N,N'-(СУЛЬФОНИЛДИ-1,4-ФЕНИЛЕН)БИС(N'',N''- ДИМЕТИЛФОРМАМИДИН)1,2,3,4-ТЕТРАГИДРО-6-МЕТИЛ-2,4- ДИОКСО-5-ПИРИМИДИНСУЛЬФОНАТ, СТИМУЛИРУЮЩИЙ КЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ И ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОТРОПНОЙ И АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1999 года по МПК C07D239/60 A61K31/505 

Изобретение относится к новому биологическому активному химическому соединению - 1,2,3,4-тетрагидро-6-метил-2,4-диоксо-5- пиримидинсульфонату N, N'-(сульфонилди-1,4-фенилен)-бис-(N'', N''- диметилформамидина, относящемуся к группе сульфонопиримидинов, среди которых известны лекарственные препараты, такие как диуцифон и димоцифон (см. М.А.Машковский. Лекарственные средства. Москва: Медицина, 1988 г, ч. 11, с. 387; Н.М.Голощапов и др. Изобретательство и рационализаторство в медицине. Республиканский вестник научных трудов. Москва, 1979 г, с. 129 - 130; Н.М.Голощапов и др. Применение препарата Димоцифон в терапии больных лепрой, аллергодерматозами и герпетиформным дерматитом Дюринга. Методические рекомендации. Москва, 1978 г).

Предлагаемые согласно изобретению соединения соответствуют формуле I

и проявляют стимулирующее клеточный метаболизм (обмен клетки) действие, а также высокую иммунотропную и антимикобактериальную активность.

Известные структурные аналоги - диуцифон-гидрат и диуцифон (см. авторское свидетельство СССР N 322325) обладают противолепрозной активностью (см. авторское свидетельство СССР N 459228).

Однако противотуберкулезная активность у них отсутствует. Кроме того, указанные вещества плохо или совсем не растворяются в воде, а это снижает их биологическую доступность и, следовательно, биологическую активность. В связи с этим лечебные дозы этих лекарственных препаратов должны быть достаточно высокими. Плохая растворимость и низкая биологическая доступность диуцифонов не позволяет им протекать через клеточную мембрану, где, как правило, расположены возбудители микобактериозов, и участвовать в их жизнедеятельности.

Целью изобретения является получение вещества, легко растворимого в воде и не имеющего поэтому вышеперечисленных недостатков.

Полученная цель достигается соединением формулы I, которое легко растворяется в горячей воде и 0,25 - 0,5% растворе новокаина и способно влиять на функцию клетки, увеличивая в ней содержание ДНК, РНК и белка; имеет более выраженную противолепрозную и иммунотропную активность, а также активно в отношении микобактерий лепры, туберкулеза и атипичных микобактерий, что подтверждается частичным бактерицидным действием по отношению к микобактериям туберкулеза в концентрации 4 мг/мл и 128 мкг/мл по отношению к М.lufu, атипичным микобактериям.

Преимущества заявляемого объекта в сравнении с диуцифоном иллюстрирует таблица 1 (табл. 1 - 12 см. в конце описания).

Из таблицы следует, что заявляемый объект обладает преимуществами по сравнению с диуцифоном: он менее токсичен, активен в отношении микобактерий лепры, туберкулеза и условно патогенных атипичных микобактерий, обладает высоким иммунотропным действием на микроорганизмы (индекс стимуляции в 3 раза выше, чем у диуцифона). Кроме того, он принимает участие в обмене клетки, стимулирует ее функцию в 1,5 - 2 раза лучше, чем диуцифон. Последний вывод можно сделать на основании увеличения веса органа, так как известно, что его гипертрофия способствует усилению функции. Учитывая высокое действие на микобактерии лепры, туберкулеза и других возбудителей, расположенных внутриклеточно, а также успешные клинические испытания на носителях ВИЧ-инфекции (см. прилагаемый отчет), можно допустить участие предлагаемого вещества в обмене веществ различных возбудителей, находящихся внутри клетки и малодоступных воздействию других препаратов, проникновению которых внутрь клетки препятствует оболочка клетки.

