КОМПЛЕКС ТРИС-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)АМИНА С БИС-(2-МЕТИЛФЕНОКСИАЦЕТАТОМ) ЦИНКА, ПОВЫШАЮЩИЙ ЦИТОКИННУЮ АКТИВНОСТЬ СУММАРНОЙ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/205 A61K33/30 A61P37/00 A61P43/00 

Изобретение относится к созданию новых биологически активных соединений противосклеротического действия. В качестве такого препарата предлагается комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатран] из класса производных триэтаноламина и солей биоактивных металлов ("О-гидрометаллоатранов"). Фармакологическая активность его ранее не исследовалась. Изобретение может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов противосклеротического действия. В настоящее время механизм развития атеросклероза связывают с цитокиновой активностью ряда белковых факторов. Показана важная роль ферментов класса аминоацил-тРНК-синтетаз, являющихся ключевыми агентами для обмена веществ. В частности, тирозил-тРНК-синтетаза (ТирРСаза), будучи расщепленной, обладает цитокинной активностью, стимулирует ангиогенез, способствуя тем самым атерогенезу. В то же время гомолог ТирРСазы-триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРСаза), существующая в виде двух форм, в отличие от ТирРСазы, обладает ярко выраженным антиангиогенным и антиатерогенным действием [1, 2].

Известен ряд препаратов, стимулирующих цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРСаз) различными химическими и биологически активными соединениями, в частности γ-интерфероном [3], изофлавонами - генистеином и даидзеином [4], форболовыми эфирами [5].

В качестве ближайшего аналога предлагаемого изобретения может служить источник [6]: Нурбеков М.К., Фаворова О.О., Дмитренко С.Г., Болотина И.А., Киселев Л.Л. Роль ионов цинка в функционировании бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы. // Молекулярная биология, 1981, т.15, №5, стр.1000-1010.

Наиболее близким по структуре и антиатерогенной активности к заявляемому соединению (прототипом) является лекарственный препарат "трекрезан" [7, 8] - трис-(2-гидроксиэтил)-аммоний 2-метилфеноксиацетат, который повышает активность суммарной триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы) в дозе 25 мг/кг на 20% по сравнению с контролем.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих стимулирующей цитокинной активностью в отношении триптофанил-тРНК синтетазы, предлагается использовать биологически активное соединение - комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатран] формулы (HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂ОС₆Н₄-СН₃-2)₂, синтезированный нами ранее [9]. Заявляемая биологическая активность крезоксицинкатрана ранее не была известна. Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими представленными ниже примерами.

Пример 1. Синтез комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатрана]

39.57 г (0,1 моль) Бис-(2-метилфеноксиацетата) цинка (2-СН₃-С₆Н₄OСН₂СОО)₂Zn и 14.91 г (0.1 моль) свежеперегнанного триэтаноламина растворяли при перемешивании в спирте (метанол, этанол, изо-пропанол), нагревали при кипячении 5 часов. Растворитель затем отгоняли. Осадок многократно промывали эфиром и высушивали в вакууме. Получали 50.12 г (92%) кремового порошка, являющегося комплексом трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатран], формулы (НОСН₂СН₂)₃N·Zn(ООССН₂OС₆Н₄-СН₃-2)₂, с т.пл. 104-105°С, растворимого в воде, спиртах, ацетоне, ДМСО, ДМФА, хлороформе и нерастворимого в эфире, гексане, гептане.

ЯМР ¹H (ацетон-D₆): 7.06-6.75 (м, 8Н, 2С₆Н₄O), 4.45 (с, 4Н, 2СН ₂СОО), 3.66 (с, 6Н, ОСН ₂), 2.77 (с, 6Н, NCH ₂), 2.20 (с, 6Н, 2С₆Н₄-СН ₃).

ЯМР ¹³С (ацетон D₆): 176.01(C=O), 157.80 (С₆Н₄O), 131.11-112.11 (С₆H₄), 67.43 (CH₂COO), 58.06 (ОСН₂), 56.05 (NCH₂), 16.49 (С₆Н₄-СН₃).

ИК: 1626(С=О), 3300(ОН).

Найдено, %: 52.56; Н 6.17; N 3.00; Zn 12.05. C₂₄H₃₃O₉NZn. Вычислено, %: С 52.89; Н 6.11; N 2.57; Zn 12.00

Пример 2. Исследование влияния крезоксицинкатрана на активность триптофанил-тРНК-синтетазы.

Эксперименты проводились на кроликах массой 2,5-3 кг. Гиперхолестеринемию, как разновидность жировой дистрофии, моделировали ежедневным скармливанием животным с пищей холестерина в дозе 0,25 г/кг.

Были сформированы одна контрольная и две опытные группы по 10 животных в каждой группе. Все животные продолжали получать холестерин. Кроликам опытных групп вводили крезоксицинкатран, а контрольным животным - физиологический раствор.

