СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ЧЕРЕЗ СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ НА СРЕДЕ АИ ДЛЯ ПЛАНТАЦИОННОГО ЛЕСОВЫРАЩИВАНИЯ Российский патент 2012 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к лесному хозяйству, а именно к созданию сортового плантационного лесовыращивания на основе современных инновационных биотехнологий. Цель исследования - разработка способа микроклонального размножения лиственницы сибирской в культуре in vitro. Практическое применение изобретения выражается в создании лесосоменных плантаций лиственницы сибирской, устойчивых к патогенам, отличающихся быстрым ростом и высокой урожайностью.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ микроклонального размножения путем соматического эмбриогенеза ряда видов хвойных, широко используемого за рубежом при реализации программы MVF (Multi Variety Forest) [1]. Эта программа включает массовое размножение улучшенных, генетически паспортизированных хвойных видов через соматический эмбриогенез.

Соматический эмбриогенез имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами клонального размножения - прививками и черенками. Прививки являются дорогостоящими и имеют слабую приживаемость, а микрочеренкование связано с проблемой укоренения, которое у хвойных видов практически отсутствует. Микроклональное размножение через соматический эмбриогенез позволит получить массовое образование de novo растений регенерантов с хорошо развитым стеблем и корнем. Этот эффективный метод регенерации растений позволяет сохранять генетические ресурсы на протяжении длительного периода времени благодаря высокой продуктивности пролиферирующей эмбриональной массы и ее способности подвергаться длительной криоконсервации. С помощью соматического эмбриогенеза можно производить массовое тиражирование высокопродуктивных, устойчивых к патогенам чистых линий и гибридов растений для создания лесосеменных плантаций.

Однако, несмотря на активные исследования зарубежных ученых по соматическому эмбриогенезу, регенерация растений в культуре in vitro этим способом размножения все еще остается проблематичной для большинства видов хвойных. Критическим моментом технологии является слабая отзвывчивость генотипов на выращивание их в культуре in vitro и применение среды, обеспечивающей образование и прорастание соматических зародышей.

Для российский видов хвойных способ получения соматических зародышей до сих пор остается неразработанным, и прежде всего для лиственниц - основных лесообразователей Европы и Сибири. Среды, MS MSG [2-5], применяемые зарубежными учеными для реализации соматического эмбриогенеза у трех видов лиственницы и их гибридов: лиственницы европейской, лиственницы японской и лиственницы западной для лиственницы сибирской не подходят. На средах MS и MSG у лиственницы сибирской идет образование морфогенного каллуса, соматические зародыши иногда образуются, но не вызревают [6].

Эта проблема соматического эмбриогенеза у лиственницы сибирской решается техническим результатом настоящего изобретения. Впервые в мире был разработан способ микроклонального размножения лиственницы сибирской в культуре in vitro через соматический эмбриогенез на вновь созданной базовой питательной среде АИ, не имеющей себе аналога ни в России, ни за рубежом, с применением вновь разработанной уникальной новой технологии соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей лиственницы сибирской, устойчивой к лиственничной почковой галлице, а также со строгим учетом сроков взятия образцов.

Осуществление изобретения

Производят отбор деревьев лиственницы сибирской с высокой регенерационной способностью, у непораженных (устойчивых) к лиственничной почковой галлице. Отобранные деревья подвергаются контролируемому опылению для получения чистых линий. Строго учитываются сроки взятия образцов - семена собирают в предсемядольной стадии развития зародыша. Семена поверхностно стерилизуют 5% раствором KJ в течение трех минут, промывают в дистиллированой воде (три раза), мегагаметофиты обрабатывают перекисью водорода, помещают на увлажненную фильтровальную бумагу и переносят на питательную среду АИ.

Питательная базовая среда АИ готовится заранее.

Состав питательных сред, используемых в экспериментах по культуре in vitro у лиственницы

Компоненты среды Концентрация элемента в среде, мг/л Макроэлементы: MS АИ MSG NH₄NO₃ 1650 - - KNO₃ 1900 1060 100 CaCl₂×2H₂O 440 - 440 MgSO₄×7H₂O 370 570 370 КН₂РO₄ 170 150 170 (NH₄)₂SO₄ - 450 - КСl - - 740 CaCl₂ - 158 - Микроэлементы: Kl 0,83 1,2 0,83 Н₃ВО₃ 0,62 8,69 0,62 MnSO₄×4H₂O 22,3 - 22,3 ZnSO₄×7H₂O 8,6 13,05 8,6 Na₂MoO₄×2H₂O 0,25 0,375 0,25 CuSO₄×6H₂O 0,025 0,160 0,025 CoCb×6H₂O 0,025 0,0515 0,025 MnSO₄×H₂O - 13,60 - Железо: FeSO₄×7H₂O 27,8 27,8 27,8 Na₂×ЭДТА 37,3 37,3 37,3 Витамины и органические вещества: Мезоинозит 100 1000 100 Тиамин 0,1 1 0,1 Глицин 2,0 - - Пиридоксин 0,5 0,5 0,5 Никотиновая кислота 0,5 0,5 0,5 Глутамин 500 500 500 Гидролизат казеин 1000 1000 1000 Аскорбиновая кислота - 400 - рН 5,8 5.8 5,8

ТЕХНОЛОГИЯ СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА ИЗ ЗИГОТИЧЕСКИХ ЗАРОДЫШЕЙ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ

Технологию соматического эмбриогенеза осуществляют на основе заявленной среды АИ.

