СПОСОБ УСИЛЕНИЯ АДГЕЗИИ БАКТЕРИЙ К ВАГИНАЛЬНЫМ ЭПИТЕЛИОЦИТАМ Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано в исследовательской работе НИИ, практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений и акушерско-гинекологической практике в биотехнологических и медицинских целях для усиления адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам, в том числе для колонизации пробиотическими штаммами вагинального биотопа при лечении дисбиотических и воспалительных состояний репродуктивного тракта женщин, а также для создания моделей инфекционного процесса.

Адгезия - это общебиологическое явление, известное как свойство микроорганизмов фиксироваться на поверхностях различной природы [Beachey EH. Bacterial adherence: adhesin-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surfaces. J Infect Dis 1981; 143: 325-45].

Для патогенных микроорганизмов адгезия - необходимое явление для начала инфекционного процесса, позволяющее в дальнейшем реализовать весь спектр своих патогенных свойств, направленных на обеспечение жизнедеятельности в условиях макроорганизма [A. Swidsinski, W. Mendling, V. Loening-Baucke, et al., ″Adherent biofilms in bacterial vaginosis, ″Obstetrics & Gynecology, vol. 106, no. 5, part 1, pp.1013-1023, 2005].

Адгезия для пробиотических микроорганизмов - основное свойство, необходимое для заселения определенного биотопа и реализации всех антагонистических свойств по отношению к патогенным микроорганизмам [С. Forestier, С. De Champs, С. Vatoux, and В. Joly, ″Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties,″ Research in Microbiology, vol. 152, no. 2, pp.167-173, 2001, M.E. Falagas, G.I. Betsi, and S. Athanasiou, ″Probioticsfor the treatment of women with bacterial vaginosis,″ Clinical Microbiology and Infection, vol. 13, no. 7, pp.657-664, 2007].

Считается, что пробиотические штаммы благодаря адгезии блокируют рецепторы эукариотических клеток, делая их недоступными для связывания с патогенными микроорганизмами [L. Petricevic and A. Witt, ″The role of Lactobacillus casei rhamnosus Lcr35 in restoring the normal vaginal flora after antibiotic treatment of bacterial vaginosis,″ BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology, vol. 115, no. 11, pp.1369-1374, 2008]. Поэтому для достижения устойчивого терапевтического эффекта необходимо в первую очередь усилить адгезию пробиотических штаммов.

По данным литературы ключевую роль в адгезии бактериальной клетки могут играть белки межклеточного матрикса, в частности фибронектин [Henderson В, Nair S, Pallas J, Williams MA. Fibronectin: a multidomain host adhesion targeted by bacterial fibronectin-binding proteins. FEMS Microbiol Rev 2011: 35: 147-200, Vercellotti GM, McCarthy JB, Peterson PK, Jacob HS, Furcht LT. Extracellular matrix proteins (fibronectin, laminin, and type IV collagen) bind and aggregate bacteria - a review. Amer J Pathology 1985; 120 (1): 13-21]. Данный белок может выступать посредником между бактериальной клеткой и эпителиоцитом, тем самым обеспечивать прочность адгезии.

Наиболее часто интенсивность адгезии оценивается индексом адгезии - средним количеством микробных клеток, находящихся на одном эпителиоците, и показателем адгезии - количеством эпителиоцитов, участвующих в процессе адгезии, по отношению к общему количеству эпителиоцитов, учтенных в процессе адгезии. Чем больше микробов адсорбировано на клетке и чем больше эпителиоцитов задействовано в процессе адгезии, тем больше адгезивная способность бактерий.

Известен способ определения адгезии бактерий к эпителиоцитам [Sandra Romero-Steiner, Thomas Witek, Edward Balish. Adherence of bacteria to human epithelial cells. J Vlinical Microb 1990; 1: 27-31].

Также известен способ определения адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам [А.Г. Бойцов, С.В. Рищук, Ю.Ю. Ильясов, Т.А. Гречанинова Адгезия лактобактерий к клеткам вагиналъного и буккального эпителия // Вестник Санкт-Петербургской Медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2004. - №4 (5) - С.191-193].

