ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА-ТРИС-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)АМИНА С БИС-(2-МЕТИЛФЕНОКСИАЦЕТАТОМ) ЦИНКА (ЦИНКАТРАНА) В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА, УГНЕТАЮЩЕГО ОБЩУЮ АКТИВНОСТЬ ОСНОВНОЙ (ЩЕЛОЧНОЙ) ФОСФОЛИПАЗЫ А2 МОНОНУКЛЕАРОВ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/192 A61K45/06 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и может быть использовано, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса.

В последнее время доказано участие в атерогенезе лизосомальных липолитических ферментов, ответственных за деградацию липидных компонентов липопротеидов (ЛП). Определено их участие в механизме нарушений обмена липидов и липопротеидов при атеросклерозе, выявлена взаимосвязь между степенью изменений их активности в мононуклеарах крови, уровнем липидов крови и коэффициентом атерогенности (Серебров В.Ю., Балашов П.П., Шарыпова Н.Г. Исследование активности фосфолипаз плазматических мембран лимфоцитов при абстинентном синдроме у больных опийной наркоманией: // Сб. науч. трудов Сиб. Мед. Универ. (Томск) Актуальные проблемы биологии; - 2004. - Т. 3. - С. 209; Mallat Z, Benessiano J, Simon T et al. Circulating secretory phospholipase A2 activity and risk of incident coronary events in healthy men and women: The EPIC-NORFOLK Study. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2007; - V. 27: - P. 1177-83). Развитие атеросклероза связано с патологическими процессами в эндотелии сосудов. На раннем этапе атерогенеза активируется эндотелий, который экспрессирует на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов (Мц), нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие Мц в интиму сосудов. Мц, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛНП), миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛНП захватываются макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению разрыва бляшки, образованию тромба и развитию инфаркта миокарда. Следовательно, макрофаги играют ключевую роль в развитии атеросклеротических повреждений (Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты // Бюлл. СО РАМН (2006); №2 (120), с. 47-55). В этом плане заслуживают внимания исследования средств, изменяющих активность гидролаз Мц, в частности, фосфолипазы A2 - (ФЛА2) (КФ 3.1.1.14) - лизосомального липолитического фермента класса гидролаз, имеющей оптимум действия при щелочных значениях pH, участвующего в атерогенезе, что обусловлено его участием в метаболизме липидов клеточных мембран, процессах ПОЛ, синтезе эйкозаноидов и др. (Ji Huang, Hai-Yan Qian, Zhi-Zhong Li., et all. Role of endothelial lipase in atherosclerosis // Translational Research, - 2010,. vol. 156, Issue 1. - P. 1-6; Бельков ВВ. C-реактивный белок и липопротеин-ассоциированная фосфолипаза A2: новые факты и новые возможности для диагностики и стратификации сердечно-сосудистых рисков // Ж. «Поликлиника» - 2010 - №1. - С. 18-21). Следовательно, изменение активности ФЛА2 под влиянием тех или иных средств может служить критерием эффективности антиатеросклеротических препаратов.

Существует большое число препаратов для лечения и профилактики склеротических явлений, механизм которых основывается на понижении общей активности фосфолипазы A2. К основным средствам, оказывающим гиполипидимическое действие, относят секвестанты жирных кислот, никотинаты, фибраты, статины и комбинированные препараты. Результаты клинических исследований свидетельствуют о том, что статины являются наиболее безопасным классом лекарственных средств и обладают наименьшим количеством побочных эффектов, но не исключает их полностью. Исследования показали, что регулярный прием статинов может приводить к серьезным побочным последствиям, среди которых мышечная миопатия, нарушение обмена веществ в печени, почечная недостаточность (Д.А. Затейщиков. Проблемы безопасности статинов // Фарматека, 2005, №8). Кроме того, статины не рекомендованы больным сахарным диабетом, а также неполностью исследованы отдаленные последствия воздействия этих препаратов (Д.Н. Нозадзе, Л.Е. Семенова и др. Липопротеинассоциированная фосфолипаза A2 - новая позиция в системе стратификации риска. // Ж. Атеросклероз и дислипидемия, 2011, №1). В связи с этим возникает необходимость выявления альтернативных соединений, которые обладают ингибирующим действием на фосфолипазу A2.

