СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ НЕЙРОГЕНЕРАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ Российский патент 2012 года по МПК A61K48/00 A61P25/28 C12N15/79 

Изобретение относится к медицине, в частности к методам лечения травмы спинного мозга при помощи введения в область повреждения генов в виде плазмидных векторов, экспрессирующих нейротрофические факторы, и может быть использовано в центрах травматологии и неврологии.

Травма спинного мозга остается одним из актуальных вопросов современной медицины. Ее последствия проявляются вялым или спастическим параличом, парезом конечностей и дисфункцией тазовых органов. За последние двадцать лет проведено большое количество исследований по изучению многих аспектов патофизиологии и патоморфологии спинальной травмы: воспалительный ответ, глиальная реакция, апоптоз, ишемия, восстановление функциональной активности. Было установлено, что травматическое повреждение спинного мозга вызывает комплекс патологических сдвигов, включающий гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию, активацию микроглии и макрофагов. Эти нарушения являются причиной устойчивого функционального дефицита.

Одним из перспективных подходов к лечению травмы спинного мозга является генная терапия. Известен способ доставки клонированных генов в область повреждения при помощи клеточных носителей. С этой целью используют эмбриональные и кроветворные стволовые клетки [см. McDonald J.W. Repairing the damage spinal cord: from stem cells to activity-based restoration therapies / J.W. McDonald // Clinical neurosurgeru. - 2004. - Vol.№51. - P.1-21], нейральные стволовые клетки, клетки крови пуповины, шванновские клетки [см. Survival, integration and axon growth support of glia transplantation into the chronically contused spinal cord / D.J. Barakat [et all] // Cell transplantation. - 2005. - Vol.№14. - P.225-240]. Однако ожидаемое увеличение эффективности при лечении последствий тяжелых повреждений спинного мозга не достигнуто, к тому же существуют определенные недостатки перечисленных способов. Так, при доставке терапевтических генов на клеточных носителях существует высокая вероятность трансформации клеток в опухолевые и контаминации инфекционными агентами в ходе манипуляций ex vivo.

Из исследованного уровня техники известен метод стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга при помощи доставки в область повреждения вирусных векторов, содержащих в большинстве случаев гены нейротрофических факторов. Существенными недостатками применения вирусных векторов являются, кратковременная экспрессия трансгена, нежелательное взаимодействие с иммунной и гуморальной системами, а также осложнения при первоначальном инфицировании. Применение ретровирусов для генной терапии нейродегенеративных заболеваний в экспериментах на животных было достаточно эффективным. Однако начатые клинические испытания не выявили положительного эффекта [см. Dawbarn D. Neurotrophins and neurodegeneration / D. Dawbarn, S.J. Allen // Neuropathology and applied neurobiology. - 2003. - Vol.№29 (3). - P.211-230].

Нейротрофические факторы поддерживают выживание нейронов и стимулируют образование их отростков [см. Lu P. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration / P.Lu, M.H.Tuszynski // Experimental neurology. - 2008. - Vol. №209. - P.313-320]. Их введение в область травматического повреждения спинного мозга сдерживает процесс вторичной дегенерации и способствует восстановлению нервных связей [см. Thuret S. Therapeutic interventions after spinal cord injury / S. Thuret, L.D.F. Moon, F.H. Gage // Nature. - 2006. - Vol.№7. - P.628-663]. Однако при непосредственной доставке нейротрофических факторов в область повреждения эффект воздействия очень кратковременный, вследствие быстрого их расщепления ферментами организма протеазами. Поэтому для пролонгирования действия необходимо вводить гены нейротрофических факторов. Их прямое введение в область повреждения спинного мозга считается одним из перспективных методов стимулирования регенерации.

При спинальной травме с целью стимулирования регенерации известно применение следующих нейротрофических факторов: VEGF, FGF2, NT3, GDNF, BDNF. При применении каждого из них в отдельности получают определенные положительные результаты, но это не обеспечивает существенного улучшения структуры и функции спинного мозга.

