СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО АЛЛЕЛЯМ А И К ГЕНА DGAT1 Российский патент 2014 года по МПК C12N15/06 C12Q1/68 

Изобретение относится к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена DGAT1 (дкацилглицерол O-ацилтрансфераза 1) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.

Так, в способе, предложенном J. Komisarek (2008) [1], используются праймеры F: 5^/-TGCCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCC-3^/ и R: 5^/-ACCTGGAGCTGGGTGAGGAACAGC-3^/, инициирующие амплификацию локуса DGAT1-гена длиной 378 bp, с последующим его эндонуклеазным расщеплением рестриктазой BglI для генерации и интерпретации образующихся генотип-специфичных фрагментов (генотип AA=254/96/28 bp, генотип KK=282/96 bp и генотип AK=282/254/96/28 bp).

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену DGAT1 на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.

Нами разработан способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).

Условия проведения реакции

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб Б», ЦНИИЭМ, Россия).

ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколу, представленному в табл.1.

Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере ТВЕ (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (AA, KK, AK) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-специфичных фрагментов (AA=82/18 bp, KK=100 bp и AK=100/82/18 bp), где ПЦР-ПДРФ-фрагменты с длинами 100 bp и 82 bp являются идентификационными, а минорный ПДРФ-фрагмент длиной 18 bp - неинформативным, из-за его малого размера, что существенно не снижает точность ДНК-анализа.

Источники информации

1. Komisarek, J.A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle / J. Komisarek, A, Michalak // Animal Science Papers and Reports. - 2008. - V.26. - N.2. - P.89-95.

Таблица 1 Протокол ПЦР-ПДРФ для генотипирования кр.рог.ск. по аллелям A и K гена DGAT1 Протокол ПЦР Реагенты Исходная кон центрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл) dH₂O     13.4 134 ДМСО 100% 5% 1 10 dNTP 2,5 мМ 0,25 мМ 2 20 Буфер 10× 1× 2 20 Таq ДНК Полимераза 5 ед 1 ед 0,2 2 SEQ ID NO: 1 50 мкМ 0,25 мкМ 0,1 1 SEQ ID NO: 2 50 мкМ 0,25 мкМ 0,1 1 SEQ ID NO: 3 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2 Проба ДНК     1   ВСЕГО     20  

Праймеры:

Режим амплификации

×1:94°C - 4 мин

×40:94°C - 10 сек, 72°C - 10 сек

×1:72°C - 5 мин

ХРАНЕНИЕ +10°C

ПЦР-продукт = 100 bp

Протокол ПДРФ

Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба 10 проб dH₂O     1,25 12,5 BSA 10 мг/мл 0,1 мг/мл 0,25 2,5 SE-буфер Y 10× 1× 2,5 25 TaqI 20 U 20 U 1 10 ПЦР-проба     20   ВСЕГО     25  

Инкубация при 65°C в течение ночи

ПЦР-ПДФР-фрагменты:

Генотип AA=82/18 bp

Генотип KK=100 bp

Генотип AK=100/82/18 bp

Электрофорез в 3% агарозе

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг.1 - Фланкируемые участки праймеров, используемые для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1 предложенным способом проведения ПЦР-ПДРФ.

Пояснение к фиг.2 - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1.

Обозначения:

M) ДНК-маркеры 100 bp+50 bp (СибЭнзим).

1-4, 6, 8-11, 13, 15, 17-18) генотип АК гена DGAT1 кр.рог.ск.

5, 16) генотип AA гена DGAT1 кр.рог.ск.

7, 12. 14) генотип КК гена DGAT1 кр.рог.ск.

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по DGAT1-гену на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров:

DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO:1)

DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO:2)

DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO:3),

а на этапе ПДРФ применяется другая эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp и генотип АК=100/82/18 bp (фиг.1 и 2). 2 ил., 2 табл.

Способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и K гена DGAT1, отличающийся тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

а на этапе ПДРФ применяется эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип AA=82/18 bp, генотип KK=100 bp и генотип AK=100/82/18 bp.