СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ВАГИНАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений для изучения механизма эпителиально-бактериальных взаимодействий и их роли в формировании нормальных микробиоценозов тела человека.

Известно, что организм человека является открытой системой, находящейся в постоянном контакте с окружающей средой. Биотопы, непосредственно контактирующие с внешней средой, определяют сохранность постоянства внутренней среды, защищая от внешних факторов, в том числе патогенных бактерий. Выполнение этой функции обеспечивают клетки покровного эпителия слизистых, а также нормальная микрофлора, колонизирующая эти биотопы. Мукозальные эпителиоциты (эпителиоциты, покрывающие слизистые), занимая стратегически важное положение - на границе внутренней и внешней сред, способны реагировать на внешние стимулы, изменяя экспрессию цитокинов, дефенсинов и иных секреторных продуктов, регулировать локальную иммунную реакцию, обеспечивая защиту от патогенных микроорганизмов (McCormick B.A. (edited by). Bacterial-Epithelial Cell Cross-Talk. Molecular mechanisms in pathogenesis. New York, Cambridge University Press, 2006).

Известны способы определения реакции эпителиоцита на влияние бактерий (Wira С.R., Grant-Tschudy K.S., Crane-Godreau М.А. Epithelial Cells in the Female Reproductive Tract: a Central Role as Sentinels of Immune Protection. American Journal of Reproductive Immunology. 2005, 53(2): 65-76).

Известно, что бактерии обладают рядом биологических свойств (антагонистическая активность, ростовые свойства, способность к адгезии, персистентные характеристики: антилизоцимная, антикомплементарная, антилактоферриновая, антииммуноглобулиновая и т.п.), которые могут изменяться под влиянием различных факторов, определяя характер взаимодействия с макроорганизмом (Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т.2. / Под ред. Й.Ленгелера, Г.Древиса, Г.Шлегеля - М.: Мир, 2005. - 496 с., Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М. Медицина; Екатеринбург: УрО РАН. 1999.) Однако не существует способа оценки изменений биологических свойств бактерий под действием вагинальных эпителиоцитов.

Актуальность разработки способа определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий обусловлена возможностью изучения механизмов эпителиально-бактериальных взаимодействий, что позволит расширить представления о формировании и поддержании микробиоценозов и разрабатывать на основе полученных знаний методические подходы к созданию новых способов и препаратов для коррекции дисбиотических состояний репродуктивного тракта женщин.

Известны способы изучения влияния секреторных продуктов нейтрофилов на рост бактерий и грибов (Андреева Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин // Автореф. дис. канд. мед. наук. - Челябинск, 2005.), а также на адгезию грибов рода Candida к вагинальным эпителиоцитам (Свиридов М.А. Влияние различных факторов на адгезивные свойства на поверхности вагинальных эпителиоцитов женщин репродуктивного возраста // Автореф. дис. канд. мед. наук. - Челябинск, 2008).

Однако эти способы не позволяют оценить влияние эпителиоцитов на биологические свойства бактерии, так как адаптированы под оценку влияния эффекторных клеток иммунной системы, являющихся профессиональными киллерами, секреторные продукты которых обладают значительной бактерицидной активностью (Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург: УрО РАН, 2001).

Известен способ изучения антикандидозной активности вагинальных эпителиоцитов, основанный на оценке контактного подавления вагинальными эпителиоцитами роста грибов рода Candida (Barousse MM, Steele С, Dunlap K, Espinosa T, Boikov D, Sobel JD, Fidel PL Jr. // Growth inhibition of Candida albicans by human vaginal epithelial cells. J Infect Dis. - 2001. - Vol.184. - P.1489-1493).