Кроликам первой опытной группы ежедневно вводили внутримышечно свежеприготовленный водный раствор крезоксицинкатрана в дозе 5 мг/кг в течение 2 мес. Второй группе кроликов раствор крезоксицинкатрана в дозе 5 мг/кг вводили внутримышечно с первого дня эксперимента вместе с холестерином. Эксперименты продолжались в течение 3 мес. После этого животные забивались путем воздушной эмболии.

Активность ТРСазы измеряли по модифицированному методу [10] в частично очищенных экстрактах. Образцы аорты (от 5 до 8 г) измельчали при 5°С и растирали в жидком азоте до порошкового состояния. Смесь экстрагировали в буфере, содержащем 20 мМ трис-НСl рН 7,5; 1 мМ β-меркаптоэтанол; 5 мМ ЭДТА; 1 мМ PMSF; 0,1 М КСl. После перемешивания при 5°С в течение 30 мин, клеточный дебрис осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 20000 g. К супернатанту добавляли, перемешивая, мелко измельченный сульфат аммония до 40% насыщения. После формирования осадка в течение 1-2 часов при 5°С, его удаляли центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Осадок удаляли. К супернатанту добавляли тем же путем сульфат аммония до 60% насыщения. Осадок оставляли на ночь при 5°С. Перед опытом осадок центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин. Осадок для удаления соли диализовали против указанного выше буфера без КСl. В реакционную смесь объемом 60 мкл, содержащую 20 мМ трис-НСl рН 7,5; 5 мМ MgCl₂; 0,05 мг/мл БСА; 0,1 мМ [С¹⁴]; L-триптофан (54 mCi/моль, Amersham); -50 мМ КСl; 1,0 мМ ЭДТА; 2,5 мМ АТФ; 7 мг/мл суммарной дрожжевой тРНК [11].

При использовании частично очищенных препаратов тРНК^Трп, их концентрация в смеси составляла 0,2 мкМ. К смеси добавляли 20 мкг частично очищенного препарата, нормализованного по белку. Смесь инкубировали при 25°С и отбирали по 9 мкл аликвот, помещали на Whatman GFC диски и промывали 5% ТХУ. Связанную радиоактивность определяли с помощью сцинтилляционного счетчика β-радиации. В контроле использовали соответствующие количества суммарного белка плазмы. Для измерения специфического эффекта крезоксицинкатрана использовали время инкубации на линейном участке зависимости радиоактивности от продолжительности инкубации и от концентрации экстракта.

Результаты обрабатывались статистически.

На рис.1 показана активность ТРСазы в частично очищенных препаратах аорты при воздействии крезоксицинкатрана в различных дозах и путях введения в условиях развития экспериментальной гиперхолестеринемии.

В первой серии опытов, крезоксицинкатран вводили внутримышечно в дозе 5 мг/кг в течение 2 мес. Определение активности крезоксицинкатрана на препарате синтетазы из тканей аорты показало, что уровень ТРСазы у кроликов этой группы под влиянием крезоксицинкатрана достоверно повысился на 50% (рис.1). В следующей серии опытов, при трехмесячном введении крезоксицинкатрана в дозе 5 мг/кг с первого дня эксперимента, т.е. в определенной мере профилактически, установлено, что у кроликов этой группы проявляется выраженный эффект - повышение уровня ТРСазы (рис.1).

Установлено, что крезоксицинкатран повышает активность ТРСазы в дозе 5 мг/кг на 50% по сравнению с контролем (рис.1). В отличие от этого трекрезан (прототип) повышает активность ТРСазы лишь на 20% по сравнению с контролем, в дозе, в 5 раз большей (25 мг/кг), чем крезоксицинкатран.

Таким образом, применение химического соединения - комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатрана] приводит к достоверной активации суммарной триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы), обладающей ярко выраженным антиангиогенным и антиатерогенным действием.

Изобретение позволит создать на его основе новые фармакологические препараты для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов.

Предложено применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатрана] формулы (НОСН₂СН₂)₃N·Zn(ООССН₂OС₆Н₄СН₃-2)₂ в качестве стимулятора цитокинной активности суммарной триптофанил - тРНК синтетазы. Показано повышение цитокинной активности суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы на 50% по сравнению с контролем в дозе 5 мг/кг при внутримышечном введении в течение 2 мес; введение же крезоксицинкатрана в той же дозе, но вместе (одновременно) с холестерином в течение 3 мес также дает выраженный эффект - повышение уровня ТРСазы. Изобретение может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов противосклеротического действия, например, для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов. 1 ил.

Применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [крезоксицинкатрана] формулы (НОСН₂СН₂)₃N·Zn(ООССН₂OС₆Н₄СН₃-2)₂ в качестве стимулятора цитокинной активности суммарной триптофанил-тРНК синтетазы.