СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ ГЕНОВ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ МЕТОДОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ДИСПЛЕЯ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 C12N1/20 C12N15/10 

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной генетике микроорганизмов и касается способов выявления экспрессирующихся генетических детерминант патогенных микроорганизмов рода Burkholderia с использованием реакций обратной транскрипции и сопряженной амплификации (ОТ-ПЦР) для их последующего структурно-функционального анализа, что, в свою очередь, позволит оценить влияние адаптационных изменений клеток при изменении условий внешней среды на выраженность важнейших биологических характеристик микроорганизмов, в частности вирулентности и устойчивости к антимикробным препаратам.

Метод дифференциального дисплея матричных РНК изначально был предложен для идентификации дифференциально экспрессирующихся генов эукариот в ОТ-ПЦР с различными наборами олигонуклеотидных праймеров для этапов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (Ogawa Н., Fukushima К., Sasaki I., Matsuno S. Identification of genes involved in mucosal defense and inflammation associated with normal enteric bacteria // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. - 2000. - Vol.279. - P.492-499). При обратной транскрипции эукариотической мРНК, как правило, используют олиго-dT праймеры, комплементарные полиаденилированным участкам стартовых последовательностей мРНК. Отсутствие у прокариот полиаденилированной последовательности в составе мРНК и низкая степень гомологии мРНК генов различного функционального назначения создают известные трудности при конструировании специфических олигонуклеотидных затравок для этапа ОТ в анализе экспрессии бактериальных генов. Для обратной транскрипции всего пула бактериальных мРНК чаще всего используют либо набор произвольных 6-10-членных олигонуклеотидов, либо, и заметно реже, в качестве праймеров используются более протяженные ген-специфические последовательности (Brzostowicz Р.С., Walters D.M., Thomas S.M., Nagarajan V., Rouviere P.E. mRNA differential display in a microbial enrichment culture: simultaneous identification of three cyclohexanone monooxygenases from three species // Appl Environ Microbiol. - 2003. - Vol.69. - P.334-342; Chia J.S., Lee Y.Y., Huang P.T. et al. Identification of stress-responsive genes in Streptococcus mutans by differential display reverse transcription-PCR // Infect Immun - 2001. - Vol.69. - P.2493-501).

Наиболее близким решением является технология дифференциального дисплея, предложенная Chia et al. (Chia J.S., Lee Y.Y., Huang P.T. et al. Identification of stress-responsive genes in Streptococcus mutans by differential display reverse transcription-PCR // Infect Immun - 2001. - Vol.69. - P.2493-501.) Культуру S. mutans выращивали при 37°С в бульоне BHI (Difco, USA) pH 7.5 с добавлением 20 mM глюкозы до ранней логарифмической фазы роста. Клетки концентрировали центрифугированием (3g 15 мин), отмывали в стерильном растворе Nad (0.16 M), засевали в свежий BHI-бульон с 20 mM глюкозы, pH 7.5 и выращивали 30 мин при 37°С.

В дальнейшем клетки S. mutans осаждали центрифугированием и осадок ресуспендировали в 200 мл ТЕ-буфера (Трис-ЭДТА), содержавщего 5 мг/мл лизоцима. Выдерживали 30 мин на льду, затем добавляли 20 мл 10% SDS и кипятили 2 минуты. От клеточного дебриса избавлялись центрифугированием. Из супернатанта выделяли РНК при помощи Ultraspec RNA isolation reagent (Biotech Laboratories, USA). После переосаждения РНК этанолом в присутствии 0,3М ацетата натрия, осадок растворяли в 100 мл ТЕ-буфера. Полученный препарат РНК обрабатывали DNase I (Gibco BRL, USA) и вновь переосаждали этанолом. Полученные пробы РНК анализировали в блоттинг-гибридизации.

Синтез кДНК проводили 1 час при 37°С в реакционной смеси: 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM KCl, 8 mM MgCl2, 20 mM дитиотреитол, по 2 mM dNTP, 1 mM праймера и 5 U MmIV обратной транкриптазы (Stratagene, USA). Полученную кДНК использовали в ПЦР с внесением метки [a-33P]dATP (2000 Ci/mmol). Продукты ОТ-ПЦР анализировали в стандартном секвенирующем полиакриламидном геле и визуализировали авторадиографией.

Предложенная авторами прототипа технология дифференциального дисплея на этапе выделения РНК предполагает неоднократное центрифугирование живых бактериальных клеток, что при работе с возбудителем I-II группы патогенности (опасности) требует дополнительных мер защиты. Кроме того, в описанной технологии используются радиоизотопные методы анализа, для чего требуются специализированные помещения, оборудование и утилизация отходов.