Однако известный способ направлен на оценку влияния вагинальных эпителиоцитов на грибы, а не на бактерии. Обязательным условием для оценки влияния вагинальных эпителиоцитов в указанном способе является использование глюкозы, с радиоактивной меткой, что усложняет метод, требуя специальных условий, оборудования и разрешения. Данный способ позволяет определить подавление роста грибов, что не полостью отражает весь спектр возможных взаимоотношений эпителиоцитов с микроорганизмами (стимулирующее, индифферентное). Определение накопления глюкозы позволяет оценить биохимическую активность грибов лишь по одному веществу, что не отражает полного функционального состояния грибов, тогда как ростовые характеристики учитывают количество клеток и зависят от функционирования генома и множества ферментных систем. Кроме того, способ не позволяет оценить, чем опосредовано влияние вагинальных эпителиоцитов - внеклеточными секреторными продуктами или непосредственным контактом клеточных поверхностей.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Известна возможность бактерий изменять свои биологические свойства как под влиянием секреторных продуктов других микроорганизмов (Бухарин О.В., Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В Микробная регуляция антагонистической активности бактерий // Бюллетень эксп.биол. и мед. 2007. №11. с.545-548), нейтрофилов (Андреева Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин // Автореф. дис. канд. мед. наук. - Челябинск, 2005.), так и вследствие прямого межбактериального контакта (Aoki S.K., Pamma R., Hernday A.D. et. al. Contact-Dependent Inhibition of Growth in Escherichia coli. Science. 2005, 309(5738): 1245-1248.), поэтому для комплексной оценки влияния вагинальных эпителиоцитов на бактерии требуется разработка методических подходов к оценке влияния как секреторных продуктов эпителиоцитов, так и контактного эпителиально-бактериальных взаимодействия.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение для всех вариантов изобретения, заключается в создании способа, позволяющего определять характер влияния (стимулирующее, ингибирующее или индифферентное) вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий такие, как ростовые свойства и антагонистическую активность.

Для достижения указанного технического результата в заявляемом способе определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий такие, как ростовые свойства и антагонистическую активность, согласно изобретению по первому варианту получают вагинальные эпителиоциты, освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением 50 мкг/мл цефураксима и 10 мкг/мл лизоцима, и трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора, инкубируют и отделяют супернатант, из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают ее с эпителиальным супернатантом, параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и среды для культивирования эпителиоцитов, инкубируют, измеряют биологические свойства бактерий в опытной и контрольной пробах, рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий.

Для достижения указанного технического результата в заявляемом способе определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий такие, как ростовые свойства и антагонистическую активность, согласно изобретению по второму варианту получают вагинальные эпителиоциты, инактивируют их 0,4% раствором формалина в течение 15 мин, пятикратно отмывают физиологическим раствором и доводят концентрацию инактивированных эпитеолицитов до 10⁶ кл/мл, из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают с взвесью инактивированных эпителиоцитов, параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и физиологического раствора, опытную и контрольную пробы инкубируют, измеряют биологические свойства бактерий в опытной и контрольной пробах, рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий.

Технический результат от реализации изобретения выражается в создании способа, позволяющего определять способность вагинальных эпителиоцитов регулировать биологические свойства бактерий такие, как ростовые свойства и антагонистическую активность, различных таксонов за счет выявления различного влияния (стимулирующего, ингибирующего или индифферентного) эпителиальных супернатантов и контактного эпителиально-бактериального взаимодействия на биологические свойства бактерий.

Известно, что ростовые свойства и антагонистическая активность бактерий, отражая физиологические особенности бактерий, функционирование их генов (Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах. Т.2. / Под ред. Й.Ленгелера, Г.Древиса, Г.Шлегеля - М.: Мир, 2005. - 496 с.) предопределяют успешность взаимодействия бактерий с клетками макро- и микроорганизмов.

Авторами экспериментально установлено новое свойство вагинальных эпителиоцитов - способность дифференцировано влиять на биологические свойства бактерий, в частности оказывать влияние (стимулирующее, ингибирующее или индифферентное) на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий.

На первом этапе исследования было изучено влияние внеклеточных секреторных продуктов, содержащихся в эпителиальных супернатантах, на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий. Для этого вагинальные эпителиоциты, полученные с боковых стенок влагалища 62 здоровых женщин, освобождали от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением антибиотика цефуроксима и лизоцима, трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора, затем инкубировали в среде Хенкса 4 часа.

Эпителиальный супернатант получали фильтрованием четырехчасовой культуральной жидкости эпителиоцитов. Отдельно в мясопептонном или MRS бульоне готовили взвесь, содержащую 10⁶ КОЕ/мл из суточной культуры S.aureus, E.coli, Lactobacilus. spp., из коллекции Учреждения Российской Академии наук Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН (источник выделения - репродуктивный тракт женщин). Затем смешивали взвесь бактерий с эпителиальным супернатантом в соотношении 7:1.

