СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ РАСПРОСТРАНЕННЫМИ ДЕРМАТОЗАМИ (ПСОРИАЗ, АТОПИЧЕСКИЙ ДЕРМАТИТ, АКАНТОЛИТИЧЕСКАЯ ПУЗЫРЧАТКА) К ПРОВОДИМОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 G01N33/50 G01N33/92 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может применяться для выявления резистентности больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, атопическим дерматитом, вульгарной или акантолитической пузырчаткой) к проводимой терапии.

Устойчивость к лекарственным средствам (лекарственная адаптация, фармакорезистентность - ФР, терапевтическая резистентность) является серьезной проблемой современной фармакологии. Все чаще исследователи отмечают развитие у больных «лекарственного патоморфоза», выражающегося в увеличении числа больных, первично резистентных к лекарствам или приобретших устойчивость в ходе лечения, изменения клинической картины и течения заболевания.

По нашим данным у дерматологических больных часто наблюдается снижение эффективности лекарственных воздействий при многолетних хронических процессах [Химкина Л.Н. с соавт., 2005]. Это приводит к уменьшению сроков ремиссии заболевания и необходимости либо повышения дозы препаратов, либо назначения новых, далеко не безопасных средств.

Основные механизмы развития ФР на сегодняшний день связывают с нарушениями на уровне систем биотрансформации и транспорта лекарственных средств. Причем, эти нарушения, естественно, более выражены в случаях тяжелых, длительно протекающих заболеваний, к которым можно отнести и ряд дерматозов. Участниками системы биотрансформации и транспорта являются специализированные белки. Это ферменты биотрансформации, осуществляющие реакции 1 и 2 фаз метаболизма ксенобиотиков; гликопротеин Р - транспортный белок, основными функциями которого являются препятствие к всасыванию ксенобиотиков и лекарственных средств (ЛС) в кишечнике, предотвращение их проникновения через гисто-гематический барьер и скорейшее выведение печенью и почками; транспортеры органических ионов. Кроме этого, ряд исследователей считает, что проблема ФР может быть связана с блокированием рецепторного аппарата клеток вследствие сорбции эндогенных токсинов в виде молекул средней массы (МСМ) [Сидельникова В.И., Лифшиц В.М. 1998] или нарушением проницаемости мембран вследствие изменения соотношения фосфолипидов или модификаций белковолипидных взаимодействий за счет переокисления белков и липидов, так называемой окислительной модификации белков (ОМБ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Дубинина Е.Е, 2006].

Чаще всего ЛС влияют на ферменты 1-й фазы биотрансформации - система цитохрома Р450, затем на активность глутатионтрансферазы (ГТФ) и, в меньшей степени, на функционирование гликопротеина - Р. При этом считается, что главными причинами межиндивидуальных различий фармакологического ответа являются генетические особенности пациента и совместно применяемые ЛС. В настоящее время достаточно хорошо изучен генетический полиморфизм изоферментов системы Р450, ГТФ и активно изучается генетическая детерминированность гликопротеина Р. Однако, не смотря на то что все шире внедряются методы фармакогенетического тестирования, для того, чтобы в повседневной клинической практике можно было выяснить предрасположенность больного к тому или иному виду ответа на ЛС, такие подходы не всегда возможны.

В качестве ближайшего аналога изобретения выбран способ определения концентрации фексофенадина - продукта утилизации одного из субстратов гликопротеина Р - дигоксина [Колхир П.В., 2007]. Определяемая при этом гликозидная интоксикация сопоставлялась авторами с выявлением определенного генотипа человека (ТТ). Чувствительность данного исследования составила 62%, специфичность - 84%. Прогностическая ценность (PPV) положительного результата в случае выявления генотипа ТТ составила 57%. Прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) в случае выявления других генотипов составила 87%.