Очевидно, что для расшифровки функциональной значимости экспрессирующихся генетических детерминант патогенных Burkholderia необходима простая эффективная технология, отвечающая требованиям биологической безопасности в соответствии с Санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03.

Целью изобретения является разработка высокочувствительного и воспроизводимого способа выявления экспрессирующихся последовательностей генома патогенных Burkholderia при различных условиях внешней среды с использованием реакций обратной транскрипции и сопряженной амплификации (ОТ-ПЦР).

Цель достигается тем, что 24-часовую агаровую бактериальную культуру исследуемого штамма возбудителя мелиоидоза либо иного вида патогенных буркхольдерий суспендируют в 0.15 М NaCl до плотности 2×10⁹ м.к./мл, добавляют равный объем предварительно прогретого при 37°С Nutrient бульона (Difco) и подращивают в течение 60 мин при 37°С. Далее к бульонной культуре добавляют мертиолят натрия до концентрации 1:10000 и прогревают 30 мин при 56°С. РНК изолируют из 200 мкл обеззараженной бульонной культуры, используя набор «Рибосорб» (Интерлабсервис, Россия). От примеси ДНК избавляются с помощью RQ1 DNAse (Promega, USA) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученный препарат тотальной РНК используют для получения кДНК в реакции обратной транскрипции с 14-членным праймером mrna_burkh (GGGGAACGACGATG), гомологич-ным фрагменту консенсус-последовательности стартовых участков мРНК, включающих в себя инициирующий кодон ATG и полипуриновую область сайта связывания с рибосомой (последовательность Shine-Dalgamo).

Реакцию обратной транскрипции проводят в течении 60 мин при 37°С в объеме 35 мкл. В состав реакционной смеси 100 нг тотальной РНК, 1 mM каждого dNTP, 200 µМ праймера, 40 ед. обратной транскриптазы M-MulV (Fermentas, Латвия), 1× реакционный буфер для обратной транскрипции (Fermentas, Латвия), 20 ед. ингибитора рибонуклеаз (Fermentas, Латвия). ОТ останавливают прогреванием при 70°С в течение 10 мин, далее 10 мкл продуктов реакции используют для постановки ПЦР с тем же праймером. Состав реакционной смеси: 1× ПЦР-буфер (Интерлабсервис, Россия), 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM каждого dNTP, 0.015 µМ праймера, 1 ед. ДиаТак ДНК-полимеразы (Интерлабсервис, Россия), используя программу амплификации: прогрев 94°С 2 мин; 40 реакционных циклов (94°С - 45 с, 40°С - 60 с, 72°С - 60 с); финальная элонгация 72°С 7 мин.

Для анализа продуктов амплификации используют электрофорез в 1.5-2% агарозных гелях или денатурирующем 6% полиакриламидном геле с 7.0 М мочевины. В последнем случае образцы ДИК смешивают с равным объемом буфера для нанесения (10 mM NaOH, 95% формамид, 0.05% бромфеноловый синий, 0.05% ксиленцианол FF), прогревают при 94°С 2 мин, охлаждают на льду и немедленно наносят на гель. Электрофорез проводят при постоянной мощности 10 Вт и термостатировании при 50°С приблизительно 1.5 ч. Полиакриламидные гели окрашивают серебром по Bassam В.J. (Bassam B.J., Caetano-Anolles G., GresshoffP.M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels // Anal Biochem - 1991. - Vol.196. - P.80-83).

Полученные таким образом продукты реакции являются кДНК всего пула матричных РНК, имеющихся в клетке на момент начала анализа, имеют достаточную концентрацию и пригодны для выявления интересуемых экспрессирующихся последовательностей генома методом ПЦР с ген-специфическими праймерами.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Подбор методов и условий выделения матричной РНК.

Бактериальную культуру исследуемого штамма возбудителя мелиоидоза выращивают 24 часа при 37°С на агаровой среде, содержащей кислотный гидролизат казеина и дрожжевой экстракт. Выращивание культуры в течение двух и трех суток не используют, в связи с сильным аутолизом микробных клеток. Из суточной агаровой культуры готовят взвесь в 0.15 М NaCl плотностью 2×10⁹ м.к./мл, добавляют равный объем предварительно прогретого при 37°С Nutrient бульона (Difco) и подращивают в течение 60 мин при 37°С. Более длительное подращивание нецелесообразно, поскольку необходима культура в ранней логарифмической фазе роста. В более поздних фазах роста бактерий транскрибируемая мРНК транслируется с меньшей интенсивностью и, соответственно, возрастает скорость ее деградации, что снижает выход мРНК до недетектируемого уровня.