В настоящее время предложен новый класс соединений протатранов, проявляющих высокую биологическую активность, в том числе при лечении склеротических поражений кровеносных сосудов. Протатраны представляют собой внутрикомплексные соединения триэтаноламина. Лекарственный препарат трекрезан оказывает противосклеротическое действие (М.Г. Воронков, М.К. Нурбеков, М.М. Расулов и др. Противосклеротическое действие трекрезана и его возможные механизмы // Докл. РАН, 2010 Т. 431, №2, с. 261-264), которое проявляется в результате стимуляции экспрессии матричной РНК триптофанил-тРНК синтетазы (Патент RU №2429836, МПК A61K 31/205 от 27.09.2011), за счет модулирования активности кислой фосфолипазы A1 (Патент RU №2429833 МПК A61K 31/185 от 20.03.2011), в результате снижения активности холестеролэстеразы (Патент RU №2444357, МПК A61K 31/205 от 10.03.2012), в результате повышения цитокинной активности суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы (Патент RU №2457837 МПК A61K 31/205 от 15.07.2011).

Задача настоящего изобретения состоит в использовании известного вещества, обладающего свойством угнетать общую активность основной (щелочной) фосфолипазы A2 мононуклеаров.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, угнетающего общую активность основной (щелочной) фосфолипазы A2 мононуклеаров, предлагается использовать синтезированное ранее биологически активное соединение - комплекс трис-(2-гидрокси-этил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [цинкатран или цитримин] формулы: (HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂OC₆H₄CH₃-2₎₂ (Воронков М.Г., Адамович С.Н. и др. Синтез новых биологически активных О-гидрометаллоатранов // ЖОХ, 2009, т. 79, №1, С. 162-163).

Известна возможность применения цинкатрана в качестве антидота при отравлении алкоголем (Патент RU №2418580, МПК 61К 31/133 от 20.05.2011).

Заявляемая биологическая активность цинкатрана в качестве средства, обладающего свойством угнетать общую активность основной (щелочной) фосфолипазы A2 мононуклеаров, не была известна и в литературе не описана. Нами впервые показано, что введение цинкатрана снижает активность лизосомального липолитического фермента из класса гидролаз (КФ 3.1.1): ФЛА2, что может быть проиллюстрировано следующими представленными ниже примерами.