Соединение I получают нагреванием эквимолекулярных количеств диаминодифенилсульфона и 6-метил-5-урацилсульфохлорида в диметилформамиде. В этих условиях не образуется, как можно было бы ожидать, сульфонамидное производное ДДС, а в первую очередь идет взаимодействие диаминодифенилсульфона с диметилформамидом [Can J.Chem., 1965, v. 43, N 9, p. 2640, патент США 3133078] . Образовавшийся диметилформамидин далее образует соль с 6-метилурацил-5-сульфокислотой.

Токсичность соединения I была определена на белых беспородных мышах весом 18 - 20 г в остром опыте по методу Литчфилда-Уилкоксона.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. N,N'-(Сульфонилди-1,4-фенилен)-бис-(N'',N''- диметилформамидин)- 1,2,3,4-тетрагидро-6-метил-2,4-диоксо-5- пиримидинсульфонат.

В колбу, содержащую 24,8 г (0,1 моль) 4,4'- диаминодифенилсульфона в 300 мл сухого диметилформамида, при перемешивании и при температуре 25 - 30^oC присыпают 47,3 г (0,2 моль) 6-метилурацил-5-сульфохлорида. Перемешивают 1 час при температуре 50 - 53^oC, охлаждают и отфильтровывают выпавший осадок. Сырой продукт 2 часа перемешивают при комнатной температуре в 200 мл хлороформа, фильтруют на воздухе. Порошок желтого цвета кипятят час в 250 мл спирта, фильтруют горячим, на фильтре промывают 20 мл спирта. Сушат на воздухе. Аморфный порошок зеленовато-желтого цвета, т.пл. 245 - 247^oC. Легко растворим в горячей воде, растворим в ДМФА, ДМСО, нерастворим в обычных органических растворителях. УФ- спектр (в воде): λ_max 265 нм, lgε 3,72. ПМР- спектр в ДМСО (м.д.): (3H, урацил) 2,46 (с); (6H, NCH₃) 3,35 (с); (6H, NCH₃) 3,42 (c); (8H, фенил) 7,4 (д), 7,95 (д); (2H, =CH) 8,3 (с).

Пример 2. Изучение влияния препарата I на обмен клетки животного.

Испытания предлагаемого препарата на обмен клетки животного проводились в сравнении с 6-метилурацилом, диуцифоном и диуцифон-гидратом.

Найдено, %: C 48,5; H 5,3; S 11,0; N 14,5.

C₂₃H₂₈N₆S₂O₇
Вычислено, %: C 48,9; H 5,0; S 11,4; N 14,9.

Животные (белые крысы-самцы) были разделены на 4 группы по 12 крыс в каждой. Препараты растворяли в дистиллированной воде и вводили внутрибрюшинно по 100 мг/кг ежедневно в течение 6 дней. Животных взвешивали в начале и в конце опыта. На седьмой день их забивали декапитацией, выделяли органы (почки и надпочечники, селезенку и печень), взвешивали и брали кусочки тканей для исследования. РНК и ДНК определяли по методу Р.Г.Цанева и Г.Г.Маркова (1960), белок - по методу Loury (1981).

Животные и выделенные органы взвешивались до и после опыта. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 2 - 6.

При анализе полученных данных четко прослеживается, что испытуемый препарат значительно способствует увеличению веса печени, почек, надпочечников и селезенки по сравнению с контролем, 6-метилурацилом и диуцифоном.

В то же время при гистологических испытаниях данных органов не отмечается никаких патологических (отек клеток, перерождение белковое, жировое и т. п.) изменений в каждом органе.

Таким образом, функция органа под действием исследуемого препарата возрастала в среднем в полтора и более раз.

При анализе данной таблицы четко прослеживается увеличение количества белка в каждом органе при приеме исследуемого препарата в среднем более чем на 30%.

Было исследовано количество ДНК и РНК в клетках перечисленных органов, так как от их количества в клетке зависит ее деятельность и функция клетки (фагоцитоз, возможность трансформации клетки при возникновении необходимости в организме и т.д.).

При анализе таблицы четко прослеживается увеличение ДНК при приеме различных препаратов, но наиболее всего при назначении исследуемого препарата, то есть препарата Д.