Определение концентрации фексофенадина в плазме крови испытуемых

Концентрацию фексофенадина в плазме крови животных и пациентов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «Shimadzu» со спектрофотометрическим детектором (λ=220 нм). Состав подвижной фазы: кислота уксусная 0,03 М с содержанием триэтиламина 0,5%, подкисленная кислотой ортофосфорной до рН 4,0 и ацетонитрил в соотношении 68:32 по объему. Разделение проводили на колонке «µ-Bondapack Phenyl» 3,9×300 мм (10 мкм). Для экстракции фексофенадина из плазмы крови использовали смесь равных объемов дихлорметана, этилацетата и уксусноэтилового эфира. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по высоте пиков. В указанных условиях время выхода пика фексофенадина составляло 13 минут, предел обнаружения - 8,4 нг/мл.

Однако данный способ может быть осуществлен только при наличии в лаборатории комплекса для высокоэффективной газо-жидкостной хроматографии или поляризационного флуороиммуноанализа, что значительно усложняет определение резистентности.

Цель изобретения - повышение точности способа определения резистентности больных хроническими распространенными дерматозами (псориаз, атопический дерматит, акантолитическая пузырчатка) к проводимой терапии.

Поставленная цель достигается тем, что измеряют содержание молекул средней массы и карбонильных продуктов окислительной модификации белков и при значении их отношения <0,4 устанавливают отсутствие резистентности, при значении >0,4 - наличие резистентности к проводимой терапии.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного в процессе лечения утром натощак берут кровь из локтевой вены в количестве 3,0 мл в пробирку с гепарином и 5,0 мл в обычную пробирку. Для получения плазмы или сыворотки кровь центрифугируют в течение 15 мин при 1500 об/мин.

Определение содержания молекул средней массы проводят по методу М.Я.Малаховой (1995). Для этого к 1,0 мл плазмы крови (пробирка с гепарином) прибавляют 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы (МСМпл). Определение количества МСМпл осуществляется спектрофотометрически, путем измерения оптической плотности супернатанта, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:9 против контроля, содержащего вместо исследуемого образца физиологический раствор. Оптическая плотность измеряется в диапазоне длин волн от 238 до 298 нм с шагом в 4 нм. Количество МСМпл рассчитывается как сумма (ОП238………ОП298)×4 усл. ед.

Содержание карбонильных продуктов окислительной модификации белков определяют по методу Е.Е.Дубининой (1995). При этом в качестве реактивов используются:

1. Фосфатный буфер (рН 7,4)

2. 2 N НСl (приготовлен из фиксанала)

3. 0,01М 2,4динитрофенилгидразина (ДНФГ) в 2 N НСl

4. 1 N хлорная кислота

5. 8М мочевина

6. С2Н5OН и СНСO2С2Н5 в соотношении 1:1 (этанол:этилацетат)

К 0,05 мл сыворотки крови прибавляют 0,95 мл фосфатного буфера (рН 7,4). Общий объем пробы составляет 1 мл. В опытные пробы приливают 1 мл раствора 2,4 ДНФГ, в - контрольные 1 мл 2 N НСl. Для осаждения белков в каждую пробу вносят 1 мл 1 N HClO4. Содержимое пробирок перемешивают стеклянной палочкой. Пробы инкубируют при комнатной температуре в течение часа, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Далее осадок промывают, добавляя 3 мл смеси этилацетат-этанол (1:1), не перемешивая, и ценрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. При этом происходит экстракция липидов и 2,4ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивают (в течение ночи в холодильнике), а затем растворяют в 8М растворе мочевины (3 мл в пробу). Для лучшего растворения осадка в пробу добавляют 1 каплю 2 N НСl. Полученные в результате окислительной модификации белков карбонильные производные взаимодействуют с 2,4ДНФГ с образованием 2,4динитрофенилгидразонов. Оптическую плотность (ОП) 2,4динитрофенилгидразонов регистрируют на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 370 нм.

Уровень карбонильных производных окисленных белков выражают в условных единицах:

ОМБпл=ОП×100 усл.ед.

Далее рассчитывают коэффициент К=МСМпл/ОМБпл и при значении их отношения <0,4 устанавливают отсутствие резистентности, при значении >0,4 - наличие резистентности к проводимой терапии.

