ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА-ТРИС-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)АМИНА С БИС-(2-МЕТИЛФЕНОКСИАЦЕТАТОМ) ЦИНКА (ЦИНКАТРАНА) ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ОБЩЕЙ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А1 Российский патент 2015 года по МПК A61K45/00 A61P9/10 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и может быть использовано для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса.

Известно, что на раннем этапе атерогенеза происходит активация эндотелия, который выделяет на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов, нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие моноциты в интиму сосудов. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛПНП предпочтительно захватываются с помощью специфических рецепторов макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, в определенных ситуациях способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению такого грозного осложнения, как разрыв бляшки, образование тромба и развитие инфаркта миокарда. Таким образом, обосновано, что макрофаги играют ключевую роль в развитии атеросклеротических повреждений (М.И. Душкин. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты. // Бюлл. СО РАМН, (2006); №2 (120), с.47-55). Доказано, что фосфолипазы являются биомаркерами активности атеросклеротического процесса, эффективности проводимой терапии как у больных атеросклерозом, так и у больных с осложнениями атеросклероза, в частности ишемической болезни сердца - ИБС (стенокардией напряжения II ФК) (С.Н. Богданова. Клинико-экспериментальное изучение влияния фактора питания на активность лизосомальных гидролаз тромбоцитов и мононуклеарных лейкоцитов при атеросклерозе. Автореф. Дисс. канд., (1992), 28 с; Е.Н. Данковцев, Д.А. Затейщиков. Биомаркеры в кардиологии: липопротеинассоциированная фосфолипаза А2 //Фарматека (2007); №15 (149) Кардиология, Неврология, с.22-28). Липидный профиль в значительной мере определяется состоянием макрофагов, их ферментативными реакциями. В этом плане заслуживают внимания исследования и разработки средств, изменяющих активность липаз макрофагов, в частности кислой фосфолипазы А1 (ФЛА1к) (КФ 3.1.1.32) при оптимальным значением pH - 4,0, вызывающей деградацию структуры фосфолипидов, отщепляя ацильные остатки от углеродных атомов C₁ в молекуле лецитина и других фосфолипидах, с образованием промежуточных продуктов гидролиза - лизолецитина и лизофосфолипидов, обладающих сильным мембранотоксическим действием (А.А. Покровский, В.А. Тутельян. Лизосомы. - Наука, 1976, 380 с.; X. Брокерхоф, Р. Дженсен Липолитические ферменты, пер. с англ., М., 1978, с.242-356). В литературе имеются сведения о возможности снижении общей (суммарной) активности ФЛА1к различными химическими соединениями (Н.Б. Губергриц. «Эссенциале форте Н» «Эссенциале Н» в гепатологии и гастроэнтерологии. Сучасна гастроентерологiя, №5 (43), 2008 р. с.79-89). Однако существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих указанной активностью.

Наиболее близким по воздействию и выбранный нами за прототип является трекрезан, который может быть использован в качестве средства, модулирующего активность кислой фосфолипазы А1 (Патент RU №2445087, МПК А61К 31/205 от 20.03.2012). Выявленное изменение активности ФЛА1 можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания процессов неспецифического нерегулируемого эндоцитоза модифицированных липопротеидов низкой плотности ЛПНП или надмолекулярных ЛПНП-содержащих комплексов, когда специфический рецепторопосредованный путь эндоцитоза ЛПНП ингибируется по принципу обратной связи высокими концентрациями этерифицированный холестерин (ЭХС) (Погожева А.В. Сердечно-сосудистые заболевания, М., 2005 г., 205 с.). При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов, расщепляющих ЭХС, что приводит к аккумуляции ЭХС и триглицеридов в клетках и повышению риска развития атеросклероза (Нагорнев В.А. Патогенез атеросклероза. СПб.: ″Хромис″, 2006).

Таким образом, влияние реакции кислой фосфолипазы А1 на деятельность субклеточных структур при развитии атеросклероза вызывает необходимость поиска и внедрения в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих способностью изменять активность липаз микрофагов.

Задача настоящего изобретения состоит в использовании известного вещества, обладающего свойством снижать активность кислой фосфолипазы А1.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, понижающего общую активность кислой фосфолипазы А1, предлагается использовать синтезированное ранее (Воронков М.Г., Адамович С.Н. и др. Синтез новых биологически активных O-гидрометаллоатранов //ЖОХ, 2009, т.79, №1, С.162-163), биологически активное соединение - комплекс трис-(2-гидрокси-этил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [цинкатран или цитримин] формулы: (HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂OC₆H4CH₃-2)₂.

Известна возможность применения цинкатрана в качестве антидота при отравлении алкоголем (Патент RU №2418580, МПК 61К 31/133 от 20.05.2011).

Заявляемая биологическая активность цинкатрана в качестве средства, обладающего свойством снижать активность кислой фосфолипазы А1 не была известна и в литературе не описана.

Трекрезан и цинкатран относятся к одной группе - протатранов, что объясняет схожесть биологического воздействия, однако наличие катиона цинка в молекуле цинкатрана усиливает это воздействие и может быть проиллюстрировано следующими представленными ниже примерами.

