Способ получения регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию изолированных тканей растений, и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения уже известных сортов растений.

Одним из лимитирующих факторов выращивания изолированных тканей и клеток подсолнечника является низкая регенерация растений.

Известны способы получения расте- ний-регенерантов подсолнечника путем прямого и непрямого соматического эмбриогенеза, основанные на подборе типа эксплантата и оптимального состава среды. Было показано влияние гормонов 6-бензи- ламинопурина (БАП) и 2,4-дихлорфенокси- уксусной кислоты (2,4-Д) на ряд эксплантатов синтетического сорта Sannace, а именно на листья, участки котиледонов, апексы побегов, сегменты гипо- котиля. Оказалось, что среда (MS) Murashige and Skoog в сочетании с 2,4-Д и БАП и MS с 2,4-Д не вызывает образования побегов из каллуса ни для одного эксплантата, на среде MS с добавкой 1 мг/л БАП наблюдали регенерацию из глобулярного каллуса, полученного при культивировании

VI

чэ О

ел ю

сегментов гипокотиля. Недостаток этого метода в том, что он касается только одного редкого генотипа.

Известен прямой соматический эмбриогенез и регенерация растений из незрелых зародышей на среде с повышенным содержанием сахарозы. Через шесть дней начала культивирования показано образование белых соматических зародышей непосредственно из котиледона зиготических, без образования каллуса. Незрелые зародыши на 7-14-й день после опыления помещали на среды, содержащие MS соли; витамины среды Gamborgs (Bs); различные концентрации сахарозы (3%, 6%, 12%); в качестве добавок - 2,4-Д, дикамба, пиклорам, долил-3-уксусная кислота (ИУК), и а-наф- тил-уксусная кислота (НУК). Показано, что образование соматических зародышей не происходило на средах с 3% сахарозы и использованием в качестве добавок ИУК или НУК. Оптимальными являлись среды с 6 и 12% сахарозы в сочетании с 1 мг/л 2,4-Д или 3,3 мг/л дикамба. При помещении на данные оптимальные среды зрелых зароды.- шей или тканей асептических проростков (листьев, апексов, гипокотилей) прямого соматического эмбриогенеза не наблюдалось, Недостатки этого способа в том, что он применим только к определенному типу экс- плантатов, а именно к незрелым зародышам на 7-14 день после опыления (следовательно, малым гибкость), кроме того, степень регенерации полученных всходов остается еще не очень достаточной.

Из известных способов наиболее близким по своей сущности является способ регенерации подсолнечника, применимый к восьми сортам подсолнечника, описываю- щий регенерацию из незрелых зародышей на 4-21-й день после опыления. Культивирование по известному способу осуществляется в три этапа. Первый этап - образования эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирующей среде, содержащей соли и витамины MS, аминокислоты, 9% сахарозы, гормон цитокининового типа БАП в концентрации 0,5-1 мг/л. Второй этап - культивирование эмбриогенных каллусов для их роста, развития и прорастания в среде, содержащей соли и витамины MS, аминокислоты, 3% сахарозы, 0,1-0,5 мг/л БАП. Третий этап состоит в перенесении проростков для их роста и развития на среду, содержащую соли и витамины Bs, 1% сахарозы, гормон ауксинового типа - ИУК в концентрации 0,1-0,2 мг/л.

Недостатки этого способа состоят в необходимости осуществления изменений сред между первым, вторым и третьим этапами, что ведет к большей вероятности инфицирования, а также невысокой частоте регенерации.

Целью изобретения является повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза.

Способ предусматривает культивирование эксплантата подсолнечника в питательной индуцирующей среде, содержащей гормоны для инициации эмбриогенных каллусов и дальнейшее культивирование эмбриогенных каллусов для их роста, развития и прорастания, позволяющее получить рас- тения-регенеранты.

Использование способа приводит к множественному образованию побегов из одного зародыша путем непрямого соматического эмбриогенеза.

Способ осуществляется следующим образом.

Используют восемь генотипов подсолнечника: сорта Передовик, Надежный, Енисей, Ультраскороспелый, Ржаксинский; инбредную линию 36-29; две гибридные линии М 1 65/1 А х НА 234 А х К 3064.