Из анализа данной таблицы следует, что количество РНК при введении исследуемого препарата увеличилось более чем на 50%, что способствовало резкому увеличению функциональной активности клетки, что было подтверждено нами в следующем опыте.

Из данных опыта следует, что под действием препарата Д количество РНК в клетке увеличивалось более чем на 50%, что естественно и повышало функциональную активность клетки, и свидетельствует о том, что гидрохлорид диуцифона активно участвует в обмене лимфоцитов. Антимикобактериальная активность препарата Д исследовалась на 3 видах микобактерий: возбудителе лепры Micobacterium leproe, возбудителе туберкулеза Micobacterium tuberculosis, атипичной микобактерии - Micobacterium lufu, потенциально патогенной.

Пример 3. Определение противолепрозной активности.

Противолепрозная активность препарата Д в сравнении с диуцифоном и диуцифоном-гидратом изучалась на мышах гибридах CBA x C₅₇BI, зараженных лабораторным штаммом К-1 микобактерий лепры, взятых в количестве 5000 микробных тел и введенных интраплантарно по методу Шепарда.

Под наблюдением находилось 4 группы мышей, все содержались в одинаковых условиях вивария по 20 мышей в группе.

Первая группа контрольная: в течение 6 месяцев мыши этой группы получали через зонд 5 раз в неделю 0,5 мл крахмальной суспензии. Опытные группы животных получали в течение срока опыта исследуемые препараты в дозе 50 мкг в 0,5 мл крахмальной суспензии 5 раз в неделю. Через 6 месяцев животные были забиты цервикальным смещением позвоночника, органы были подвергнуты бактериоскопическому исследованию, никаких патологических отклонений, характерных для какой-либо группы, не обнаружено. При бактериоскопическом исследовании места заражения лапку растирали в 2 мл 0,1% раствора альбумина, из 0,01 мл суспензии делали мазок, окрашивали по Циль-Нильсену, подсчитывали количество микобактерий лепры в 60 полях зрения и определяли количество микобактерий на одну мышь в каждой группе. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Как следует из приведенных данных, препарат Д обладает высокой бактериостатической активностью относительно микобактерий лепры, превосходящей антимикобактериальную активность как диуцифона, так и диуцифон-гидрата. Кроме того, следует отметить, что у 50% животных в группе, которая получала лечение препаратом Д, не наблюдалось микобактерий, что говорит о его бактерицидных свойствах.

Пример 4. Определение противотуберкулезной активности.

Противотуберкулезная активность препарата Д в сравнении с метацилом, диуцифоном и диуцифон-гидратом исследовалась на микобактериях штамма "Academia". Микобактерии туберкулеза культивировали в жидкой среде Школьниковой с 10% человеческой плазмой. В каждую пробирку, содержащую 2 мл среды с исследуемыми веществами в разной концентрации, засевали по 0,2 мл взвеси микобактерий туберкулеза, приготовленной по бактериальному стандарту мутности N 5 и разведенной в 10 раз. Инкубировали 10 дней при 37^oC. Минимальную ингибирующую концентрацию определяли по отсутствию колоний микобактерий туберкулеза в пробирке с наименьшим содержанием исследуемого вещества. Для этой цели делали мазок, окрашивали его по Цилю-Нильсену, смотрели при увеличении 7х8 100 полей зрения, определяли морфологические структуры ("косы"), свидетельствующие о росте микобактерий туберкулеза, что отмечали знаком +. Полученные результаты представлены в таблице 8.

Анализ данных таблицы показывает, что препарат Д обладает противотуберкулезной активностью, выраженной в большей степени, чем активность диуцифон-гидрата.

Пример 5. Исследование влияния препарата Д на атипичные микобактерии.