Параллельно готовили контроль из взвеси исследуемых бактерий и среды Хенкса в соотношении 7:1.

Затем опытные и контрольные пробы инкубировали в течение 6 часов.

Проводили первое измерение оптической плотности контрольных и опытных проб сразу после смешивания и второе измерение после 6 часов инкубирования, определяли степень прироста количества бактерий в опыте по отношению к контролю по формуле:

П=О/К·100%,

где П - степень прироста количества бактерий в опыте относительно контроля, %;

О - прирост количества бактерий в опытной пробе;

К - прирост количества бактерий в контрольной пробе;

О = изменение оптической плотности бактерий в опыте между 2 и 1 измерениями;

К = изменение оптической плотности бактерий в контроле между 2 и 1 измерениями.

Результаты представлены в таблице 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что эпителиальные супернатанты способны как подавлять, так и стимулировать ростовые свойства бактерий. При этом ростовые свойства аллохтонных для данного биотопа видов (S.aureus, E.coli) подавлялись большинством эпителиальных супернатантов, а ростовые свойства лактобактерий - доминантного представителя нормофлоры влагалища в большинстве случаев стимулировались.

Антагонистичекую активность бактерий контрольных и опытных проб определяли согласно известной методике (Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксп. биол. мед 2007; 11: 545-48).

Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, влияние внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов на лактобактерии и коринебактерии приводило к стимулированию их антагонистической активности в отношении S.aureus и E.coli. Влияние внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов на взаимную антагонистическая активность S.aureus и E.coli было либо индифферентным, либо подавляющим.

Таким образом, вагинальные эпителиоциты способны, посредством внеклеточных секреторных продуктов, оказывать дифференцированное влияние на антагонистическую активность и ростовые свойства бактерий.

На втором этапе исследования изучали влияние на ростовые свойства бактерий контактного эпителиально-бактериального взаимодействия. Для этого вагинальные эпителиоциты, полученные и отмытые по аналогии с первым этапом исследования, инактивировали 0,4% раствором формалина в течение 15 мин, с последующим пятикратным отмыванием забуференным физиологическим раствором и доводили до концентрации 10⁶ кл/мл. Отдельно в мясопептонном или MRS бульоне готовили взвесь, содержащую 10⁶ КОЕ/мл из суточной культуры S.aureus, E.coli, Lactobacilus. spp., выделенных из репродуктивного тракта женщин. Бактериальную взвесь смешивали с инактивированными эпителиоцитами (в опыте) и физиологическим раствором (в контроле) в соотношении 10:1 и инкубировали в течение 6 часов при 37°С, периодически помешивая. Затем производили высев из опытной и контрольной проб на соответствующую плотную питательную среду, используя метод серийных разведений, подсчитывали КОЕ и определяли степень прироста количества бактерий в опыте.

Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, при контактном взаимодействии лактобактерий с вагинальными эпителиоцитами в большинстве случаев наблюдается стимуляция роста бактерий, реже происходит слабовыраженное подавление роста. В отношении S.aureus и E.coli, напротив, преобладает подавление ростовых свойств.

Антагонистичекую активность бактерий контрольных и опытных проб определяли согласно известной методике (Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксп. биол. мед 2007; 11: 545-48). Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, контактное взаимодействие бактерий с инактивированными вагинальными эпителиоцитами оказывало стимулирующее воздействие на антагонистическую активность лактобактерий и коринебактерий в отношении S.aureus и E.coli.

Проведенные авторами эксперименты показали, что контактное взаимодействие вагинальных эпителиоцитов с бактериями способно оказывать дифференцированное влияние на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий.

Таким образом, экспериментально установлена способность вагинальных эпителиоцитов дифференцировано влиять на ростовые свойства и антагонистическую активность различных видов бактерий как контактно, так и посредством своих супернатантов. Результирующей этого влияния является создание селективных преимуществ для конкретного доминантного микросимбионта путем стимуляции его ростовых свойств на фоне подавления прироста биомассы минорных симбионтов.

Способ по варианту 1 осуществляется следующим образом.

1. С боковых стенок влагалища ложечкой Фолькмана получают вагинальные эпителиоциты.