Известен способ определения адгезии бактерий, в том числе пробиотиков к фибронектину [Munoz-Provencio D, Perez-Martinez G, Monedero V., Characterization of a fibronectin-binding protein from Lactobacillus casei BL23.//J Appi Microbiol. 2010 Mar; 108 (3): 1050-9, Styriak, I., Nemcova, R., Chang, Y.H. and Ljungh, A. Binding of extracellular matrix molecules byprobiotic bacteria. Lett Appi Microbiol 2003; 37: 329-333].

Существуют способы усиления бактериальной адгезии к полиуретану, поливинилхлориду и стеклу [Mohammad SF, Topham NS, Burns GL, Olsen DB. Enhanced bacterial adhesion on surfaces pretreated with fibrinogen and fibronectin.// ASAIO Trans. 1988 Jul-Sep; 34 (3): 573-7], а также к поверхности титана после обработки последних фибриногеном и фибронектином [Mahmoud H, Williams DW, Hannigan A, Lynch CD. Influence of extracellular matrix proteins in enhancing bacterial adhesion to titanium surfaces.// J Biomed Mater Res В Appi Biomater. 2012 Jul; 100 (5): 1319-27]. Однако вышеописанные способы основаны на усилении адгезии бактерий к искусственным материалам и не могут быть экстраполированы на клетки микроорганизма, поскольку последние имеют рецепторный аппарат («сайты» адгезии), являющиеся местом прикрепления как фибронектина, так и бактерий. Поэтому обнаружение усиления адгезии к эпителиоцитам с применением фибронектина требует дополнительных исследований и разработки специального метода.

Актуальность разработки способа усиления адгезии микроорганизмов к вагинальным эпителиоцитам обусловлена необходимостью усилить адгезию микроорганизмов, что может быть использовано для различных биотехнологических и медицинских целей, в том числе и для колонизации пробиотическими штаммами вагинального биотопа при лечении дисбиотических и воспалительных состояний репродуктивного тракта женщин, а также для создания моделей инфекционного процесса.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании способа, позволяющего за счет добавления к вагинальным эпителиоцитам раствора фибронектина в концентрации 40 мкг/мл усилить адгезию бактерий к вагинальным эпителиоцитам.

Для достижения указанного технического результата в заявляемом способе усиления адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам получают вагинальные эпителиоциты, освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса с добавлением 50 мкг/мл цефтриаксона и 10 мкг/мл лизоцима, трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора, готовят взвесь в концентрации 5×10⁶ кл/мл на буферном растворе, смешивают с раствором фибронектина в концентрации 40 мкг/мл стабилизированным буферным раствором, инкубируют, двухкратно отмывают неадсорбированный фибронектин трехкратным объемом буферного раствора, из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают ее с эпителиоцитами, обработанными фибронектином, параллельно готовят контроль из взвеси исследуемых бактерий и эпителиоцитов, не обработанных фибронектином, инкубируют, отмывают неадсорбированные бактериальные клетки трехкратным объемом буферного раствора, готовят мазки, подсчитывают количество прикрепившихся бактериальных клеток к поверхности каждой эпителиальной клетки в опыте и контроле, рассчитывают индекс адгезии и показатель адгезии в опыте и контроле, по степени изменения индекса и показателя адгезии в опыте по отношению к контролю судят об усилении адгезии исследуемых бактерий к эпителиоцитам.

Технический результат от реализации изобретения выражается в создании способа усиления адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам, основанного на увеличении индекса адгезии в среднем не менее чем на 13,8±1,5 адгезированных бактерий в перерасчете на один эпителиоцит и увеличении показателя адгезии в среднем на 48,4% эпителиоцитов, участвующих в процессе адгезии, за счет добавления раствора фибронектина к последним.

Новым в заявляемом способе является выявленное усиление адгезии бактерий к эпителиоцитам и увеличение количества эпителиоцитов, участвующих в процессе адгезии после предварительной обработки последних фибронектином. Достижение технического решения иллюстрируется таблицами 1, 2.

Авторами было проведено исследование, направленное на выявление усиления адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам, обработанным фибронектином.

В исследовании использовался фибронектин человека в концентрации 40 мкг/мл (Becton Dickinson). Готовили рабочий раствор фибронектина на цитратно-фосфатном буфере pH 4.5. Для проведения исследования получали вагинальные эпителиоциты с бокового свода влагалища здоровых женщин, освобождали их от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса, с добавлением антибиотика цефтриаксона и лизоцима, трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора, после чего готовили взвесь с концентрацией 5×10⁶ кл/мл на цитратно-фосфатном буфере pH 4,5.

