БИОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/16 C12Q1/02 

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов и сред с использованием свободных или иммобилизованных клеток микроорганизмов и может быть использовано для выявления токсичных нитроароматических соединений (ксенобиотиков) в различных средах, для контроля качества очистки загрязненных поверхностных и грунтовых вод, сточных вод, в природоохранной деятельности.

Нитроароматические соединения широко применяются при производстве пенополиуретана, гербицидов, инсектицидов, красителей, фармацевтических препаратов, а также в оборонной промышленности. Использование этих соединений, а также сброс сточных вод промышленными предприятиями, синтезирующими эти соединения, способствует их (ксенобиотиков) широкому распространению и циркуляции в окружающей среде. Из нитроароматических ксенобиотиков наибольшее распространение получил токсичный и потенциально мутагенный 2,4,6-тринитротолуол (далее по тексту ТНТ). Обнаружение (детекция) ТНТ и его метаболитов в окружающей среде позволяет оценивать эффективность очистки и обезвреживания ТНТ-загрязненных объектов. В связи с этим разработка недорогих и эффективных методов детекции токсичных нитроароматических соединений на примере ТНТ в объектах окружающей среды является актуальной проблемой.

Важная роль для оценки состояния объектов окружающей среды отводится биосенсорам, которые перспективны как анализаторы, характеризующиеся простотой и надежностью эксплуатации, эффективностью применения, селективностью, низкой стоимостью биологического материала. Это дает возможность разрабатывать биосенсоры для детекции различных экологически опасных соединений.

Известен способ [1] детекции ТНТ (ксенобиотик) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Недостатками способа [1] являются необходимость применения высокочистых растворителей и громоздкого и дорогостоящего оборудования, а также высококвалифицированного персонала. К тому же проведение анализа возможно только в лабораторных условиях, что ограничивает применение способа [1] за пределами лаборатории.

Известен способ [2] детекции (определения) ТНТ в подземных водах с использованием волоконно-оптического биосенсора Analyte 2000.

Недостатком способа [2] является необходимость предварительного синтеза флуоресцентно меченного аналога ТНТ и его последующей очистки с использованием дорогостоящего прибора-хроматографа. Кроме того, при повышенной концентрации ТНТ в анализируемом растворе (свыше 3,5 мг/л) его (раствор) необходимо развести, что удлиняет процедуру анализа. К тому же известный волоконно-оптический биосенсор не характеризуется селективностью, так как детектирует не только ТНТ, но и другие соединения, например тринитробензолсульфоновую кислоту, что может привести к получению ошибочных данных о наличии или отсутствии ТНТ в тестируемой жидкости.

Известен способ [3] детекции ТНТ (электрохимический метод) с использованием синтетических нановолокон полианилина, легированных полипептидом.

Недостатком способа [3] является то, что определение ТНТ в различных ТНТ-содержащих водных образцах (водопроводной, речной, морской воде) ведет к получению неоднозначных сигналов и, следовательно, способствует получению недостоверных результатов. Кроме того, отсутствуют данные относительно возможности применения способа для обнаружения ТНТ в анализируемых растворах с различным значением рН и при различных температурах. Таким образом, применение известного способа [3] ограниченно.

Наиболее близким по техническому решению к предлагаемому изобретению (прототипом) является биосенсорный способ детекции ТНТ в водной среде, основанный на совместном использовании ТНТ-чувствительного и ТНТ-резистентного генотипов зеленых микроводорослей Dictyosphaerium chlorelloides [4].

Недостатком прототипа [4] является то, что необходимо постоянно поддерживать клетки микроводорослей в определенной фазе роста путем их (клеток микроводорослей) серийных переносов в свежую питательную среду и культивирования, при этом непрерывно обеспечивая оптимальную температуру и интенсивность освещения. Первоначальный процесс получения ТНТ-резистентных клеток является трудоемким и занимает длительное время (90 дней), что продлевает и удорожает процесс анализа, ограничивает область применения способа. К тому же присутствие высокой концентрации ТНТ в тестируемом растворе (свыше 31,3 мг/л) ведет к необходимости его (раствора) разведения для сохранения активности микроводорослей, что удлиняет процедуру анализа.