2. Полученые вагинальные эпителиоциты освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением 50 мкг/мл антибиотика и 10 мкг/мл лизоцима, и трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора.

3. Затем инкубируют вагинальные эпителиоциты в среде Хенкса при 37°С в течение 4 часов.

4. Эпителиальный супернатант получают фильтрованием четырехчасовой культуральной жидкости эпителиоцитов.

5. Из суточной культуры исследуемых бактерий на питательном бульоне готовят микробную взвесь, содержащую 10⁶ КОЕ/мл, и смешивают ее с эпителиальным супернатантом в соотношении 7:1.

6. Параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и среды для культивирования эпителиоцитов в соотношении 7:1.

7. Опытную и контрольную пробы инкубируют в течение 4-6 часов при 37°С периодически помешивания.

8. Проводят измерение величины биологических свойств бактерий, таких как ростовые свойства и/или антагонистическая активность, в опытной и контрольной пробах, в соответствии с известными методиками определения этих биологических свойств.

9. Рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной по формуле:

П=О/К·100%,

где П - степень изменения биологического свойства, %;

О - величина биологического свойства в опытной пробе;

К - величина биологического свойства в контрольной пробе;

и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий.

Способ по варианту 2 осуществляется следующим образом.

1. С боковых стенок влагалища ложечкой Фолькмана получают вагинальные эпителиоциты.

2. Инактивируют вагинальные эпителиоциты 0,4% раствором формалина в течение 15 мин, с последующим пятикратным отмыванием забуференным физиологическим раствором (pH 7,0-7,2) и доводят до концентрации 10⁶ кл/мл.

3. Из суточной культуры исследуемых бактерий на питательном бульоне готовят микробную взвесь, содержащую 10⁶ КОЕ/мл и смешивают с инактивированными эпителиоцитами в соотношении 10:1.

4. Параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и физиологического раствора в соотношении 10:1.

5. Опытную и контрольную пробы инкубируют в течение 4-6 часов при 37°С периодически помешивая.

6. Проводят измерение величины биологических свойств бактерий, таких как ростовые свойства и/или антагонистическая активность, в опытной и контрольной пробах, в соответствии с известными методиками определения этих биологических свойств.

7. Рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной по формуле:

П=О/К·100%,

где П - степень изменение биологического свойства, %;

О - величина биологического свойства в опытной пробе;

К - величина биологического свойства в контрольной пробе;

и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий.

П<100% - подавляющее влияние,

П=100% - индифферентное влияние,

П>100% - стимулирующее влияние.

Примеры конкретного выполнения первого варианта способа

Пример 1

Определяли влияние вагинальных эпителиоцитов на рост S. aureus.

С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получали вагинальные эпителиоциты. Для освобождения их от сопутствующей микрофлоры, эпителиоциты инкубировали в течение часа в среде Хенкса, с добавлением с добавлением 50 мкг/мл цефуроксима и 10 мкг/мл лизоцима, после чего трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора, затем после четырехчасового инкубирования отмытых эпителиоцитов в среде Хенкса, фильтрованием получили эпителиальный супернатант.

Приготовили взвесь из суточной культуры S.aureus, содержащую 10⁶ КОЕ/мл в мясо-пептонном бульоне, затем смешали взвесь бактерий с эпителиальным супернатантом в опыте, и средой Хенкса в контроле в соотношении 7:1 (700 мкл и 100 мкл). Пробы инкубировали 6 часов.

Проводили первое измерение оптической плотности контрольных и опытных проб сразу после смешивания и второе измерение после 6 часов инкубирования, по изменению оптической плотности рассчитывали прирост количества бактерий S.aureus в опытной и контрольной пробах, затем определили степень прироста количества бактерий в опыте относительно контроля по формуле:

П=О/К·100%,

где П - степень прироста количества бактерий в опыте относительно контроля, %;

О - прирост количества бактерий в опытной пробе;

К - прирост количества бактерий в контрольной пробе;

О = изменение оптической плотности бактерий в опыте между 2 и 1 измерениями = 0,198-0,108=0,09;

К = изменение оптической плотности бактерий в контроле между 2 и 1 измерениями = 0,248-0,112=0,136;

П=О/К·100%=(0,09/0,136)·100%=66%.