В качестве эксплантата для индукции каллуса используют незрелые зародыши на 9-21-й день после опыления. Изолированные в асептических условиях незрелые зародыши помещают на питательную среду MSc3% сахарозы, дополненную5 г/л КМОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП и 5 мг/л НУК с дальнейшим получением морфогенетического каллуса. Каллусную ткань выращивают в термостате при t 26-28° С, далее при фотопериоде 16 ч день - 8 ч ночь при t 26-28° С с перенесением каждые 25-30 дней на свежую питательную среду. Затем после роста каллусной ткани отделенные побеги переносят на среду для корнеобразования, содержащую соли Вб, 0,5% сахарозы, 2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина HCI.

П р и м е р 1. Растения подсолнечника сорта Ржаксинский выращивают в теплице в сосудах с почвой. В момент цветения каждое растение отмечают этикеткой с указанием даты цветения. На 9-21-й день после опыления семянки стерилизуют путем погружения на 1 мин в 50%-ный этанол, далее на 10 мин в 9%-ный раствор продажного хлорамина Б, затем промывают трижды стерильной дистиллированной водой. Изолированные в асептических условиях зародыши размером 0,1-0,8 см помещают на среду, содержащую соли и витамины MS,

3% сахарозы, 4 г/л КМОз, 90 мг/л инозито- ла, 400 мг/л казаминовых кислот, 0,4 мг/л БАП, 4 мг/л НУК. В течение первых 20 дней клеточные культуры выращивают в термостате при t 26-28° С, далее - при фОтопе- риоде 16 ч день - 8 ч ночь при t 26-28° С. Через 25-30 дней выросший каллус пересаживают на свежую питательную среду, одновременно отделяя образовавшиеся побеги и перенося их на среду для корнерб- разования, содержащую соли Bs, 0,5% сахарозы, 1 мг/л ИМК, 0,4 мг/л пиридоксин HCI. В каждом пассаже учитывают количество полученных растений-регенерантов и образовавшихся зон морфогенеза.

П р и м е р 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, различие состоит в составе питательных сред для индукции каллуса и корнеобразования. Питательная индуцирующая среда содержит соли и вита- мины MS, 3 % сахарозы, 5 г/л КМОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП, 5 мг/л НУК. Вторая среда содержит соли Bs, 0,5% сахарозы, 2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина HCI.

ПримерЗ. В среду для индукции каллуса, содержащую соли и витамины MS, 3% сахарозы, добавляют 6 г/л КМОз, 1tO мг/л инозитола, 600 мг/л казаминовых кислот, 0,6 мг/л БАП и 6 мг/л НУК. Среду для корнеобразования, содержащую соли Bs, 0,5 % сахарозы дополняют Змг/л ИМК и 0,6 мг/л пиридоксин НС.. Остальные приемы осуществляют аналогично примеру 1.

П р и м е р 4. Незрелые зародыши сорта Енисей, собранные на 9-21-й день после опыления, когда они достигают размеров 0,1-0,8 см. стерилизуют, изолируют в асептических условиях и далее процесс культивирования ведут по примеру 2.

Аналогично проводят испытания с другими генотипами подсолнечника.

Предлагаемый способ ускорил в 1,2 раза по сравнению с известным процесс обра- зования зон морфогенеза и зачатков побегов путем непрямого соматического эмбриогенеза. Через 12-14 дней наблюдали образование зон морфогенеза и зачатков побегов на индуцирующей питательной среде. Повысилась частота образования морфогенетических линий в 1,5 раза, увеличилось число множественных зон морфогенеза в 4-6 раз.

Предлагаемый способ позволит получить регенерацию подсолнечника путем непрямого соматического эмбриогенеза.

Формула изобретения Способ получения регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток, включающий эксплантацию незрелых зародышей на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, получение на ней морфогенетического каллуса, регенерацию побегов, перенос их на модифицированную питательную среду Гамборга Bs для корнеобразования и адаптацию полученных растений к условиям открытого грунта, отличаю щ и и с я тем, что , с целью повышения выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза, получение каллуса и регенерацию побегов осуществляют в один этап с добавлением в питательную среду 4000-6000 мг/л нитрата калия, 90-110 мг/л инозитола, 400-600 мг/л казаминовых кислот, 0,4-0,6 мг/л 6-бензи- ламинопурина, 4-6 мг/л а-нафтилуксусной кислоты и корнеобразование проводят в присутствии 1-3 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,4-0,6 мг/л пиридоксина HCI.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию изолированных тканей растений и может быть использовано в селекционной практике для создания новых и улучшения существующих сортов растений. Целью изобретения является повышение выхода растений-регене- рантов и количества зон морфогенеза. Способ предусматривает получение из незрелых зародышей растений регенерантов путем двухэтапного культивирования на модифицированных питательных средах Му- расиге-Скуга и Гамборга Bs. ы fe