РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia COLI ZV1 - НОСИТЕЛЬ КЛОНИРОВАННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ХРОМОСОМНОЙ ДНК Burkholderia pseudomallei, ДЕТЕРМИНИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ БЕЛКА 32 kDa И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ПЕФЛОКСАЦИНУ И СТРЕПТОМИЦИНУ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/21 C12N15/70 C12R1/19 

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования рекомбинантных штаммов Е.coli, несущих клонированные последовательности генома возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei, детерминирующие различные спектры лекарственной устойчивости. Полученный штамм Е.coli ZV1 является продуцентом рекомбинантной плазмидной ДНК pJla1 с клонированным фрагментом хромосомной ДНК В.pseudomallei, детерминирующим синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину (Pf^R) и стрептомицину (Sm^R). Штамм предназначен для изучения молекулярно-генетических основ множественной лекарственной устойчивости В. pseudomallei. Штамм депонирован в Государственной Коллекции Патогенных Бактерий "Микроб" (ГКПБ "М") под номером KM167.

Характерным и важным биологическим свойством возбудителя мелиоидоза и близких ему микроорганизмов является высокая природная резистентность к воздействию широкого спектра антимикробных соединений, а также защитных факторов иммунной системы макроорганизма [Vorachit М., Chongtrakool P., Arkomsean S., Boonsong S. Antimicrobial resistance in Burkholderia pseudomallei // Acta Trop. - 2000. - Vol.74. - P.139-144; Brett P., Woods D. Pathogenesis of and immunity to melioidosis // Acta Trop. - 2000. - Vol.74. - P.201-210]. Наличие этих свойств определяет способность В.pseudomallei к длительному и зачастую бессимптомному, персистированию в инфицированном макроорганизме и создает значительные трудности для успешного лечения заболевания.

Изучение молекулярных основ реализации различных типов лекарственной устойчивости В.pseudomallei начато относительно недавно, однако и на основании уже полученных данных можно утверждать, что возбудитель мелиоидоза обладает чрезвычайно обширным генетическим потенциалом формирования того или иного спектра резистентности. Так, идентифицирован хромосомный оперон amrAB-oprA, относящийся к детерминантам множественной резистентности транспортного типа и определяющий высокий уровень устойчивости В. pseudomallei к аминогликозидам и макролидам [Moore A., DeShazer D., Reckseidler S., Weissman A., Woods D. E. Effluxediated aminoglycoside and macrolide resistance in Burkholderia pseudomallei. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol.43. - P.465-470]. Идентифицированы и охарактеризованы хромосомные гены waaF, waaE, udg, gmhD, lytB, гомологичные компонентам систем биосинтеза ЛПС и экзополисахаридов у различных грамотрицательных бактерий и ответственные за резистентность В. pseudomallei к воздействию катионных пептидов и полимиксинов [Burtnick М.N., Woods D.E. Isolation of polymyxin B-susceptible mutants of Burkholderia pseudomallei and molecular characterization of genetic loci involved in polymyxin В resistance. // Antimicrob. Agents Chemoter. - 1999. - Vol.43. - P.2648-2656]. О наличии в геноме В. pseudomallei R-детерминант различных классов свидетельствуют и опубликованные предварительные результаты по проекту секвенирования генома В. pseudomallei [Holden М., Titball R., Peacock S., et. al. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol.101. P.14240-14245].

Следует отметить, что исследования, направленные на расшифровку механизмов формирования резистентности В.pseudomallei, могут послужить основой для понимания основных биохимических особенностей микроорганизма, предопределяющих его повышенную метаболическую пластичность, приспособляемость к воздействию специфических и неспецифических ингибиторов и защитных факторов макроорганизма, а также дать необходимый материал в разработке новых подходов к применению антибиотиков при лечении мелиоидозной инфекции. Возможности изучения механизмов лекарственной резистентности определяются наличием молекулярно-биологических методов и модельных систем, позволяющих идентифицировать и осуществлять анализ последовательностей генома, детерминирующих резистентность. Необходимыми элементами здесь являются специальные штаммы, несущие генетические детерминанты измененной чувствительности, методы молекулярного анализа R-детерминант различных типов, а также клонирование последовательностей детерминант резистентности и анализ их экспрессии в гетерологичных системах.