Для исследования использовали культуры Corynebacterium spp., Lactobacillus spp., E. coli и S. aureus вагинального происхождения, выделенные из коллекции ИКВС УрО РАН. Культуры Corynebacterium spp., E. coli, S. aureus выращивали в мясопептонном бульоне, Lactobacilus. spp в MRS бульоне при 37°C в течение 24 часов. Бактериальные клетки отмывали от жидкой питательной среды путем двукратного центрифугирования (3000g в течение 15 минут) и отбора надосадочной жидкости. Из отмытых бактериальных клеток готовили взвеси в концентрации 10⁸ кл/мл в цитратно-фосфатном буфере pH 4,5.

Для усиления бактериальной адгезии в опытную пробирку вносили 600 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл раствора фибронектина, в контрольную - 600 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл буферного раствора, на котором готовили фибронектин. Взвеси инкубировали при 37°C в течение часа с периодическим повторным перемешиванием. После инкубации не адсорбированный фибронектин удаляли путем двукратного отмывания контрольных и опытных пробирок центрифугированием (1000 об/мин в течение трех минут) и отбора надосадочной жидкости. В опытные и контрольные пробирки добавляли по 600 мкл микробной взвеси культуры Corynebacterium spp. (E. coli, S. aureus, Lactobacilus spp.). Полученные смеси инкубировали при 37°C в течение двух часов с периодическим повторным перемешиванием взвеси. После инкубации не адсорбированные бактериальные клетки удаляли из опытных и контрольных пробирок путем двухкратного центрифугирования (1000 об/мин в течение трех минут) и отбора надосадочной жидкости.

Из осадка готовили мазки, которые после фиксации окрашивали по Граму. При микроскопии препарата подсчитывали количество бактериальных клеток, прикрепившихся к поверхности каждой эпителиальной клетки. В каждом препарате анализировали не менее 20 эпителиальных клеток.

Подсчитывали индекс адгезии и показатель адгезии в опыте и в контроле по формулам:

1. Иа=A/B,

где Иа - Индекс адгезии - среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эпителиоците.

А - общее количество бактерий, адгезированных на эпителиоцитах.

В - общее количество эпителиоцитов, участвующих (подсчитанных) в процессе адгезии.

2. Па=В/С·100%,

где Па - показатель адгезии - доля эпителиоцитов участвующих в адгезии, %

В - количество эпителиоцитов, участвующих в адгезии

С - общее количество эпителиоцитов.

Наблюдали увеличение индекса и показателя адгезии в опыте по сравнению с контролем. Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Изменение индекса адгезии бактерий после обработки вагинальных эпителиоцитов фибронектином Вид микроорганизма ИА (контроль, без фибронектина), M±m ИА (опыт, с фибронектином), M±m С. minutissimum №9 14,9±3,4 26,6±3,1 С. minutissimum №24 16,7±2,9 25,4±3,8 С. amycolatum №91 13,6±2,4 31,8±3,9 Lactobacillus spp. 9,4±3,7 27,3±3,4 E. coli 10,5±3,2 24,7±3,9 S. aureus 11,4±2,7 23,5±2,9

Таблица 2 Изменение показателя адгезии бактерий после обработки вагинальных эпителиоцитов фибронектином Вид микроорганизма ПА (контоль, без фибронектина), M±m ПА (опыт, с фибронектином), M±m С. minutissimum №9 33,3±4,4 71,7±7,3 С. minutissimum №24 30,0±2,9 83,3±3,3 С. amycolatum №91 28,3±1,7 68,3±4,4 Lactobacillus spp. 31,7±8,8 81,7±6,0 E. coli 21,4±3,9 79,7±4,7 S. aureus 26,9±5,3 77,4±6,2

Полученные результаты указывают на усиление адгезии 100% бактерий к вагинальным эпителиоцитам после добавления к последним фибронектина. Индекс адгезии, составлявший в контроле 9,4-16,7, увеличивался в опыте до 23,5-31,8 адгезированных бактерий в перерасчете на один эпителиоцит, показатель адгезии в контроле, находившийся в диапазоне 21,4-33,3%, увеличивался в опыте до 68,3-83,3% эпителиоцитов, участвующих в процессе адгезии.