Наиболее близким по достигаемому результату является способ введения в область повреждения плазмидного вектора на основе двухкассетной плазмиды, экспрессирующей комбинацию генов Всl-2 и LacZ, которые не являются нейротрофическими факторами [см. DNA plasmid that codes for human BcL-2 gene preserves axotomized Clarke's nucleus neurons and reduces atrophy after spinal cord hemisection in adult rats / K. Takanashi [et all] // The journal of comparative neurology. - 1999. - Vol.№171. - P.159-171]. В этой работе на модели перерезки спинного мозга крысы только с одной стороны (гемисекции) на уровне нижнего грудного отдела (Т8) исследовано влияние инъекции в область повреждения плазмидной ДНК с двумя генами, геном противоапоптозного белка Bcl-2, сдерживающего гибель клеток, и репортерного гена LacZ бактериальной галактозидазы, которая служит меткой для идентификации трансфицированных (получивших введенные гены) клеток реципиента и не влияет на выживание этих клеток. Оба гена, вводимые в область повреждения, не являются нейротрофическими факторами. В упомянутой работе плазмидный вектор вводили в комплексе с катионными липидами в спинной мозг в область, соседнюю с зоной травматического повреждения. Терапевтическая доза составила 20-50 мкг плазмидного вектора на одно животное. Через два месяца после нанесения травмы и введения генов количество выживающих нейронов двигательного ядра Кларка на стороне операции существенно увеличилось.

Для стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга способ доставки комбинации генов нейротрофических факторов путем прямой генной терапии при помощи плазмидных векторов не исследован и не применялся (не известен из изученного уровня техники).

Сущность заявленного технического решения заключается в стимулировании посттравматической регенерации спинного мозга путем доставки в область повреждения плазмидного вектора, отличается тем, что стимулирование регенерации спинного мозга проводят путем прямого введения плазмидного вектора на основе двухкассетной плазмиды pBud СЕ4.1, экспрессирующей комбинацию клонированных генов нейротрофических факторов человека (pBud-VEGF-FGF2). Заявленный способ стимулирования по п.1, характеризуется тем, что одновременно используют два гена нейротрофических и ангиогенных факторов: сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2). Заявленный способ стимулирования по п.1 характеризуется тем, что плазмидный вектор с комбинацией генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в терапевтически эффективной дозе непосредственно вводят путем инъекции в область повреждения спинного мозга.

Известна плазмида pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующая одновременно оба гена [см. заявку на изобретение №2009133970, дата приоритета 11.09.2009]. Эффекты данной комбинации генов на процессы посттравматической регенерации спинного мозга ранее не изучались и остаются неисследованными.

Заявленный способ регенерации спинного мозга с использованием плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2 был изучен на лабораторных крысах и детально описан в следующих примерах:

Пример 1

На модели дозированной контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне Т8 нами изучено влияние доставки генов VEGF и FGF2 на нейрорегенерацию. Крысам под наркозом на уровне восьмого сегмента спинного мозга после ламинэктомии наносили дозированную контузионную травму вертикально падающим металлическим стержнем весом 10 г с высоты 12,5 мм. Сразу после травмы гамильтоновским шприцем вводили 40 мкг плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2 в 5 мкл физиологического раствора в две точки на расстоянии 1 мм ростральнее и каудальнее от эпицентра травмы и на 0.5 мм латеральнее срединной линии. Аналогично крысам контрольной группы вводили плазмидный вектор, экспрессирующий ген зеленого флюоресцентного белка (EGFP). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Объектом исследования являлся спинной мозг, выделенный у животных на 30 сутки после нанесения контузионной травмы спинного мозга.

Пример 2

На криостатных поперечных срезах спинного мозга на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы непрямым иммунопероксидазным методом выявляли периваскулярные клетки с антителами против бета-рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFRbeta). При помощи данного метода было установлено, что на 30-е сутки после операции при введении плазмидного вектора в наружных зонах белого вещества спинного мозга на расстоянии 1,5 см от эпицентра травмы количество периваскулярных клеток, экспрессирующих бета-рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRbeta), увеличивается в среднем на 54% (Р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем у животных контрольной группы (аналогичная травма спинного мозга, но без инъекции генов). Это указывает на усиление образования новых кровеносных сосудов в белом веществе спинного мозга в области травматического повреждения.

Пример 3

Для анализа восстановления двигательной функции использовали поведенческий тест «ВВВ» [см. Basso D.M. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats / D.M. Basso, M.S. Beattie, J.C. Bresnahan // Journal of Neurotrauma. - 1995. - Vol. №12. - P.1-21]. Установлено, что показатель восстановления двигательной функции (ВВВ) при введении в область повреждения плазмидного вектора pBud-VEGF-FGF2 возрастает на 58% (Р<0,05) при сравнении с соответствующим показателем у животных контрольной группы (аналогичная травма спинного мозга, но без инъекции генов).

