит- и нитрат-ионов. Схема основана на биологической деструкции всех восьми ВЭЖХ-очищенных ТНТ-гидридных комплексов. Эффективность деструкции ТНТ (в %) предлагаемым штаммом составляет 75% от исходной концентрации 150 мг/л всего за 14 ч.

Таким образом, показано, что предлагаемый штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 осуществляет деструкцию ТНТ при концентрации 150 мг/л, то есть при концентрации, в 1,5 раза превышающей возможности прототипа - штамма Penicillium sp. I-2081. Это позволяет использовать предлагаемый штамм при очистке почв, поверхностных, грунтовых и сточных вод, загрязненных высокими концентрациями ТНТ, в условиях, когда неприменимы известные аналоги и прототип. Предлагаемый штамм способен разрушать молекулу ТНТ (при содержании ТНТ до 150 мг/л) при небольшом количестве дрожжевых клеток (0,5 г/л), за короткий (по сравнению с прототипом) период культивирования (14 ч) и в присутствии невысокой концентрации глюкозы (2,0 г/л).

Для сравнения: прототип неприменим при концентрации ТНТ, превышающей 150 мг/л. При содержании ТНТ в концентрации 100 мг/л и менее прототип применим и обеспечивает аналогичный (предлагаемому штамму) уровень деструкции исходного ксенобиотика за 240 ч (10 суток), то есть за больший промежуток времени (в 17 раз), при существенно большем количестве клеток 150 г/л (предлагаемый штамм 0,5 г/л), при концентрации глюкозы 15,0 г/л (для предлагаемого штамма 2,0 г/л).

Приведенный пример использования предлагаемого изобретения подтверждает его полезность для биотехнологической очистки объектов, загрязненных ксенобиотиками нитроароматического ряда. Применение предлагаемого штамма способствует глубокой деструкции устойчивых и токсичных химических соединений, например α-тринитротолуола, что может быть применено при обезвреживании сточных вод предприятий, производящих данные вещества.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как среди известных аналогов и прототипа не обнаружен штамм, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Предлагаемый штамм имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены штаммы, характеризующиеся сходным метаболизмом в отношении биологической деградации полинитроароматических ксенобиотиков, в частности ТНТ. Получение штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492, способного к разложению и детоксикации данных соединений, представляет интерес в качестве основы соответствующих природоохранных биотехнологий.

Заявленный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 можно реализовать в промышленном производстве, например, при очистке промышленных сточных вод, загрязненных ТНТ. Это соответствует критерию "промышленная применимость", предъявляемому к изобретениям.

Источники информации

1. Michels J., G.Gottschalk. Inhibition of the lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium by hydroxylamino-dinitrotoluene, an early intermediate in the degradation of 2,4,6-trinitrotoluene // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - V.60. - P.187-194.

2. Martin J.L, S.D.Comfort, P.J.Shea, T.A.Kokjohn, R.A.Drijber. Denitration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas savastanoi // Can. J. Microbiol. - 1997. - V.43. - P.447-455.

3. Tront J.M., J.B.Hughes. Oxidative microbial degradation of 2,4,6-trinitrotoluene via 3-methyl-4,6-dinitrocatechol // Environ. Sci. Technol. - 2005. - V.39. - P.4540-4549.

4. González-Pérez M.M., Р. van Dillewijn, R.M.Wittich, J.L.Ramos. Escherichia coli has multiple enzymes that attack TNT and release nitrogen for growth // Environ, Microbiol. - 2007. - V.9. - P.1535-1540.

5. Патент РФ «Микробиологический способ удаления нитроароматического соединения, присутствующего в растворе или в почве» RU №2249564, 7МПК C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/14, C12R 1:80, приоритет от 29.09.1999. Текст описания от 10.04.2005.

6. Barnett J., R.Payne, D.Yarrow. Yeasts: characteristics and identification // Great Britain: Cambridge University Press, 1983. - 811 p.

7. Практикум по микробиологии. Под. ред. А.И.Нетрусова, M.: Издательский центр "Академия", 2005. - 608 с.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 - деструктор тринитротолуола. Штамм осуществляет деструкцию ТНТ при его содержании до 150 г/л за период культивирования 14 ч при количестве дрожжевых клеток 0,5 г/л и концентрации глюкозы 2 г/л.

Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 - активный деструктор тринитротолуола.