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Больная М-ва, 50 лет. И/б-ни №693. Госпитализирована в НИКВИ 31.03.10 с жалобами на высыпания на коже туловища и конечностей, болями в межфаланговых суставах кистей и стоп, коленных суставов; отечность, утренняя скованность. Давность заболевания 12 лет. Диагноз: распространенный псориаз, прогрессирующая стадия, инфильтративно-бляшечная форма. Псориатический полиартрит. Сопутствующие заболевания - гипертоническая болезнь II ст., сахарный диабет 2-го типа. Периоды клинической ремиссии 4-5 мес.

Проведено лечение: раствор тиосульфата натрия 30% - 7,0 в/в; метотрексат по схеме Вайнштейн-Фроста 2 цикла, раствор гептрала 400 мг внутривенно капельно №10; липоевая кислота 25 мг×3 р/день; найз 100 мг 2 р/день; аевит 1 драже в день 28 дней; электрофорез с гепарином на суставы. Выписана со значительным улучшением.

Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 9 мм/час; Le - 5,1×10 ³; Hb - 13,0 g/dl; C - 70, Э - 2,М - 2,Л - 26.

Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.

В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 23,12 усл.ед., и уровень ОМБпл, который составил 70 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,33. Несмотря на тяжелое клиническое состояние больной, сопровождающееся выраженной эндогенной интоксикацией организма по показателям МСМпл, олигопептидов и уровню 0МБ, в данном случае количество эффективного альбумина в норме, протеолитическая активность (по активности трипсина и α2-макроглобулина) в норме, активность фермента глутатион-трансферазы повышена, то есть активированы процессы биотрансформации эндотоксинов. Это свидетельствует о достаточной физиологической активности основных систем, отвечающих за усвоение ЛС и отсутствие резистентности.

Пример 2. Больная Б-ва, 62 лет. И/б-ни №376. Госпитализирована в НИКВИ 18.02.10 с жалобами на высыпания на коже, выраженный зуд. Давность заболевания 2 года. Причина заболевания - контакт с бытовой химией. Диагноз: атопический дерматит по типу нейродермита, распространенная форма.

Проведено лечение: раствор дипроспана 1,0 в/м №1; раствор преднизолона 30 мг в физиол. растворе в/м №7; преднизолон в таблетках 15 мг 10 дней; дифлюкан 150 мг 2 приема; каезал по 1 таб. в день 20 дней; аспаркам - 20 дней. Выписана со значительным улучшением.

Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 12 мм/час;

Le -4,1×10 ³; Hb - 12,0 g/dl; C - 70, Э - 2,М - 2,Л - 26.

Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.

В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 11,2 усл. ед., и уровень 0МБ пл., который составил 44 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,25. Данный показатель свидетельствует об отсутствии резистентности.

Пример 3. Больная Х-ва М.М., 38 лет. И/б-ни №868. Поступила в НИКВИ 26.04.10 с жалобами на высыпания на коже, шелушение, зуд. Больна в течение 24 лет. В последние 10 лет отмечается выраженная торпидность к проводимой терапии с короткими периодами клинической ремиссии (1-1,5 мес). Диагноз: распространенный псориаз, прогрессирующая стадия, экссудативная форма. Сопутствующие заболевания: хр. гастрит, холецистит, пиелонефрит.

Проведено лечение: раствор ремикейда 300 мг в физиологическом растворе в/в капельно №2. Выписана со значительным улучшением кожного и суставного процесса.

Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 10 мм/час;

Le - 7,9×10 ³; Hb - 13,7 g/dl; C - 61, Э - 1,М - 3,Л - 35.

Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.

В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 13,4 усл. ед., и уровень ОМБпл, который составил 30 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,44. Данный показатель отражает состояние резистентности к проводимой терапии, о чем свидетельствует частота повторных госпитализаций и наличие эндогенной интоксикации организма по показателям МСМпл и олигопептидов, модифицированного альбумина, дисбалансу протеолитической активности.