Степень прироста количества бактерий S.aureus составила 66%.

П<100%, следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают подавляющее влияние на рост S.aureus.

Пример 2. С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получены вагинальные эпителиоциты. Согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1, определяли влияние вагинальных эпителиоцитов на рост Staphylococcus epidermidis.

Результаты расчетов степени прироста количества бактерий S.epidermidis в опыте относительно контроля следующие:

О=0,38-0,145=0,245;

К=0,396-0,151=0,245;

П=О/К·100%=(0,245/0,245)·100%=100%.

Степень прироста количества бактерий S.epidermidis составила 100% (П=100%), следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают индифферентное влияние на рост S.epidermidis.

Пример 3. С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получены вагинальные эпителиоциты. Согласно заявляемому способу, аналогично примеру 1, определяли влияние вагинальных эпителиоцитов на рост Lactobacillus acidophilus.

Результаты расчетов степени прироста количества Lactobacillus acidophilus в опыте относительно контроля следующие:

О=0,5-0,125=0,375;

К=0,375-0,13=0,245;

П=О/К·100%=(0,375/0,245)·100%=153%

Степень прироста количества бактерий Lactobacillus acidophilus составила 153%.

П>100%, следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают стимулирующее влияние на рост Lactobacillus acidophilus.

Пример 4. Определяли влияние вагинальных эпителиоцитов на антагонистической активности бактерий.

С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получали вагинальные эпителиоциты для освобождения их от сопутствующей микрофлоры, эпителиоциты инкубировали в течение часа в среде Хенкса, с добавлением с добавлением 50 мкг/мл цефуроксима и 10 мкг/мл лизоцима, после чего трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора, затем после четырехчасового инкубирования отмытых эпителиоцитов в среде Хенкса, фильтрованием получили эпителиальный супернатант.

Приготовили взвесь из суточной культуры S.aureus, содержавшую 10⁶ КОЕ/мл в мясопептонном бульоне, затем смешали взвесь бактерий с эпителиальным супернатантом в опыте, и средой Хенкса в контроле в соотношении 7:1 (700 мкл и 100 мкл). Инкубировали 6 часов. Затем определяли антагонистическую активность S.aureus в опытной и контрольной пробе, согласно известной методике (Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С. В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксп. биол. мед 2007; 11: 545-48).

Произвели расчет степени изменения антагонистической активности у S.aureus в опытной пробе по отношению к контрольной по формуле:

П=О/К·100%,

где П - степень изменения антагонистической активности у S.aureus под влиянием эпителиоцитов, %;

О - антагонистическая активность S.aureus, в опытной пробе;

К - антагонистическая активность S.aureus, в контрольной пробе;

О=11,5%;

К=15,6%;

П=О/К·100%=11,5/15,6·100=73,7%.

Степень изменение антагонистической активности S.aureus под влиянием эпителиоцитов составила 73,7%.

П<100%, следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают подавляющее влияние на антагонистическую активность S.aureus.

Примеры конкретного выполнения второго варианта способа

Пример 5. С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получены вагинальные эпителиоциты. Отмытые эпителиоциты инактивировали 0,4% формалином в течение 15 минут, пятикратно отмыли физиологическим раствором и довели концентрацию инактивированных эпителиоцитов до 10⁶ кл/мл, затем смешали 1,0 мл бактериальной взвеси S.aureus, содержащей 10⁶ КОЕ/мл в мясопептонном бульоне с 0,1 мл взвеси инактивированных эпителиоцитов(в опыте) и с 0,1 мл физиологического раствора (в контроле) и инкубировали 6 часов при 37°С, затем произвели высев из опытной и контрольной проб на мясопептонный агар, используя метод серийных разведений, подсчитали КОЕ и определили степень прироста количества бактерий S.aureus в опыте относительно контроля по формуле:

П=(О/К)·100%,

где П - степень прироста количества бактерий под влиянием эпителиоцитов, %;

О - количество КОЕ в опыте;

К - количество КОЕ в контроле;

О=72·10⁶;

К=89·10⁶;

П=(72·10⁶/89·10⁶)·100%=80,9%.

Степень прироста количества бактерий S.aureus составила 80,9%.

П<100%, следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают подавляющее влияние на рост S.aureus.