Целью изобретения является создание чувствительного и селективного биосенсора для определения 2,4,6-тринитротолуола в различных средах, упрощение процесса определения, сокращение времени проведения биологического тестирования, повышение производительности труда при анализе, расширение области применения микробных биосенсоров в природоохранной деятельности.

Цели достигают тем, что в качестве биосенсора для ТНТ используют свободные и/или иммобилизованные клетки штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492.

В качестве носителей для иммобилизации клеток штамма дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 применяют, например: хитин, целлюлозу, кремнезем, керамику, нейлон, полиуретановые пленки, стекловолокно, криогель поливинилового спирта, полиакриламидный гель, альгинатный гель, агарозу.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что 2,4,6-тринитротолуол определяют, используя уникальную способность штамма дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 образовывать из исходного ксенобиотика темно-красный моногидридный комплекс Мейзенхеймера (3-Н^--ТНТ) в качестве начального мажорного метаболита, который в дальнейшем детектируется в видимом диапазоне длин волн. Уникальность штамма заключается в том, что он способен избирательно восстанавливать только ароматическое кольцо молекулы ТНТ с образованием окрашенных метаболитов. Этим обеспечивается селективность предлагаемого биосенсора.

Оптическая плотность развивающейся окраски раствора вследствие образования 3-Н^--ТНТ дрожжами пропорциональна снижению концентраций ТНТ. Предварительно готовят серию разведений ТНТ (от 1 мг/л до 100 мг/л) в K-Na-фосфатном буферном растворе (pH 7,0) и вносят глюкозу в концентрации 1,0 г/л в качестве источника редуцирующих эквивалентов. Затем в приготовленные растворы вносят клетки дрожжей, инкубируют их и определяют максимальную оптическую плотность 3-Н^--ТНТ для каждого разведения. Оптическую плотность 3-Н^--ТНТ измеряют на спектрофотометре, например, Lambda 35 (Perkin Elmer, USA) в диапазоне длин волн от 400 до 550 нм (нанометр). Затем строят калибровочный график для определения ТНТ и, пользуясь им, определяют концентрацию ТНТ в конкретной тестируемой среде.

Средой для поддержания дрожжевого штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3492, а также накопления биомассы дрожжей служит твердая среда Сабуро, содержащая глюкозу - 10,0 г/л, пептон - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, NaCl - 0,25 г/л, агар - 20,0 г/л, дистиллированную воду. В другом варианте для поддержания дрожжевого штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3492, а также накопления биомассы дрожжей применяют твердую синтетическую среду, содержащую глюкозу - 5,0 г/л, (NH₄)₂SO₄ - 1,0 г/л, MgSO₄ - 0,25 г/л, Na₂HPO₄ - 0,28 г/л, KH₂PO₄ - 1,91 г/л, агар - 20,0 г/л, дистиллированную воду.

Сущность предлагаемого способа поясняется примерами.

Пример 1. Определение ТНТ в водной среде суспензией дрожжевых клеток Y. lipolytica ВКПМ Y-3492.

Культивируют штамм дрожжевых клеток Y. lipolytica, например, на твердой среде Сабуро в пробирках при оптимальной температуре от плюс 24°C до +32°C в течение 18-24 ч. Затем готовят суспензию клеток дрожжей путем их (клеток) смыва с твердой среды Сабуро, например, 16 мМ К-Na-фосфатным буферным раствором (pH от 5,0 до 8,0). Суспензию хранят при оптимальных для клеток условиях и используют по мере надобности. При надобности полученную суспензию клеток вносят в анализируемую среду до конечной оптической плотности клеток A₆₀₀ 2,0-6,0 (среды с клетками); также вносят глюкозу в концентрации 1,0 г/л в качестве источника редуцирующих эквивалентов. Затем регистрируют развитие (происходящие изменения) окраски в анализируемой среде в течение 15-60 мин в зависимости от начальной оптической плотности клеток и исходной концентрации ТНТ. При этом повышение количества клеток дрожжей в анализируемом растворе ускоряет трансформацию ТНТ в 3-Н^--ТНТ и сокращает продолжительность анализа. При наличии в анализируемой среде ТНТ клетки дрожжей трансформируют его (ТНТ) в темно-красный моногидридный комплекс Мейзенхеймера (3-Н^--ТНТ), являющийся главным начальным метаболитом данного превращения. Оптическую плотность 3-Н^--ТНТ измеряют на спектрофотометре в диапазоне длин волн от 400 до 550 нм. Оптическая плотность развивающейся окраски раствора вследствие образования 3-Н^--ТНТ пропорциональна снижению концентрации ТНТ.