Пример 4. Больная В-ва, 48 лет. № И/б-ни 38. Госпитализирована в НИКВИ 12.01.09 с жалобами на высыпания на коже туловища, конечностей и кожи головы: выраженное шелушение, боли в межфаланговых суставах кистей, стоп, коленных, локтевых суставах, деформация и ограничение подвижности суставов. Пациентка не переносит метотрексат, реамберин, витамин В 12, реополиглюкин, эссенциале, все группы антибиотиков. Больна в течение 30 лет, причина не ясна. Диагноз: псориаз распространенный прогрессирующая стадия экссудативная форма, псориатический полиартрит хронического течения, активность - II, недостаточность функции - II. Непереносимость ЛС выяснялась по мере их назначения. Периоды клинической ремиссии кожных проявлений 1 - 2 мес, суставных - без ремиссии, только улучшение.

Проведено лечение: преднизолон 10 мг внутрь, аспаркам 3,0 в сутки, ортофен 25 мг в день; сандиммун неорал 175 мг/сутки; раствор тавегила 2,0 в/м. Выписана с улучшением.

Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 25 мм/час;

Le - 9,7×10 ³; Hb - 13,0 g/dl; С - 52 Э - 3,М - 4,Л - 42.

Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.

В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 15,54 усл. ед., и уровень ОМБпл, который составил 27 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,57. Как видно из описания клинической картины, больная страдает тяжелой формой псориаза и псориатического полиартрита с высокой резистентностью к различным ЛС, о чем свидетельствует и высокое значение полученного отношения.

Пример 5. Больная Г-ва Г.Г., 32 лет. И/б-ни №174. Госпитализирована в НИКВИ 21.01.09 с жалобами на высыпания на коже, шелушение, выраженный зуд. Давность заболевания 17 лет. Причина - психоэмоциональный стресс. Диагноз: распространенный псориаз прогрессирующая стадия экссудативная форма. Периоды клинической ремиссии 2-3 мес.

Проведено лечение: метотрексат по схеме Вайнштейн-Фроста 4 цикла; раствор глюконата кальция 10,0% - 7,0 в/м №10; раствор тиамина бромида 5,0% 1,0 в/м №10; раствор пиридоксина гидрохлорида 5,0% 1,0 в/м №10; раствор тавегила 2,0 в/м №10; аевит по 1 капсуле в день; фенкарол по 1 таб. х 2 раза в день 10 дней. Выписана со значительным улучшением.

Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 13 мм/час;

Le - 5,5×10 ³; Hb - 14,0 g/dl; C - 62, Э - 1,М - 2,Л - 35.

Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.

В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 16,63 усл. ед., и уровень ОМБпл, который составил 27 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,62. Данный показатель отражает высокую степень резистентности, о чем свидетельствует частота рецидивов заболевания. Очевидно это связано с наличием эндогенной интоксикации организма по показателям МСМпл и олигопептидов, ЦИК, модифицированного альбумина, дисбалансу протеолитической активности.

По результатам клинико-лабораторного анализа 32 больных с обычным течением заболевания и хорошим эффектом после проведенной комплексной терапии значения отношения МСМпл/ОМБпл были меньше 0,4 у 62,5% обследованных, больше 0,5 - у 37,5%. В группе больных с тяжелым, резистентным течением заболевания, состоящей из 36 больных, значения отношения были больше 0,4 у 70,0% и меньше 0,4 - 30,0%.

В выбранном аналоге частота выявления положительных результатов теста на выявление резистентности у больных с определенным генотипом составила 57%.

При статистической обработке данных было показано высокодостоверное распределение по группам больных: Хи-квадрат=5,730 с одной степенью свободы; р=0,017. Точный критерий Фишера: р=0,012.

Таким образом, предлагаемый способ определения резистентности обладает следующими преимуществами:

1. Повышает точность определения показателя на 13%.

2. Используются более доступные методы исследования и менее дорогостоящие оборудование и реактивы.

3. Оценка резистентности у конкретного больного может быть произведена в лечебном учреждении в режиме реального времени.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. - СПб: Мед. пресса, 2006. - 397 с.

2. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительные модификации белков сыворотки крови человека, метод ее определения. // Вопросы медицинской химии. - 1995. - №1. - С.24-26.