Пример 1

Эксперименты проводят на кроликах Шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг. Атеросклероз вызывают методом Н.Н. Аничкова. Кроликам опытных групп (10 животных) вводят внутримышечно свежеприготовленный водный раствор цинкатрана в дозе 5 мг/кг, в течение 2 мес. Контрольным животным (n=10) вводят внутримышечно физиологический раствор. За 12 часов до забоя животных лишают пищи. Под тиопентаталовым наркозом вскрывают брюшную полость, перед выделением тщательно перфузируют печень охлажденным физиологическим раствором. Гомогенизацию печени проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера в течение 90 с при скорости вращения пестика 200g при поступательном движении стеклянного стакана гомогенизатора вверх-вниз. В качестве суспендирующей среды используют 0,25М раствор сахарозы pH 7,4 с 1 мМ ЭДТА. Конечное разведение гомогенатов печени соответствует 1:20 (вес: объем). Супернатант используют для дальнейшего исследования активности ФЛА1. Активность ФЛА1 определяют радиометрическим методом (W. Stoffel, U. Trabert, Studies on the occurrence and properties of lisosomal phospholipases A1 and A2 and the degradation of phosphatidic acid in rat liver lysosomes//Hoppe Seylers Z. Fhysiol. Chem. - 1969. - Bd. 350. - S. 836-844), с использованием в качестве субстрата, синтезированного нами, 1-ацил-2(1-14С)-олеоил-глицеро-3, sn-фосфорилхолина (A.F. Robertson, W.E.M. Leuds Positional specificities in phospholipid hydroly-ses//Biochemistry (Wash.). - 1962. - Vol.1. - P.804-810). Инкубационная смесь содержит 150 нМ меченого лецитина, 160 мкМ 0,1 N ацетатного буфера (pH 4,5) и источник ферментов в конечном объеме 1,3 мл. Инкубацию проводят на водяной вибробане в течение 30 мин при 37°C. Реакцию останавливают добавлением 3 мл смеси хлороформ: метанол (1:2 об/об) и немедленно экстрагируют по методу Клайера и Дайера. Продукты реакции разделяют с помощью тонкослойной хроматографии в закрепленном слое силикагеля на стеклянных пластинах размером 20/20 см в системе растворителей хлороформ: метанол: вода (65:25:4). Фракции лизолицетина, лецитина и жирных кислот экстрагируют смесью хлороформ: метанол при объемном соотношении 1:2. Экстракты помещают во флаконы с 10 мл сцинциляционной жидкости, содержащей в 100 мл толуола особой чистоты 5 г 2,5-дифенилоксазола и 300 мг 1,4 бис/2-(5 фенилоксазолил)-бензола. Радиоактивность измеряют на сцинтилляционном счетчике «Rackbeta 1215» ЛКБ (Швеция). Об активности ФЛА1 судят по образованию меченого лизолицетина, получившегося в результате воздействия этих ферментов на 1-ацил-2(1-14С)-олеоил-глицеро-3, sn-фосфорилхолин. Активность ФЛА1 выражают в мкМ продукта в мин/1 г белка.

Результаты обрабатывают статистически. Сравнительный анализ данных табл.1 показывает, что повышение активности ФЛА1 в печени контрольной группы кроликов, подверженных атеросклерозу, превышает на 75% показатели эталона. При введении цинкатрана в дозе 5 мг/кг в течение 2 месяцев выявлено достоверное снижение атерогенности липидного обмена в крови, при этом активность ФЛА1 в печени снижается на 90% по сравнению с контролем и приближается к эталонному показателю. Использование трекрезана (по прототипу) также приводит к снижению ФЛА1, однако по сравнению с цинкатраном аналогичный результат достигается в течение 2 месяцев при 2 5 мг/кг, что в 5 раз превышает концентрацию цинкатрана, а следовательно, подтверждает его более высокую активность по сравнению с трекрезаном по снижению общей активности кислой фосфолипазы А1 - фермента, демонстрирующего активность атеросклеротического процесса.

Изобретение позволит создать на основе цинкатрана новые фармакологические препараты для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов.

Таблица 1 Динамика показателей липидного обмена при применении цинкатрана Количество липидов (ммоль/л) печень Эталон, ИПА(%)=3,1±1,1 Липиды общие 0,2±0,01 Холестерол 0,1±0,01 Триацилглицерины 1,3±0,1 β-липопротеины - ФЛА1 0,99±0,02 Контроль, ИПА(%)=51,5±4,5 Липиды общие 1,3±0,1 Холестерол 0,4±0,1 Триацилглицерины 0,9±0,1 β-липопротеины 0,2±0,05 ФЛА1 4,05±0,25 Трекрезан, в дозе 25 мг/кг в/м 2 месяца, ИПА (%)=36±5* Липиды общие 1,1±0,1 Холестерол 0,3±0,1 Триацилглицерины 0,2±0,04 β-липопротеины - ФЛА1 1,11±0,07 Опыт-1 (пинкатран в дозе 5 мг/кг в/м 2 месяца), ИПА (%)=32±4* Липиды общие 0,3±0,1* Холестерол 0,15±0,05* Триацилглицерины 0,2±0,05* β-липопротеины - ФЛА1 1,12±0,12* Примечание: * - р<0,05 по отношению к контролю.

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии. Предложено применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфенокси-ацетатом)цинка[цинкатрана или цитримина] формулы: (HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂OC₆H₄CH₃-2)₂ в качестве ингибитора кислой фосфолипазы Al. Изобретение позволяет расширить область применения вещества в качестве компонента новых фармакологических препаратов для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов. 1 табл.

Применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфенокси-ацетатом)цинка[цинкатрана или цитримина] формулы:
(HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂OC₆H₄CH₃-2)₂ в качестве средства, снижающего общую активность кислой фосфолипазы Al.