Первый этап - инициация эмбриогенного каллуса

Экспланты помещают на питательную среду АИ, дополненную мезоинозитом - 1 г/л, 2,4-Д - 2 мг/л, 6-БАП - 1,0 мг/л, сахарозой - 30 г/л, агаром - 7 г/л. Экспланты выдерживают в темноте, при Т=25°С, продолжительность культивирования 4-6 недель.

Второй этап - пролиферация эмбриогенного каллуса

Образовавшиеся каллусы переносят на базовую питательную среду АИ, дополненную мезоинозитом - 1 г /л, 2.4-Д - 2 мг/л, 6-БАП - 0,5 мг/л, сахарозой - 20 г/л. Уменьшают содержание гидролизата казеина до 500 мг/л. Gellan gum составляет 4 г/л. Каллусы выдерживают в темноте, при Т=25°С,продолжительность культивирования 2 мес.-2 года; пересадка каждые 14 дней.

Третий этап - предвызревание соматических звродышей

Эмбриогенные каллусы помещают в жидкую питательную среду АИ, дополненную, мезоинозитом -1 г /л, сахарозой - 30 г/л. Образовавшиеся каллусы подвергают встряхиванию на круговой качалке в течение 3-6 дней при низкой световой интенсивности (20 mmol m-2 s-1), при Т=25°С.

Четвертый этап - созревание соматических зародышей

Эмбриогенный каллусы с соматическими зародышами переносят на базовую питательную среду АИ, дополненную мезоинозитом - 1 г /л, АБК-32 мг/л, ИМК - 0,2 мг/л, сахарозой - 40 г/л, Gellan gum - 4 г/л. Образцы выдерживают в темноте, при Т=25°С, 4 недели. Регуляторы роста стерилизуют фильтрованием и добавляют в питательую среду.

Пятый этап - прорастание соматических зародышей

Прорастание соматических зародышей лиственницы сибирской проводят на базовой питательной среде АИ, в которой в 2 раза было снижена концентрация микромакроэлементов и железа, а также исключены источники органического азота и витаминов. Gellan gum составляет 4 г/л. Прорастание идет при низкой световой интенсивности (20 mmol m -2 з-1)при Т=25°С в течение 5-6 недель до появления эпикотиля.

Шестой этап - рост растений регенерантов лиственницы сибирской в почве

Соматические зародыши длиной 1.5 мм помещают в экопочву:

песок/торф)/вермикулит: 1/1/1+0,1% р-р N:P:K=20/20/20.

Седьмой этап - рост регенерантов лиственницы сибирской в условиях теплицы

Технический результат изобретения обеспечивают масштабированием процесса получения соматических зародышей, что выражается в создании длительно пролиферирующей эмбриональной массы (3 года и более), способной подвергаться криоконсервации. Вес эмбриональной массы (ЭМ) от одного экспланта на пролиферационной среде АИ в течение одного месяца составит 22,7+0.62 г. Число соматических зародышей в 100 мг ЭМ колеблется от 210 до 390 штук (в среднем 300). За год эта масса составит 2270 г. Следовательно, за год можно получить 681000 штук соматических зародышей, за два года число зародышей удвоится. За три года утроится и т.д. Полученные соматические сеянцы отличаются быстрым ростом; они в 3 раза превышают размеры обычных сеянцев. За период вегетации (три месяца) соматические сеянцы дают 2-3 прироста: высота их составляет 14.1±0.7 см против 2 см (контроль).

Источники информации

1. Park Y-S. Implementation in conifers somatic embryogenesis in clonal forestry: technical requirement and development considerations // Ann. For. Sci. - 2002. - V.59. - P.651-656.

2. Lelu M., Bastien.C., Kilmaszewska К, Ward C., Charest J.. An improved method for somatic plantlet production in hybrid larch (Larix × leptoeuropaea). Part 1 Somatic embryo maturation//Plant CellTissue and Organ Culture. - 1994. - Vol.36. - P.107-115.

3. Lelu M., Bastien C., Kilmaszewska K., Ward C., Charest.L.Plantlet production in hybrid larch (Larix × leptoeuropaea). Part 2 Control of germination and plantlet development //Plant Cell,Tissue and Organ Culture. - 1994. - Vol.36. - P-117-127'.

4. Becwar M., Nagmani R., Wann.S. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda) // Can..1. For. Res. - 1990. - V.20. - P.810-817.

5. Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V.15. - №4. - P.473-497.

6. Белоруссова А.С., Третьякова И.Н. Особенности формирования соматических зародышей у лиственницы сибирской Larix sibirica Ledeb), Эмбриологические аспекты - 2008. - Том.39. №2. - С.1-10.

Готовят базовую среду АИ, включающую микро- и макроэлементы, витамины, источники железа, органические вещества в заданном количественном содержании компонентов в соответствующей модификации состава среды по MSG. В полученную среду вводят экспланты зародышей семян, отобранных на стадии созревания семядолей с деревьев лиственницы сибирской, устойчивых к лиственничной почковой галлице. Способ на этапах соматического эмбриогенеза предусматривает дополнительное включение в базовую среду АИ следующих компонентов. На этапе инициации - мезоинозит - 1 г/л, 2,4Д - 2 мг/л, 6-БАП - 1 мг/мл, сахарозу - 30 г/л, агар - 7 г/л; на этапе пролиферации - мезоинозит - 1 г/л, 2,4Д - 2 мг/л, 6-БАП - 0,5 мг/мл, сахарозу - 20 г/л, Gellan gum - 4 г/л, а содержание гидролизата казеина уменьшают до 500 мг/л; на этапе предвызревания - мезоинозит - 1 г/л, сахарозу - 30 г/л; на этапе созревания - мезоинозит - 1 г/л, АБК - 32 мг/л, ИМК - 0,2 мг/л, сахарозу - 40 г/л, Gellan gum - 4 г/л; на этапе прорастания - Gellan gum - 4 г/л, а концентрацию макро-, и микроэлементов снижают в 2 раза и исключают источники органического азота и витаминов. Способом выращены соматические растения регенеранты лиственницы сибирской, устойчивые к лиственничной почковой галлице, из которых создают здоровые лиственничные леса, отличающиеся быстрым ростом и высокой урожайностью.

Способ микроклонального размножения лиственницы сибирской в культуре in vitro через соматический эмбриогенез для плантационного лесовыращивания, характеризующийся тем, что готовят базовую среду АИ, включающую растворы макроэлементов: KNO₃ - 1060 мг/л, MgSO₄·7Н₂O - 570 мг/л, КН₂РO₄ - 150 мг/л, (NH₄)₂SO₄ - 450 мг/л, СаCl₁₂ - 158 мг/л, микроэлементов: KJ - 1,2 мг/л, Н₃ВO₃ - 8,69 мг/л, ZnSO₄·7H₂O - 13,05 мг/л, Na₂MoO₄·2Н₂O - 0,375 мг/л, CuSO₄·6Н₂O - 0,160 мг/л, СоCl₂·6Н₂O - 0,0515 мг/л, MnSO₄·Н₂O - 13,6 мг/л, железа: FeSO₄·7Н₂O - 27,8 мг/л, Na₂ ЭДTA - 37,3 мг/л, витаминов и органических кислот: мезоинозит - 1000 мг/л, тиамин - 1 мг/л, пиридоксин - 0,5 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, глутамин - 500 мг/л, гидролизат казеина - 1000 мг/л, аскорбиновая кислота - 400 мг/л, далее в среду АИ вводят экспланты зародышей семян, собранных на стадии созревания семядолей с деревьев лиственницы сибирской с высоким репродуктивным потенциалом и устойчивых к лиственничной почковой галлице, предварительно простерилизованные 5%-ным спиртовым раствором йода и перекисью водорода, выдерживают их в данной среде при постоянной температуре 25°С, в темноте продолжительностью: на этапе инициации от 4 до 6 недель, на этапе пролиферации от 2 месяцев до 2 лет с пересадкой каждые 2 недели, на этапе созревания - 4 недели; при фотопериоде 8/16 ч при низкой световой интенсивности 20 mmol m-2 s-1 продолжительностью: на этапе предвызревания от 3 до 6 дней, на этапе прорастания от 5 до 6 недель, дополнительно включая в базовую среду АИ на каждом этапе следующие компоненты: на этапе инициации - мезоинозит - 1 г/л, 2,4Д - 2 мг/л, 6-БАП - 1 мг/мл, сахарозу - 30 г/л, агар - 7 г/л; на этапе пролиферации - мезоинозит - 1 г/л, 2,4Д - 2 мг/л, 6-БАП - 0,5 мг/л, сахарозу - 20 г/л, Gellan gum - 4 г/л, а содержание гидролизата казеина уменьшают до 500 мг/л; на этапе предвызревания - мезоинозит - 1 г/л, сахарозу - 30 г/л, на этапе созревания - мезоинозит - 1 г/л, АБК - 32 мг/л, ИМК - 0,2 мг/л, сахарозу - 40 г/л, Gellan gum - 4 г/л; на этапе прорастания - Gellan gum - 4 г/л, а концентрацию макро-, микроэлементов снижают в 2 раза и исключают источники органического азота и витаминов.