Пример 1

Эксперименты проводят на кроликах Шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг. Атеросклероз вызывают методом Н.Н. Аничкова. Кроликам опытных групп (10 животных) вводят внутримышечно свежеприготовленный водный раствор цинкатрана (ЦА) в дозе 5 мг/кг в течение 2 мес. Препарат в этой дозе, как показано нами ранее, повышает цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК-синтетазы и оказывает противосклеротическое действие (Патент на изобретение RU №2457837, МПК A61K 31/205 от 15.07. 2011). Контрольным животным (10) вводят внутримышечно физиологический раствор. В конце экспериментов в крови животных стандартными методами определяют содержание общих липидов, триацилглицеринов, β-липопротеинов и холестерина. Мононуклеары выделяют из крови путем последовательного центрифугирования в градиенте фикол-верографин (Gmelig - Meyling F., Waldman Т.A. Separation of human blood monocytes and lymphocytes on a continuous percoll gradient // J. Immunol. Method. - 1980. - Vol. 26. - P. 603-308). Гепаринизированную кровь разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 и осторожно наслаивают раствор фикола с 76% верографином, центрифугируют 45 мин. После центрифугирования отбирают Мц и вновь центрифугируют их 30 мин при 1200 g. Полученные в виде осадка Мц троекратно отмывают физиологическим раствором в соотношении 5:1, центрифугируя по 10 мин при 1200 g. Осадок гомогенизируют в 2 мл 0,25М раствора сахарозы pH 7,4 с 0,001М ЭДТА. Активность ФЛА2 определяют радиометрическим методом (Stoffel. W., Trabert. U. Studies on the occerence and proparties of lisosomal phospholipases A1 and A2 and the degradation of posphatidie acid in rat liver lysosomes // Hoppe-Seyler′s Z. Fhysiol. Chem. - 1969. - Bd/350. - S. 836-844) с использованием в качестве субстрата синтезированного нами 1-ацил-2(13-Н) арахидоноил-глицеро-3sn-фосфорилхолина (Robertson A.F., Lends W.E.M.. Positional specificities in phospholipid hydrolises // Biochemistry (Wash.). - 1962. - Vol. 1. - P. 804-810). Инкубацию проводят на водяной вибробане в течение 30 мин при 37°C. Реакцию останавливают добавлением 3 мл смеси хлороформ:метанол (при объемном соотношении 1:2) и немедленно экстрагируют по методу Клайера и Дайера. Продукты реакции разделяют тонкослойной хроматографией в закрепленном слое силикагеля («chemapol») на стеклянных пластинах размером 20*20 см в системе растворителей хлороформ:метанол:вода (65:25:4). Фракции лизолицетина, лецитина и жирных кислот экстрагируют смесью хлороформ: метанол (при объемном соотношении 1:2). Экстракты помещают во флаконы с 10 мл сцинциляционной жидкости, содержащей в 100 мл толуола особой чистоты 5 г 2,5 - дифенилоксазола и 300 мг 1,4 бис/2-(5 фенилоксазолил)/-бензола. Радиоактивность измеряют на сцинцилляционном счетчике «Rackbeta 1215» ЛКБ (Швеция). Активность ФЛА2 выражают в микромолях образовавшихся продуктов в минуту на 1 г белка.

Результаты обрабатывают статистически.

В таблице 1 приведены сравнительные данные по показателям липидного обмена для контрольной группы животных в случае применения цинкатрана (ЦА) и эталонные значения.

Выявлено, что при применении ЦА в Мц снижается уровень холестерола с 34,2 до 25,2 (ммоль/л) и общих липидов с 72,9 до 47,5 (ммоль/л) по сравнению с контролем соответственно (табл. 1).

В таблице 2 представлена динамика изменения активности ФЛА2 в Мц у кроликов при применении цинкатрана в дозе 5 мг/кг (мкмоль/мин на 1 г белка).

Развитие атеросклероза сопровождается значительным увеличением суммарной активности ФЛА2, что иллюстрируют результаты ферментативного анализа, представленные в табл. 2, согласно которым содержание Мц у контрольной группы животных составляет 3,04 мкмоль/мин на 1 г белка, что выше на 63% по сравнению с эталоном, количество Мц в котором составляет 1,86 мкмоль/мин на 1 г белка. При введении опытной группе животных ца активность ФЛА2 в Мн достоверно снижается на 36% по сравнению с контролем с 3,04 до 1,91 мкмоль/мин на 1 г белка и приближается к эталонному значению.

Таким образом, применение химического соединения - комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка [цинкатрана или цитримина] приводит к достоверному снижению общей активности основной (щелочной) фосфолипазы A2 мононуклеаров.

Изобретение позволит создать на основе цинкатрана новые фармакологические препараты для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов, а также диагностические средства, указывающие на развитие склерозирования.

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии. Предложено применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка[цинкатрана или цитримина] формулы: (HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂OC6H₄CH₃-2)₂ в качестве в качестве средства, угнетающего общую активность основной (щелочной) фосфолипазы A2 мононуклеаров. Изобретение позволяет расширить область применения вещества в качестве компонента новых фармакологических препаратов для предотвращения склеротических поражений кровеносных сосудов. 2 табл., 1 пр.

Применение комплекса трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка[цинкатрана или цитримина] формулы: (HOCH₂CH₂)₃N·Zn(OOCCH₂OC₆H₄CH₃-2)₂ в качестве средства, угнетающего общую активность основной (щелочной) фосфолипазы A2 мононуклеаров.