Предлагаемый способ детекции ТНТ позволяет с высокой достоверностью количественно определить ТНТ в диапазоне концентраций от 1 мг/л до 100 мг/л в водной среде.

Детекцию ТНТ с помощью клеток Y. lipolytica проводят в различных средах, например: K-Na-фосфатном буферном растворе, физиологическом растворе, водопроводной воде, речной воде, морской воде, с широким диапазоном рН от 4,5 до 8,0, при температуре от +10°C до +33°C. При этом оптимальным является диапазон температур от +24 до +30°C. В связи с тем, что штамм дрожжей Y. lipolytica активен в широком диапазоне рН и температур, а также адаптирован к средам с повышенной соленостью, он имеет преимущества (по сравнению с прототипом) для детекции ТНТ в различных средах, что расширяет область применения предлагаемого биосенсора.

Хранение штамма дрожжей в пробирках с твердой средой Сабуро, залитой слоем вазелинового масла, позволяет поддерживать жизнеспособность штамма более одного года при температуре от +4°С до +24°C.

Пример 2. Определение ТНТ в водном растворе с использованием сухой биомассы дрожжевых клеток Y. lipolytica ВКПМ Y-3492.

Биомассу дрожжей Y. lipolytica получают путем культивирования в жидкой среде Сабуро в колбах Эрленмейера на 250 мл при температуре от +24°C до +30°C в течение 24 ч. Затем клетки осаждают центрифугированием, например, при 8000g в течение 5 мин, удаляют надосадочную жидкость и высушивают биомассу при комнатной температуре в течение суток.

Для детекции ТНТ сухую биомассу дрожжей в оптимальном количестве, например не менее 10 мг, вносят в анализируемую водную среду объемом не менее 2 мл; затем туда же вносят глюкозу в концентрации 1,0 г/л. Затем регистрируют развитие (происходящие изменения) окраски среды. При наличии ТНТ в водном образце развивается окраска вследствие формирования 3-Н^--ТНТ из ТНТ. Оптическую плотность 3-Н^--ТНТ измеряют с использованием спектрофотометра в диапазоне длин волн от 400 до 550 нм аналогично Примеру 1.

Пример 3. Определение ТНТ в водном растворе с использованием иммобилизованных дрожжевых клеток Y. lipolytica ВКПМ Y-3492.

В качестве носителя (матрицы) для иммобилизации дрожжевых клеток используют, например, фильтровальную бумагу (Whatman); иммобилизацию клеток осуществляют путем адсорбции клеток на матрицу. Сначала готовят суспензию клеток, как описано в Примере 1. Затем 2-10 мкл суспензии клеток Y. lipolytica наносят на фильтровальную бумагу размером (5-15) мм × (5-15) мм и высушивают на воздухе в течение 15-30 мин.

Детекцию ТНТ с помощью биосенсора осуществляют путем внесения носителя с иммобилизованными клетками дрожжей и глюкозы (1,0 г/л) в анализируемый водный образец, который оставляют до максимального развития окраски, и определяют максимум образования 3-Н^--ТНТ. Для этого водный образец с развивающейся окраской периодически анализируют на спектрофотометре в диапазоне длин волн от 400 до 550 нм аналогично Примеру 1.

Пример 4. Определение ТНТ в водном растворе с использованием иммобилизованных дрожжевых клеток Y. lipolytica ВКПМ Y-3492,

В качестве матрицы для иммобилизации дрожжевых клеток используют, например, ткань из стекловолокна (стеклоткань); иммобилизацию клеток осуществляют путем адсорбции клеток на матрицу. Готовят суспензию клеток, как описано в Примере 1. Затем 2-10 мкл суспензии клеток Y. lipolytica наносят на кусок стеклоткани размером 5-15 мм × 5-15 мм и высушивают на воздухе в течение 15-30 мин.