На сегодняшний день имеется ряд сообщений о клонировании и анализе экспрессии генов В.pseudomallei, детерминирующих резистентность к антимикробным соединениям различных классов. Так, в Е.coli клонирован хромосомный ген blaA_BPS В.pseudomallei, кодирующий β-лактамазу, способную гидролизовать пенициллины и отдельные цефалоспорины [Cheung Т., Но Р., Woo P., et al. Cloning and expression of class A β-lactamase gene blaA_BPS in Burkholderia pseudomallei // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol.46. - P.1132-1135]. На основе анализа опубликованных последовательностей генома возбудителя мелиоидоза (www.sanger.ac.uk/Projects/B_pseudomallei) авторами были сконструированы специфические праймеры, содержащие последовательности сайтов рестрикции EcoRI и XbaI, амплифицирована хромосомная последовательность blaA_BPS В. pseudomallei и клонирована в Е. coli в составе вектора pBK-CMV. Рекомбинантные плазмиды pBKCMV01 и pBKCMV07 стабильно реплицировались в штаммах кишечной палочки. Аминокислотная последовательность рекомбинантной β-лактамазы с изоэлектрической точкой pI 7.7 и молекулярной массой 29.1 kDa имела высокую степень гомологии с β-лактамазами класса А, такими как PenA В.cepacia, BlaI Yersinia enterocolitica, CTX-M-18 Klebsiella pneumoniae, SFO-1 Entero-bacter cloacae, FONTA-4 Serratia fonticola и OXY Klebsiella oxytoca.

Во многом аналогичный подход был использован при клонировании и анализе экспрессии β-лактамазы D-класса В.pseudomallei [Niumsup P., Wuthiekanun V. Cloning of the class D β-lactamase gene from Burkholderia pseudomallei and studies on its expression in ceftazidime-susceptible and - resistant strains // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol.50. - P.445-455]. Штаммы Е. coli, несущие рекомбинантные плазмиды с клонированными ПЦР-фрагментами генома В. pseudomallei, гомологичными генам β-лактамазам класса D, имели высокий уровень устойчивости к цефтазидиму и оксациллину. Анализ клонированных последовательностей позволил идентифицировать ген, обозначенный оха-42 и кодирующий β-лактамазу расширенного спектра, гомологичную некоторым оксациллин-гидролизующим энзимам, таким как ОХА-22 Ralstonia pickettii, AsbB, AmpS и AmpH различных видов Aeromonas, OXA-18 Pseudomonas aeruginosa и ОХА-9 Klebsiella pneumoniae.

Работы по клонированию последовательностей генома В.pseudomallei, детерминирующих множественную резистентность к антимикробным соединениям различных классов, значительно меньше отражены в современной научной периодике. Следует упомянуть исследования структурной и функциональной организации плазмид В.pseudomallei, в рамках которых было осуществлено клонирование и анализ экспрессии в Е.coli фрагментов 12.95 т.п.н. плазмиды рРМ1 [Захарова И.Б., Викторов Д.В., Замараев В.С. Клонирование и экспрессия 7.55 т.п.н. фрагмента плазмиды рРМ1 Burkholderia pseudomallei в Escherichia coli. // Мол. генет. микробиол. вирусол. - 2002. - №2. - С.19-22]. Установлено, что рекомбинантные клоны, несущие 7.55 т.п.н. KpnI фрагмент рРМ1, высокорезистентны к отдельным аминогликозидам (стрептомицин, канамицин, гентамицин) и фторхинолонам (пефлоксацин, офлоксацин). Два белка наружной мембраны 23 и 27 kDa, отсутствующие у исходного штамма Е.coli и способные формировать мультимерный комплекс 120 kDa, были выявлены вестерн-блоттингом в штамме с рекомбинантной плазмидой pSI 9, векторная часть которой, однако, претерпела значительные рекомбинационные перестройки. По данным дот- и Саузерн-гибридизационного анализа, наблюдалась интеграция клонированной последовательности в хромосому в клонах Е.coli, несущих рекомбинантные плазмиды pSI 2 и pSI 4.

Целью изобретения является конструирование штамма Е.coli, несущего стабильно реплицирующуюся рекомбинантную плазмиду с клонированной последовательностью хромосомной ДНК В. pseudomallei, детерминирующей резистентность к антимикробным соединениям различных классов.