С практической точки зрения увеличение адгезии бактерий к эпителиоцитам после обработки последних фибронектином может быть использовано для различных биотехнологических и медицинских целей, в том числе и для усиления колонизации пробиотическими штаммами вагинального биотопа при лечении дисбиотических и воспалительных состояний репродуктивного тракта женщин, а также для создания моделей инфекционного процесса.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Готовят рабочий раствор фибронектина в концентрации 40 мкг/мл на цитратно-фосфатном буфере pH 4.5. С боковых стенок влагалища конкретной пациентки ложечкой Фолькмана забирают вагинальные эпителиоциты.

2. Полученые вагинальные эпителиоциты освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса с добавлением 50 мкг/мл антибиотика и 10 мкг/мл лизоцима и трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора.

3. Готовят взвесь эпителиоцитов в цитратно-фосфатном буфере pH 4,5 в концентрации 5×10⁶ кл/мл.

4. Суточную культуру исследуемых штаммов микроорганизмов двукратно отмывают путем центрифугирования (3000g в течение 15 минут) и отбора надосадочной жидкости, готовят взвесь с концентрацией 10⁸ кл/мл в цитратно-фосфатном буфере pH 4,5.

5. В пробирку вносят 600 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл раствора фибронектина в концентрации 40 мкг/мл.

6. Инкубируют при 37°C в течение часа с периодическим повторным перемешиванием путем переворачивания пробирок.

7. После инкубации не адсорбированный фибронектин удаляют путем двухкратного центрифугирования и отбора надосадочной жидкости (1000 об/мин в течение трех минут).

8. Добавляют 600 мкл микробной взвеси к осадку эпителиоцитов и инкубируют в течение двух часов при 37°C периодически помешивая.

9. После инкубации неадгезированные бактериальные клетки удаляют путем двухкратного центрифугирования и отбора надосадочной жидкости (1000 об/мин в течение трех минут).

10. Из осадка готовят мазки, которые после фиксации окрашивают по Граму.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1

Проводили усиление адгезии штамма С. minutissimum №9 к вагинальным эпителиоцитам.

Готовили рабочий раствор фибронектина в концентрации 40 мкг/мл на цитратно-фосфатном буфере pH 4.5. Для проведения исследования получали вагинальные эпителиоциты с бокового свода влагалища пациентки Н., освобождали их от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в течение часа в среде Хенкса с добавлением 50 мкг/мл антибиотика и 10 мкг/мл лизоцима и трехкратно отмывали десятикратным объемом физиологического раствора, после чего готовили взвесь с концентрацией 5×10⁶ кл/мл на цитратно-фосфатном буфере pH 4,5. Культуры С. minutissimum №9, выращивали в мясопептонном бульоне, бульоне при 37°C в течение 24 часов. Бактериальные клетки отмывали от жидкой питательной среды путем центрифугирования (3000g в течение 15 минут) и отбора надосадочной жидкости. Из отмытых бактериальных клеток готовили взвеси в концентрации 10⁸ кл/мл в цитратно-фосфатном буфере pH 4,5.

Для усиления бактериальной адгезии в опытную пробирку вносили 600 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл раствора фибронектина, в контрольную - 600 мкл суспензии эпителиальных клеток и 600 мкл буферного раствора, на котором готовили фибронектин. Взвеси инкубировали при 37°C в течение часа с периодическим повторным перемешиванием. После инкубации не адсорбированный фибронектин удаляли путем двухкратного отмывания опытных и контрольных пробирок центрифугированием и отбором надосадочной жидкости (1000 об/мин в течение трех минут). Объем взвеси эпителиоцитов доводили до 600 мкл: к осадку отмытых эпителиоцитов добавляли 600 мкл цитратно-фосфатного буфера. В опытные и контрольные пробирки добавляли по 600 мкл микробной взвеси культуры С. minutissimum Ns 9. Полученные смеси инкубировали при 37°C в течение двух часов с периодическим перемешиванием. После инкубации неадсорбированные бактериальные клетки из опытной и контрольной пробирки удаляли путем двухкратного центрифугирования (1000 об/мин в течение трех минут).

Из осадка готовили мазки, которые после фиксации окрашивали по Граму.

При микроскопии препарата подсчитывали количество бактериальных клеток, прикрепившихся к поверхности каждой эпителиальной клетки. В каждом препарате анализировали не менее 20 эпителиальных клеток. Рассчитывали индекс и показатель адгезии в опыте и контроле по формуле:

1. Иа=А/В,

где Иа - Индекс адгезии - среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эпителиоците.