Детекцию ТНТ с помощью биосенсора осуществляют путем внесения носителя с иммобилизованными клетками дрожжей и глюкозы (1,0 г/л) в анализируемый водный образец, который оставляют до максимального развития окраски, и определяют максимум образования 3-Н^--ТНТ. Для этого водный образец с развивающейся окраской периодически анализируют на спектрофотометре в диапазоне длин волн от 400 до 550 нм аналогично Примеру 1.

Приведенные примеры показывают различные пути осуществления заявляемого способа для качественного и количественного определения 2,4,6-тринитротолуола в различных средах.

При этом заявляемый биосенсор обладает существенными преимуществами по сравнению с прототипом. Так, отсутствует необходимость постоянно поддерживать клетки штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 в определенной фазе роста путем их (клеток) серийных переносов в свежую питательную среду. Это существенно сокращает время и упрощает процедуру определения ТНТ, повышает производительность труда. К тому же предлагаемый способ детекции ТНТ (по сравнению с прототипом) позволяет определять ТНТ в существенно более широком диапазоне концентраций без использования разведений (от 1 мг/л до 100 мг/л), в широком диапазоне pH (от 4,5 до 8,0) и температур (от +10°C до +33°C).

Другим преимуществом предлагаемого биосенсора и способа детекции ТНТ является возможность выявления загрязнения ТНТ без применения аналитического оборудования путем визуального наблюдения за изменением цвета водного образца. Это позволяет применять биосенсор для оперативного анализа водных образцов на месте (за пределами лаборатории), при участии персонала невысокой квалификации, без использования сложного в эксплуатации аналитического оборудования, например хроматографа. Преимущества заявляемого биосенсора упрощают контроль за технологическим процессом очистки ТНТ-загрязненных объектов, сточных вод, позволяют оперативно выявлять токсичные ксенобиотики в окружающей среде, повышают производительность труда персонала, занятого аналитической работой, расширяют область применения биосенсоров в природоохранной деятельности.

Приведенные примеры применения предлагаемого изобретения показывает его полезность для природоохранной деятельности. Применение биосенсора способствует раннему обнаружению токсичного ТНТ в окружающей среде и своевременному принятию мер безопасности.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружены сенсоры, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленный биосенсор имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве аналитического оборудования, в деятельности организаций экологического мониторинга, здравоохранения, используя известные стандартные технические устройства и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

Использованные источники

1. French С.Е., S. Nicklin, N.С. Bruce. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetranitrate reductase // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - V.64. - P.2864-2868.

2. Shriver-Lake L.С., В.L. Conner, F.S. Ligler. On-site detection of TNT with a portable fiber optic biosensor // Environ. Sci. Technol. - 1997. - V.31. - P.837-841.

3. Wang F., W. Wang, B. Liu, Zh. Wang, Zh. Zhang. Copolypeptide-doped polyaniline nanofibers for electrochemical detection of ultratrace trinitrotoluene // Talanta. - 2009. - V.79. - P.376-382.

4. Altamirano M., L. Garcia-Villada, M. Agrelo, L. Sanchez-Martin, L. Martin-Otero, A. Flores-Moya, M. Rico, V. Lopez-Rodas, E. Costas. A novel approach to improve specificity of algal biosensors using wild-type and resistant mutants: an application to detect TNT // Biosens. Bioelectron. - 2004. - V.19. - P.1319-1323.

Изобретение относится к области биохимии. Предложено применение штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 в качестве биосенсора для определения 2,4,6-тринитротолуола в различных средах. Для выявления 2,4,6-тринитротолуола в различных средах используют свободные или иммобилизованные клетки дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492. Применение штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 позволяет определять 2,4,6-тринитротолуол в широком диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мг/л без использования разведений, в широком диапазоне рН от 4,5 до 8,0 и температур от +10°С до +33°С.

Применение штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 в качестве биосенсора для определения 2,4,6-тринитротолуола в различных средах.