РНК изолируют из 200 мкл бульонной культуры, обработаной мертиолятом натрия (1:10000, 30 мин при 56°С), используя набор «Рибосорб» (Интерлабсервис, Россия). От примеси ДНК препараты очищают с помощью RQ1 DNAse (Promega), в соответствии с рекомендациями производителя.

Эффективность выделения мРНК можно проконтролировать реакцией ОТ и последующей амплификацией с использованием праймера mrna-burkh (0.4 мкМ) при параметрах: прогрев 94°С 2 мин, 40 реакционных циклов (94°С 45 с, 40°С 60 с, 72°С 60 с), удлинение цепи 72°С 7 мин.

Рис.1. Оценка эффективности выделения МРНК реакцией ОТ с последующей амплификацией с использованием праймера mrna-burkh. Электрофорез в денатурирующем ПААГ. Обозначения: М - маркерная ДНК (сверху вниз: 2645, 1605, 1198, 676, 517, 460, 396, 350 п.н.); 1 - B. pseudomallei 56770; 2 - B. pseudomallei 56770 SMPC; 3 - B. pseudomallei 56770 SMCP; 4 - B. pseudomallei 56770 SMOC.

Пример 2. Выбор праймеров для проведения реакций обратной транскрипции.

Оценивают эффективность реакции ОТ при использовании в качестве праймера смеси произвольных гексануклеотидов и олигонуклеотида mrna_burkh (GGGGAACGACGATG).

В качестве матрицы используют препараты РНК, выделенные из культур штамма возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei 56770 и его полирезистентных производных В. pseudomallei 56770 SMPC, B. pseudomallei 56770 SMCP и В. pseudomallei 56770 SMOC, выращенных на питательных средах, не содержащих селективных добавок.

ОТ-ПЦР с произвольными гексануклеотидами и праймером mrna-burkh оказалась положительной в обоих случаях, при этом полученные транскрипционные профили заметно отличны друг от друга.

Транскрипционные профили исследуемых штаммов при использовании на этапе ОТ произвольных гексануклеотидов оказались практически несопоставимы между собой, тогда как применение праймера mrna-burkh на этапах ОТ и ПНР позволило получить сопоставимые друг с другом спектры транскриптов (рис.2).

Рис.2. Анализ продуктов ОТ-ПЦР при использовании в обратной транскрипции произвольных гексануклеотидов (А) и праймера mrna-burkh (В). Электрофорез в денатурирующем ПААГ. Обозначения: М - маркерная ДНК (сверху вниз: 2645, 1605, 1198, 676, 517, 460, 396, 350 п.н.); 1 - B. pseudomallei 56770; 2 - B. pseudomallei 56770 SMPC; 3 - B. pseudomallei 56770 SMCP; 4 - B. pseudomallei 56770 SMOC.

Пример 3. Анализ экспрессии последовательностей, входящих в состав интегроноподобных элементов у В. pseudomallei.

Из клеток штамма В. pseudomallei 140, выращенных на питательных средах без антибиотиков, и средах, содержащих субъингибирующую концентрацию пефлоксацина (8 мкг/мл), выделяют тотальную РНК, которую подвергают ОТ-ПЦР с праймером mrna-burkh. Полученную смесь кДНК используют в качестве матрицы (5 мкл на реакцию) в ПЦР с ген-специфическими праймерами 3-CS (5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'), 5-CS (5'-GGCАТССААGCAGCAAG-3'), комплементарными консервативным сегментам интегронов различных классов.

ПЦР с праймерами 5-CS - 3-CS проводят по программе: начальный прогрев 95°С, 5 мин; 7 реакционных циклов (94°С, 30 с; 57°С, 30 с; 72°С, 60 с), 40 циклов (94°С, 30 с; 55°С, 30 с; 72°С, 60 с), финальная элонгация 72°С, 10 мин.

Продукты амплификации анализируют в денатурирующем 6% полиакриламидном геле с 7.0 М мочевины.

Дифференциальный дисплей с праймерами 5-CS - 3-CS мРНК культур штамма В. pseudomallei 140, выращенных на питательных средах без антибиотиков и средах, содержащих субъингибирующую концентрацию пефлоксацина (8 мкг/мл), позволяет детектировать несколько транскриптов, количественная выраженность которых отличается при различных условиях культивирования (рис.3).