Пример 6. С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получены вагинальные эпителиоциты. Согласно заявляемому способу, аналогично примеру 4, определяли влияние вагинальных эпителиоцитов на рост Staphylococcus epidermidis.

О=38·10⁶;

К=69·10⁶;

П=(38·10⁶/69·10⁶)·100%=55%.

Степень прироста количества бактерий Staphylococcus epidermidis составила 55%.

П<100%, следовательно вагинальные эпителиоциты оказывают подавляющее влияние на рост S.epidermidis.

Пример 7. С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получены вагинальные эпителиоциты. Согласно заявляемому способу, аналогично примеру 4, определяли влияние вагинальных эпителиоцитов на рост Lactobacillus acidophilus.

О=51·10⁶;

К=37·10⁶;

П=(51·10⁶/37·10⁶)·100%=138%.

Степень прироста количества бактерий Lactobacillus acidophilus в опыте составила 138%.

П>100%, следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают стимулирующее влияние на рост Lactobacillus acidophilus.

Пример 8. С боковой стенки влагалища пациентки О. ложечкой Фолькмана получены вагинальные эпителиоциты. Отмытые эпителиоциты инактивировали 0,4% формалином в течение 15 минут, пятикратно отмыли физиологическим раствором и довели концентрацию инактивированных эпителиоцитов до 10⁶ кл/мл, затем смешали 1,0 мл бактериальной взвеси Lactobacillus acidophilus, содержащей 10⁶ КОЕ/мл в мясопептонном бульоне с 0,1 мл взвеси инактивированных эпителиоцитов (в опыте) и с 0,1 мл физиологического раствора (в контроле) и инкубировали 6 часов при 37°С. Затем измерили антагонистическую активность бактерий Lactobacillus acidophilus в опытной и контрольной пробе, согласно известной методике (Семенов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий. Бюлл. эксп. биол. мед 2007; 11: 545-48).

Произвели расчет степени изменения антагонистической активности бактерий Lactobacillus acidophilus в опытной пробе по отношению к контрольной по формуле:

П=О/К·100%,

где П - изменение антагонистической активности бактерий под влиянием эпителиоцитов, %;

О - антагонистическая активность бактерий Lactobacillus acidophilus в опытной пробе;

К - антагонистическая активность бактерий Lactobacillus acidophilus в контрольной пробе;

О=51,5%;

К=29,6%;

П=О/К·100%=51,5/29,6·100%=173,9%.

Степень изменения антагонистической активности Lactobacillus acidophilus под влиянием эпителиоцитов составила 173,9%.

П>100%, следовательно, вагинальные эпителиоциты оказывают стимулирующее влияние на антагонистическую активность Lactobacillus acidophilus.

Предлагаемый способ определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий, такие как ростовые свойства и антагонистическую активность, позволяет определять способность эпителиоцитов регулировать биологические свойства бактерий различных таксонов за счет выявления различного влияния (стимулирующего, ингибирующего или индифферентного) эпителиальных супернатантов и/или контактного эпителиально-бактериального взаимодействия на ростовые свойства и антагонистическую активность бактерий, что важно для практической работы бактериологических лабораторий клинических учреждений для изучения механизма межклеточных взаимодействий, в частности эпителиально-бактериальных взаимодействий, и их роли в формировании нормальных микробиоценозов тела человека.

Таблица 1 Влияние внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов на ростовые свойства бактерий Степень прироста бактерий, % лактобактерии E.coli S.aureus «+» «-» «+» «-» «+» «-» 0-5 6 4 1 1 1 1 5-10 7 1 - 17 - 19 10-20 17 1 - 34 - 18 20-30 9 1 - 9 - 9 30-40 7 - - - - 14 40-50 4 - - - - - более 50 5 - - - - - итого 62 62 62 «+» - стимуляция, «-» - подавление

Таблица 2 Влияние внеклеточных секреторных продуктов вагинальных эпителиоцитов на антагонистическую активность бактерий Антагонистическая активность бактерий (% подавления роста) Контроль (n=62) Опыт (под влиянием секреторных продуктов эпителиоцитов) (n=62) Lactobacillus spp. в отношении s.aureus 27,0±0,4 41,4±1,9* в отношении e.coli 28,0±0,2 38,0±2,0* Corynebacterium spp. в отношении s.aureus 9,9±0,5 40,9±1,3* в отношении e.coli 8,6±0,6 41,0±1,4* S.aureus в отношении s.aureus 13,9±0,2 9,9±1,1* E.coli в отношении e.coli 9,0±0,2 8,0±1,3 * - различия достоверны (p≤0,05)