В качестве источника хромосомной ДНК был использован штамм В.pseudomallei 56770 SMR2, имеющий высокий уровень резистентности к цефалоспоринам, фторхинолонам, аминогликозидам, β-лактамам и отличающийся стабильным сохранением фенотипа резистентности при длительном культивировании в неселективных условиях. Хромосомную ДНК выделяли методом нейтрального лизиса [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. - Пер. с англ., М.: Мир, 1984. - 392 с.] из 24-часовой культуры возбудителя мелиоидоза, выращенной на Nutrient-arape (Difco) с пефлоксацином (60 мкг/мл) при 37°С.

Хромосомную ДНК В. pseudomallei 56770 SMR2 и вектор pUC19 подвергали полному гидролизу эндонуклеазой KpnI и после переосаждения лигировали в соотношении 25:1. В нескольких сериях опытов трансформировали лигазной смесью компетентные клетки Е. coli JM107, полученные стандартным кальциевым методом [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. - Пер. с англ., М.: Мир, 1984. - 392 с.], с последующим высевом на плотную питательную среду Antibiotic medium 2 (Difco), содержащую Pfx 0.4 мкг/мл.

Трансформанты, резистентные к пефлоксацину, дополнительно исследовали на устойчивость к аминогликозидам (канамицин, стрептомицин, гентамицин), β-лактамам (ампициллин) и карбапенемам (имипенем).

Для плазмидного скрининга использовали щелочной метод выделения плазмидной ДНК [Birnboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmids //Nucleic Acids Res. -1979. - Vol.7. - P.1513] с последующей детекцией плазмидных репликонов электрофорезом в 0.8% агарозном геле.

Для детекции клонированного фрагмента хромосомной ДНК В.pseudomallei был использован гибридизационный анализ. Зонд (последовательности хромосомы В.pseudomallei 56770 SMR2) метили био-11-dUTP в ПЦР с использованием прямого и обратного праймеров pUC/M13 при следующих параметрах реакции: денатурация 95°С - 30 с, отжиг 50°С - 40 с, элонгация 72°С - 50 с. Для визуализации результатов гибридизации использовали набор "Нерадиоактивное определение ДНК" (НПО "Силекс", Россия).

Для детекции продуктов экспрессии клонированного фрагмента хромосомной ДНК В. pseudomallei применяли метод вестерн-блоттинга [Towbin Н., Staehelin Т. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - N 76. - P.4350-4354] с использованием иммуноглобулинов поликлональных козлиной сыворотки к клеткам В.pseudomallei, меченных щелочной фосфатазой.

Рекомбинантный штамм Е.coli ZV1 (pJla1), полученный путем трансформации клеток Е.coli JM107 KpnI-фрагментами хромосомной ДНК В. pseudomallei 56770 SMR2, лигированными с вектором pUC19, обладает резистентностью к пефлоксацину (Pf^R) и стрептомицину (Sm^R), утрачивает маркер резистентности вектора (Ар^S), сохраняет основные культурально-морфологические и биохимические свойства Е.coli JM107. Штамм Е.coli ZV1 (pJla1) является носителем высококопийного плазмидного репликона pJlal размером 6.1 т.п.н. Уровень выхода (синтеза) плазмидной ДНК pJlal в штамме составляет 0.25 мг/л при плотности культуры OD/600=0.5. По данным рестрикционного и гибридизационного анализа, плазмида pJlal несет в своем составе ori репликации вектора pUC19, а также фрагмент клонированной хромосомной ДНК В.pseudomallei размером приблизительно 5.5 т.п.н. Продуктом экспрессии клонированного фрагмента является протеин с молекулярной массой 32 kDa, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами мелиоидозной антисыворотки в вестерн-блоттинге.

Пример 1. Испытание рекомбинантного штамма Е.coli ZV1 (pJla1) no проявлению антибиотикорезистентности в сравнении с реципиентным штаммом Е.coli JM107.

Устойчивость штаммов к антибиотикам определяют методом серийных разведений на плотных питательных средах, оценивая МПК препарата для 5×10⁴ м.к. Бактериальные суспензии готовят из 24 ч агаровых культур, выращенных при 37°С. Результаты сравнительного анализа уровней резистентности рекомбинантного штамма Е.coli ZV1 (pJla1) и исходного штамма Е.coli JM107 к антибактериальным препаратам различных классов приведены в таблице.