А - общее количество бактерий адгезированных на эпителиоцитах;

В - общее количество эпителиоцитов, подсчитанных как участвующих в процессе адгезии:

А (в опыте)=532 бактериальных клеток;

В=20 эпителиоцитов;

Иа (опыт)=532/20=26,6

А (в контроле)=298 бактериальных клеток;

В=20 эпителиоцитов;

Иа (контроль)=298/20=14,9.

Прирост индекса адгезии ΔИА=ИА (опыт) - ИА (контроль)

ΔИА=26,6-14,9=11,7.

Увеличение индекса адгезии в опыте по-сранению с контролем составил на 11,7 бактериальных клеток на один эпителиоцит.

2. Па=В/С×100%,

где ПА - показатель адгезии - доля эпителиоцитов участвующих в адгезии, %;

В - количество эпителиоцитов, участвующих в адгезии;

С - общее количество эпителиоцитов;

В=6, С=20;

Па (в контроле)=(6/20)×100%=30%;

В=11, С=20 Па (в опыте)=(14/20)х100%=70%;

ΔПА=ПА (опыт)-ПА (контроль);

ΔПА=70%-30%=40%.

Увеличение показателя адгезии в опыте по сравнению с контролем составило 40%.

Увеличение индекса адгезии составило на 11,7 бактериальных клеток в перерасчете на один эпителиоцит, показателя адгезии - на 40%, следовательно произошло усиление адгезии исследуемого штамма. Полученные данные свидетельствуют об усилении адгезии исследуемого штамма к вагинальным эпителиоцитам после обработки последних фибронектином.

Пример 2

Проводили усиление адгезии штамма Lactobacillus spp. к вагинальным эпителиоцитам согласно заявляемому способу аналогично примеру 1.

Результаты расчетов степени прироста количества бактерий S. epidermidis в опыте относительно контроля следующие:

Иа (опыт)=546/20=27,3 бактер. кл./эпителиоцит;

Иа (контроль)=188/20=9,4 бактер. кл./эпителиоцит;

ΔИА=27,3-9,4=17,9.

Увеличение индекса адгезии на 17,9 бактериальных клеток в перерасчете на один эпителиоцит.

Па (опыт)=(6/20)×100%=30%;

Па (контроль)=(16/20)×100%=80%;

ЛПA=80%-30%=50%.

Увеличение индекса адгезии составило на 17,9 бактериальных клеток в перерасчете на один эпителиоцит, показателя адгезии - на 50%, следовательно, произошло усиление адгезии исследуемого штамма. Полученные данные свидетельствуют об усилении адгезии исследуемого штамма к вагинальным эпителиоцитам после обработки последних фибронектином.

Изобретение относится к микробиологии. Предлагается способ усиления бактериальной адгезии к вагинальным эпителиоцитам. Получают вагинальные эпителиоциты, освобождают их от сопутствующей микрофлоры, инкубируя в среде Хенкса с добавлением цефтриаксона и лизоцима. Эпителиоциты отмывают физиологическим раствором и готовят взвесь в цитратно- фосфатном буфере, смешивают с раствором фибронектина, стабилизированным буферным раствором. Инкубируют, отмывают неадсорбированный фибронектин буферным раствором. Из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают ее с эпителиоцитами, обработанными фибронектином. Об усилении адгезии бактерий к вагинальным эпителиоцитам судят по увеличению индекса и показателя адгезии в опыте по сравнению с контролем. Изобретение позволяет усилить адгезию бактерий к вагинальным эпителиоцитам. 2 табл., 1 пр.

Способ усиления бактериальной адгезии к вагинальным эпителиоцитам, заключающийся в том, что получают вагинальные эпителиоциты, освобождают от сопутствующей микрофлоры, инкубируют в течение часа в среде Хенкса с добавлением 50 мкг/мл цефтриаксона и 10 мкг/мл лизоцима, трехкратно отмывают десятикратным объемом физиологического раствора, готовят взвесь в концентрации 5×10⁶ кл/мл на буферном растворе, смешивают с раствором фибронектина, стабилизированным буферным раствором, инкубируют, трехкратно отмывают неадсорбированный фибронектин трехкратным объемом буферного раствора, из суточной культуры исследуемых бактерий готовят микробную взвесь и смешивают ее с эпителиоцитами, обработанными фибронектином.