Таблица 3 Влияние контактного эпительно-бактериального взаимодействия на ростовые свойства бактерий Степень прироста бактерий, % лактобактерии E.coli S.aureus «+» «-» «+» «-» «+» «-» 0-5 10 10 1 1 9 7 5-10 9 4 - 24 3 10 10-20 9 3 - 25 - 27 20-30 6 - - 11 - 6 30-40 4 - - - - - 40-50 4 - - - - - более 50 3 - - - - - итого 62 62 62 «+» - стимуляция, «-» - подавление

Таблица 4 Влияние контактного эпительно-бактериального взаимодействия на антагонистическую активность бактерий Антагонистическая активность бактерий (% подавления роста) Контроль (n=62) Опыт (n=62) Lactobacillus spp. в отношении s.aureus 29,0±0,5 37,4±1,3* в отношении e.coli 31,0±0,3 39,0±1,9* Corynebacterium spp. в отношении s.aureus 16,9±0,4 26,4±1,3* в отношении e.coli 17,6±0,6 21,0±1,2* * - различия достоверны (p≤0,05)

Изобретение может быть использовано в исследовательской работе и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений для изучения механизма бактериально-эпителиальных взаимодействий и их роли в формировании нормальных микробиоценозов тела человека. Согласно первому варианту получают вагинальные эпителиоциты, освобождают их от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в среде Хенкса, с добавлением цефурасима и лизоцима, инкубируют и отделяют супернатант. Из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают ее с эпителиальным супернатантом. Параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и среды для культивирования эпителиоцитов, инкубируют, измеряют биологические свойства бактерий в опытной и контрольной пробах. Рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на биологические свойства бактерий. Согласно второму варианту получают вагинальные эпителиоциты, инактивируют их формалином, отмывают и готовят взвесь эпителиоцитов в физиологическом растворе. Из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают с взвесью инактивированных эпителиоцитов. Параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и физиологического раствора, опытную и контрольную пробы инкубируют, измеряют биологические свойства бактерий в опытной и контрольной пробах, рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на биологические свойства бактерий. Это позволяет определять способность вагинальных эпителиоцитов регулировать биологические свойства бактерий различных таксонов за счет выявления стимулирующего, ингибирующего или индифферентного влияния эпителиальных супернатантов и/или контактного эпителиально-бактериального взаимодействия на биологические свойства бактерий, что дает возможность расширить представления о формировании и поддержании микробиоценозов тела человека и разрабатывать на основе полученных знаний методические подходы к созданию новых способов и препаратов для коррекции дисбиотических состояний репродуктивного тракта женщин. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 8 пр.

1. Способ определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий такие, как ростовые свойства и антагонистическую активность, заключающийся в том, что получают вагинальные эпителиоциты, освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением 50 мкг/мл цефураксима и 10 мкг/мл лизоцима, и трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора, инкубируют и отделяют супернатант, из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают ее с эпителиальным супернатантом, параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и среды для культивирования эпителиоцитов, инкубируют, измеряют биологические свойства бактерий в опытной и контрольной пробах, рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на биологические свойства бактерий.

2. Способ определения влияния вагинальных эпителиоцитов на биологические свойства бактерий такие, как ростовые свойства и антагонистическую активность, заключающийся в том, что получают вагинальные эпителиоциты, инактивируют их 0,4%-ным раствором формалина в течение 15 мин, пятикратно отмывают физиологическим раствором и доводят концентрацию инактивированных эпитеолицитов до 10⁶ кл/мл, из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают с взвесью инактивированных эпителиоцитов, параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и физиологического раствора, опытную и контрольную пробы инкубируют, измеряют биологические свойства бактерий в опытной и контрольной пробах, рассчитывают степень изменения биологических свойств в опытной пробе по отношению к контрольной и по степени изменения судят о стимулирующем, индифферентном или подавляющем влиянии эпителиоцитов на биологические свойства бактерий.