Таким образом, полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что прямая доставка комбинации терапевтических генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в область повреждения спинного мозга приводит к положительному терапевтическому эффекту, а именно:

- уменьшению площади деструкции серого и белого вещества,

- стимулирует васкуляризацию ткани мозга,

- поддерживает его посттравматическую регенерацию.

Заявленный способ, в отличие от известных в мире на дату подачи заявки наилучших способов лечения травмы спинного мозга, предполагает существенное увеличение эффективности восстановления функции спинного мозга.

В заявленном способе используют ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF).

Он обладает выраженным стимулирующим влиянием на процесс неоваскуляризации, что важно для устранения эффекта посттравматической ишемии ткани. VEGF проявляет свойства типичного нейротрофического фактора.

PDGF-B через рецепторный вход PDGFβR стимулирует дифференцировку перицитов из предшественников, экспрессирующих PDGFβR, что оказывает поддерживающее влияние на процесс васкуляризации. Зарегистрированное заявителем к 30 суткам эксперимента увеличение количества PDGFβR⁺-клеток отражает усиление васкуляризации белого вещества в области травматического повреждения спинного мозга. Предполагается, что этот эффект является результатом действия доставленных в составе плазмидного вектора генов ангиогенных факторов и их экспрессии в клетках реципиента в области повреждения спинного мозга.

Вторым геном в заявленной комбинации является ген фактор роста фибробластов 2 (FGF2) - представитель ключевого семейства морфогенов, которые контролируют индукцию и спецификацию тканей в эмбриогенезе. Молекула является фактором роста, обладает выраженным нейротрофическим действием и рассматривается как обязательный компонент в средах для направленной дифференцировки нейральных клеток in vitro. В сформированном спинном мозге FGF2 необходим для пролиферации нейральных предшественников, что показано in vivo и in vitro

Доставка FGF2 в область травмы спинного мозга существенно уменьшает объем патологических полостей и способствует сохранности белого вещества. При травме спинного мозга FGF2 усиливает экспрессию молекулы адгезии СНL1, которая поддерживает выживание нейронов и аксоногенез, а также экспрессию глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в астроцитах [см. Glial scar expression of CHL1, the close homolog of the adhesion molecule L1, limits recovery after spinal cord injury / I.Jakovcevski [et all] // Journal of Neurotrauma. - 2007. - Vol.№27. - P.7222-7233], но сдерживает прорастание нервных волокон через глиальный рубец при травме спинного мозга.

Преимущество заявленного способа от известных в мире на дату подачи заявки заключается в использовании плазмидного вектора, экспрессирующего комбинацию генов нейротрофических факторов человека. Применение комбинации нейротрофических факторов, поддерживающих выживание нейронов и стимулирующих неоваскуляризацию, позволяет одновременно положительно влиять на несколько указанных выше процессов при травматическом повреждении спинного мозга.

Использовать заявленный способ рекомендуется в острый период травматического повреждения спинного мозга, так как применяемая комбинация генов нейротрофических и ангиогенных факторов способствует устранению посттравматической ишемии ткани и поддерживает выживание нейронов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию мировая новизна, т.к. совокупность заявленных признаков не известна из уровня техники на дату подачи заявки.

Заявленное техническое решение соответствует критерию изобретательский уровень, т.к. не является очевидным для специалистов в избранной области медицины.

Заявленное техническое решение соответствует критерию промышленная применимость, т.к. апробирована в лабораторных условиях на экспериментальных животных, что обеспечило получение заявленных технических результатов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к области генной терапии. К рассмотрению предложен способ стимулирования регенерации спинного мозга проводят путем введения в область повреждения вектора на основе двухкассетной плазмиды pBud-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующей комбинацию двух клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов человека VEGF и FGF2. Использование изобретения обеспечивает увеличение эффективности восстановления функции спинного мозга, что может найти дальнейшее применение в лечении пациентов с травматическим повреждением спинного мозга. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга путем доставки в область повреждения плазмидного вектора, отличающийся тем, что стимулирование регенерации спинного мозга проводят путем прямого введения плазмидного вектора на основе двухкассетной плазмиды pBud-VEGF-FGF2, одновременно экспрессирующей комбинацию клонированных генов нейротрофических и ангиогенных факторов человека VEGF и FGF2.

2. Способ стимулирования по п.1, отличающийся тем, что одновременно используют два терапевтических гена: ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2).

3. Способ стимулирования по п.1, отличающийся тем, что плазмидный вектор с комбинацией генов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в терапевтически эффективной дозе непосредственно вводят путем инъекции в область повреждения спинного мозга.