Антимикобактериальная активность исследуемых препаратов исследовалась на микобактериях Micobacterium lufu. M.lufu, выращенные на среде Левенштейна-Иенсена, растирают в фарфоровой ступке и готовят суспензию, соответствующую X стандарту мутности. Суспензию разводят в 1000 раз и по 0,2 мл добавляют в пробирки с раститрованными по 2 мл растворами исследуемых препаратов в концентрации от 128 мгк/мл до 0,25 мкг/мл. Посевы выдерживаются при 34^oC в течение 10 суток, затем центрифугируются 5 минут при 1500 оборотах. Надосадочная жидкость сливается через край: осадок наносится на стекло, равномерно размазывается, фиксируется, красится по Мурахащи.

Стекла смотрят при увеличении 7 х 8. Результат выражают в МИК (минимальной ингибирующей концентрации) препарата, при которой количество зеленых (живых) колоний по сравнению с красными (мертвыми) в 2 раза меньше, чем в контроле.

МИК исследуемого препарата Д меньше, чем МИК препаратов сравнения, а в наибольшей исследуемой концентрации препарат Д проявляет бактерицидный эффект в отношении M.lufu.

Таким образом, можно сделать вывод, что предлагаемый препарат Д обладает антимикобактериальным действием, как на патогенные микобактерии, являющиеся возбудителями таких социально опасных болезней, как лепра и туберкулез, так и на атипичные микобактерии, которые часто под воздействием экологических факторов трансформируются в условно патогенные и патогенные штаммы.

Пример 6. Определение иммунотропной активности.

а) Влияние на гуморальный иммунитет изучали с помощью метода локального гемолиза в геле (реакция Ерне и Нордин). Мышей-гибридов (CBAxC₅₇BI) иммунизировали эритроцитами барана в дозе 5•10⁶ и сразу после этого вводили изучаемые препараты перорально или внутрибрюшинно. На 5-е сутки подсчитывали количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и определяли индекс стимуляции по отношению к числу АОК в контрольной группе. Данные представлены в таблицах 10 и 11.

Вывод: чистый диуцифон оказывает слабое стимулирующее действие, а препарат Д увеличивает индекс стимуляции до 3,8 и 4,8 при различных способах введения, а гидрат диуцифона почти в 2 раза менее эффективен и его иммуностимулирующая активность равна 2,2 и 2,6.

б) Влияние испытуемых препаратов на фагоцитарную активность макрофагов исследовали по клиренсу туши из крови, взятой из ретроорбитального синуса у мышей, получавших препараты внутрибрюшинно (в/б) и перорально (п/о). Результаты оценивали по фагоцитарному индексу (таблица 12).

Вывод: фагоцитарная активность макрофагов под действием препарата Д вырастает более чем в 1,5 раза, а при приеме гидрата диуцифона на 12 - 17% и почти не изменяется при введении чистого диуцифона. Возможно это объясняется практически полной нерастворимостью чистого диуцифона в воде.

в) Влияние диуцифона, гидрата диуцифона и препарат Д на клеточный иммунитет изучали в реакции бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Т-клеточных митогенов.

Метод основан на том, что культивируя ин витро лимфоциты животного в присутствии митогенов - фитогемаглютинина (ФГА) и конканавалина (К_омА), можно вызвать их трансформацию в бласты и деление. Чем больше при подсчете образуется бластов, тем большей иммуномодулирующей активностью обладает препарат. Индекс стимуляции высчитывают по отношению числа бластов в опытной группе к числу бластов в контрольной группе.

В результате был сделан вывод о том, что все исследуемые препараты стимулируют пролиферацию лимфоцитов (образование бластов), но самый высокий индекс стимуляции у препарата Д. ИС = 23,5, затем у гидрата диуцифона ИС = 20,2 и ниже всего у диуцифона.

Изобретение откосится к новым биологически активным химическим соединениям, производным диаминодифенилсульфона общей формулы I, которые активны в эксперименте по отношению к микобактериям лепры и туберкулеза, активно влияют на обмен клетки, может быть использовано в качестве средства для лечения лепры, туберкулеза и других иммунодефицитных заболеваний. 12 табл.

N, N'-(Сульфонилди-1,4-фенилен)бис(N'', N''-диметилформамидин)1,2,3,4-тетрагидро-6-метил-2,4-диоксо-5-пиримидинсульфонат

стимулирующий клеточный метаболизм и обладающий иммунотропной и антимикобактериальной активностью.