3. Колхир П.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина - Р для оптимизации фармакотерапии. // Автореф. дисс. канд.мед.наук. - Москва, 2007.

4. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации. // Эффер. терапия. - 1995.- №1. - С.38-40.

5. Сидельникова, В.И., Лифшиц В.М. Эндогенная интоксикация как одна из причин фармакорезистентности. Новые подходы лабораторной диагностики. // Клин. лаб. диагн. - 1998. - №8. - С.37.

6. Химкина Л.Н., Пантелеева Г.А., Копытова Т.В. Коррекция эндоинтоксикационного синдрома при дерматозах. // Эксп. и клиническая дерматокосметология. - 2005. - №6. - С.61-64.

Биохимические показатели сыворотки крови больных, представленных в виде клинических примеров Показатели Контроль Клинические примеры 1 2 3 4 5 Общий белок, г/л 65-85 93,0 93,2 81,5 87,4 75,6 Альбумин, % 55,6±0,64 51,12 51,6 52,2 48,3 53,85 α₁-глобулин, % 4,5±0,24 4,8 5,02 5,6 5,9 4,83 α₂-глобулин, % 9,0±0,32 12,2 9,8 10,5 14,2 14,2 β-глобулин, % 11,0±0,28 11,5 13,2 15,0 13,8 11,3 γ-глобулин% 19,6±0,42 20,4 20,5 16,6 17,8 15,8 Крупные ЦИК, усл.ед. 37,2±5,4 40 72 50,0 46,0 60 Мелкие ЦИК, усл.ед. 219,2±12,2 397 394 295,0 242,0 326 МСМпл, усл.ед. 10,03±0,25 23,2 11,2 13,4 15,5 16,6 Олигопептиды, мг/л 28,7±1,14 59,0 41 45,0 42,0 45,5 ОМБпл, усл.ед. 19,0±1,7 70,0 25,0 30,0 27,0 27,0 ДК, мкмоль/л 6,4±0,5 6,0 3,1 5,9 13,7 6,2 МДА, мкмоль/л 2,48±0,09 3,72 3,84 3,3 4,2 3,3 Модифицированный альбумин, % 5,75±0,26 5,43 10,5 7,9 2,7 7,02 Эффективный альбумин, г/л 44,7±0,86 44,9 33,65 39,2 41,1 37,8 Трипсин, нмоль/с.л. 10,8±1,24 15,4 12,2 31,2 40,1 42,3 α₂-макроглобулин, мкмоль/с.л. 0,56±0,026. 0,65 0,33 0,33 0,8 0,46 ГТФ, мкмоль/мин л 6,35±0,3 10,5 20,6 5,1 8,76 7,63 ЛСТ, мкмоль/мин л 6,2-18,5 16,0 4,0 7,3 2,0 2,8 АЛТ, мкмоль/мин л 3,7-25,9 19,4 3,6 5,3 5,8 1,0 Примечание:
ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы;
ДК - диеновые конъюгаты - первичные продукты перекисного окисления липидов;
МДА - вторичные продукты перекисного окисления липидов;
ГТФ - глютатионтрансфераза.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и касается способа определения резистентности больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, атопическим дерматитом, вульгарной или акантолитической пузырчаткой) к проводимой терапии. Сущность способа заключается в том, что измеряют содержание молекул средней массы и карбонильных продуктов окислительной модификации белков. При значении их отношения <0,4 устанавливают отсутствие резистентности, при значении >0,4 - наличие резистентности к проводимой терапии. Использование способа позволяет с высокой точностью определить резистентности больных распространенными хроническими дерматозами к проводимой терапии. 1 табл., 5 пр.

Способ определения резистентности больных хроническими распространенными дерматозами (псориаз, атопический дерматит, акантолитическая пузырчатка) к проводимой терапии путем определения концентрации веществ в плазме крови, отличающийся тем, что измеряют содержание молекул средней массы и карбонильных продуктов окислительной модификации белков и при значении их отношения <0,4 устанавливают отсутствие резистентности, при значении >0,4 - наличие резистентности к проводимой терапии.