Как следует из полученных данных, рекомбинантный штамм Е.coli ZV1 (pJla1) обладает резистентностью к отдельным антибиотикам аминогликозидного (стрептомицин) и фторхинолонового (пефлоксацин) рядов.

Пример 2. Анализ продуктов экспрессии клонированной последовательности хромосомной ДНК В.pseudomallei.

Бактериальные клетки, выращенные в течение 24-48 ч при 37°С на питательном агаре, ресуспендируют в лизирующем буфере (0.0625 М Трис-HCl рН 6.8, 2% SDS, 10% глицерин, 5% β-меркаптоэтанол), прогревают 5 мин при 100°С и удаляют нелизированный материал центрифугированием при 5000 g. 10-15 мкл супернатанта анализируют электрофорезом в полиакриамидном геле. Для электрофореза используют гели (11% полиакриламид, 0.1% SDS), приготовленные по методу Laemmli [Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. - Nature. - 1970. - V.227. - P.680-685]. Электрофорез проводят при стабилизированом токе 5 mA в течение 18 ч в вертикальном аппарате SE400 (HSI). Для контроля скорости фракционирования в образцы вносят 0.004% бромфенолового синего. Для окрашивания гелей используют Кумасси G-250 (Serva).

Электрофоретический перенос белков на нитроцеллюлозные мембраны ВА83 (LKB) с размером пор 0.22 μm проводят по Towbin [Towbin H., Staehelin T. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - N 76. - P.4350-4354] в вертикальной ячейке ТЕ50 (HSI) в течение 18 ч при стабилизированном напряжении 45 V и термостатировании при 10°С. После электроблоттинга мембраны промывают в буфере TBST (10 mM Трис-HCl рН 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Твин-20) трехкратно по 2 мин, блокируют в 2% БСА в TBST в течение 15 ч при 4°С, повторяют этап промывки и инкубируют 1.5 ч при комнатной температуре со специфическими IgG, меченными щелочной фосфатазой, в разведении 1:128 в TBST с 0.5% БСА. Затем мембраны промывают пятикратно по 2 мин в TBST, активируют фермент, инкубируя мембраны 2 мин в буфере АР (100 mM Трис-HCl рН 9.5,100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) и обрабатывают раствором субстрата (0.02% бром-хлор-индолил-фосфат, 0.02% нитросиний тетразолий в буфере АР).

В иммуноблоттинге (чертеж) выявляется специфическое взаимодействие мелиоидозных иммуноглобулинов с препаратом общеклеточных белков Е. coli Е. coli ZV1 (белок 32 kDa) и препаратами, использованными в качестве положительных контролей (общеклеточные белки В.pseudomallei 56770, В. thailandensis E264). Препарат общеклеточных белков штамма Е. coli JM107 не содержит компонентов, специфически взаимодействующих с иммуноглобулинами мелиоидозной антисыворотки.

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования рекомбинантных штаммов Е. coli, несущих клонированные последовательности генома возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei, детерминирующие различные спектры лекарственной устойчивости. KpnI-фрагментами хромосомной ДНК штамма В. pseudomallei 56770 SMR2, лигированными с KpnI-рестриктами вектора pUC19, трансформируют компетентные клетки Е. coli JM107, отбирают клоны, имеющие сочетанную резистентность к антимикробным препаратам различных классов, проводят плазмидный скрининг рекомбинантных клонов и гибридизационный анализ для детекции клонированного фрагмента хромосомной ДНК, используя в качестве зонда последовательности хромосомы В. pseudomallei. Определяют наличие продукта экспрессии клонированной последовательности хромосомной ДНК методом иммуноблоттинга с иммуноглобулинами специфической мелиоидозной антисыворотки. Полученный рекомбинантный штамм ZV1 депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" под номером КМ 167 и обладает резистентностью к пефлоксацину и стрептомицину. Использование изобретения позволит изучить молекулярно-генетические основы множественной лекарственной В. pseudomallei и исследовать функциональную роль отдельных протеинов в формировании полирезистентности у возбудителя мелиоидоза. 1 ил., 1 табл.

Штамм Escherichia coli ZV1 KM167 (Государственная коллекция патогенных бактерий "Микроб") - носитель рекомбинантной плазмидной ДНК рJ1а 1 с клонированным фрагментом хромосомной ДНК Burkholderia pseudomallei, детерминирующим синтез белка 32 kDa и резистентность к пефлоксацину (Rf^R) и стрептомицину (Sm^R).