Рис.3. Дифференциальный дисплей мРНК В. pseudomallei 140 с праймерами 5-CS - 3-CS. Электрофорез в денатурирующем ПААГ. Обозначения: М - маркерная ДНК (2645, 1605, 1198, 676, 517, 460, 396, 350 п.н.); 1 - культивирование без антибиотика; 2 - культивирование в присутствии пефлоксацина, 8 мкг/мл. Стрелкой обозначена один из дифференциальных транскриптов размером 340 п.н.

Далее из окрашенного серебром полиакриламидного геля вырезают зону, содержащую ампликон 340 п.н., помещают фрагмент геля в микроцентрифужную пробирку, замораживают и тщательно измельчают стерильной стеклянной палочкой. К фрагментам геля добавляют 200 мкл бидистиллированной воды, инкубируют 18 ч при 37°С и центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. Супернатант реамплифицируют с той же парой праймеров 3CS-5CS и определяют его нуклеотидную последовательность на секвенаторе ABI PRISM^® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), используя наборы BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).

Нуклеотидная последовательность транскрипта 340 п.н. штамма В. pseudomallei 140.

Сравнительное сопоставление определенной нуклеотидной последовательности с известными последовательностями геномов различных видов семейства Burkholderiaceae проводят с использованием программы BLASTN 2.2.18 сервера NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi). Результаты проведенного анализа указывают на принадлежность секвенированной последовательности к фрагментам генов мембранных белков - лекарственных транспортеров АВС суперсемейства.

Последовательности геномов представителей Burkholderiaceae, гомологичные сек-венированной последовательности ампликона 340 п.н. штамма В. pseudomallei 140.

Таким образом, благодаря предложенным методическим подходам был разработан высокочувствительный, достаточно несложный в технологическом исполнении и отвечающий требованиям безопасности работы с ПБА I-II групп патогенности (опасности) способ выявления экспрессирующихся последовательностей генома патогенных представителей рода Burkholderia, применимый как для исследования особенностей индукции и регуляции известных на сегодняшний день генов возбудителей мелиоидоза, сапа и родственных бактерий, так и поиска неидентифицированных ранее генов, ответственных за реализацию различных биологических свойств данных микроорганизмов.

Изобретение раскрывает способ выявления экспрессирующихся генетических детерминант патогенных микроорганизмов рода Burkholderia с использованием реакций обратной транскрипции и сопряженной амплификации (ОТ-ПЦР) для их последующего структурно-функционального анализа. Способ включает этапы выращивания бактериальной культуры до ранней логарифмической фазы роста, выделения и очистки РНК методом нуклеосорбции из обработанной мертиолятом натрия бульонной культуры, удаления примесей ДНК обработкой ДНКазой, синтеза кДНК в присутствии ингибитора рибонуклеаз и праймера, специфичного последовательностям сайтов связывания с рибосомой мРНК прокариот, реамплификации кДНК с тем же праймером для накопления и использования ее в качестве матрицы в ген-специфической ПНР, выделения и определения нуклеотидной последовательности ампликонов. Способ позволяет оценить влияние адаптационных изменений клеток при изменении условий внешней среды на выраженность важнейших биологических характеристик микроорганизмов - вирулентность и устойчивость к антимикробным препаратам - с высокой степенью чувствительности при различных условиях внешней среды. 3 ил., 3 пр.

Способ выявления экспрессирующихся генов патогенных буркхольдерий методом дифференциального дисплея, включающий этапы выращивания бактериальной культуры до ранней логарифмической фазы роста, выделения и очистки РНК, синтеза кДНК, амплификации и детекции продуктов, отличающийся тем, что суточную бактериальную культуру суспендируют в 0,15 М NaCl до плотности 2·10⁹ м.к./мл, подращивают в течение 60 мин, методом нуклеосорбции изолируют тотальную РНК из 200 мкл обработанной мертиолятом натрия бульонной культуры, удаляют примеси ДНК обработкой ДНКазой, синтезируют кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) с праймером GGGGAACGACGATG, специфичным последовательностям сайтов связывания с рибосомой мРНК прокариот, в течение 60 мин при 37°С в присутствии ингибитора рибонуклеаз, терминируют обратную транскрипцию прогреванием при 70°С в течение 10 мин, полученную кДНК реамплифицируют в ПЦР с тем же праймером для накопления и используют в качестве матрицы в ген-специфической ПЦР с последующим выделением и определением нуклеотидной последовательности ампликонов.