Способ стимулирования ангиогенеза, лечения нейродегенеративных заболеваний и регенерации скелетной мышцы с помощью плазмидных конструкций с генами ангиогенных и нейротрофических факторов Российский патент 2023 года по МПК C12N15/63 C12N15/85 A61K48/00 A61P9/10 A61P19/08 A61P25/02 A61P25/28 

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и медицине, а именно касается стимулирования ангиогенеза, регенерации нервных волокон кровеносных сосудов и регенерации скелетной мышцы, и может быть использовано для лечения состояний, связанных с недостаточностью кровообращения, в частности в сердечно-сосудистой хирургии, а также лечения нейродегенеративных заболеваний и травматических повреждений скелетной мышцы, с применением комбинации генов, кодирующих синтез проангиогенных и нейротрофических факторов.

Уровень техники

В настоящее время ишемия, в частности хроническая ишемия нижних конечностей, лечится медикаментозным и оперативным путем, однако ни один из применяемых в практической медицине методов в полной мере не устраняет основную причину и не приводит к полному восстановлению микроциркуляции пораженной ткани.

Известно, что при сахарном диабете поражаются сосуды различного калибра, тем самым усиливая процессы атеросклероза, так как часто эти процессы имеют место у одного и того же пациента. В многочисленных исследованиях описано состояние нервных волокон и капилляров в области ишемии при диабете первого типа. В последнее время по данным научной литературы и статей значительная роль в ангиогенезе отводится нейротрофическим факторам, и, в частности, GDNF. В исследовании [Cen et al., "Denervation in femoral artery-ligated hindlimbs diminishes ischemic recovery primarily via impaired arteriogenesis" 2016 Chinese Medical Journal, February 5, 2016, Volume 129, P. 313-319] было выявлена роль денервации в ангиогенезе. Денервация лигированной бедренной артерии в задней конечности ухудшает постишемическое восстановление кровотока из-за нарушения перфузии. Возможными механизмами нарушенной перфузии являются более низкое число коллатералей, более низкая плотность капилляров и, скорее всего, более узкий просвет. Это исследование иллюстрирует важную роль периферических нервов в артериогенезе с использованием моделированной комбинированной ишемии с денервацией в задней конечности. В исследовании [Diao et al., "Effects of denervation on angiogenesis and skeletal muscle fiber remodeling of ischemic limbs" Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2015 Mar 3; 95 (8): P. 601-605] животные были разделены на 3 группы: контроль, ишемия задней конечности, ишемия+денервация. Оцененные на 28 сутки результаты выявили, что ишемические повреждения, заключающиеся в уменьшении индекса пролиферации эндотелиальных клеток, капиллярной плотности, увеличение индекса секреции NGF, увеличения индекса секреции VEGF были более выраженные в группе ишемия+денервация по сравнению с группой ишемии, что свидетельствует о роли нервных волокон при ишемии.

Таким образом, была показана важная роль нервных волокон в процессе постишемического восстановления кровотока, что утверждает во мнении о необходимости регенерации нервных волокон для более эффективного стимулирования ангиогенеза.

Из уровня техники известен патент РФ на изобретение №2517117 "Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноконструктурированного матрикса и генетических конструкций", однако указанное изобретение относится к регенерации исключительно нерва, и не имеет отношения к росту сосудов.

Известны также изобретения "Способ получения индуцированных стволовых клеток, перепрограммированных из клеток, не являющихся нервными с использованием HMGA2 [RU 2646099] и "Система и способ определения места расположения и идентификации функциональных нервов, иннервирующих стенки артерий" [RU 2638438]. Однако эти изобретения прямо не связаны с регенерацией нервных волокон кровеносных сосудов.

Известны также "Композиция и способ для регуляции развития сосудов" [RU 2365382], предусматривающий введение индивидууму антагониста EGFL7-антагониста фактора роста клеток эндотелия сосудов VEGF. Однако данный способ используется для подавления ангиогенеза, а не его стимулирования.

Таким образом, существует необходимость в разработке новых способов и подходов для стимулирования ангиогенеза, регенерации нервных волокон кровеносных сосудов и/или регенерацией скелетной мышцы.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в разработке нового эффективного способа стимулирования ангиогенеза, регенерации нервных волокон кровеносных сосудов и/или регенерации скелетной мышцы, а также в расширении арсенала технических средств в данной области.

Технический результат заключается в разработке нового эффективного и безопасного способа стимулирования ангиогенеза, регенерации нервных волокон кровеносных сосудов и/или регенерации скелетной мышцы, который характеризуется более выраженным усилением ангиогенеза и регенеративных процессов, и тем самым характеризуется высокой эффективностью для терапии состояний и/или заболеваний, связанных с недостаточностью кровообращения, нейродегенеративных заболеваний и/или травматических повреждений скелетной мышцы, кроме того, указанный способ по изобретению не сопровождается возникновением нежелательных иммунных реакций.

Настоящее изобретение решает комплексную задачу - стимулирование ангиогенеза посредством ангиогенных факторов (VEGF+ANG) с одновременной регенерацией нервных волокон кровеносных сосудов посредством нейротрофического фактора (GDNF) и/или регенерацией скелетной мышцы, как результат изобретение обеспечивает, в частности, эффективное создание устойчивых функциональных кровеносных сосудов. Таким образом, комбинация по изобретению на основе плазмидных конструкций обеспечивает комплексное воздействие на ключевые процессы, необходимые регенерации органов и тканей - индуцирует формирование стабильных и функционально зрелых сосудов, обеспечивает регенерацию нервных волокон кровеносных сосудов и регенерацию скелетной мышцы.

Указанный технический результат достигается посредством разработки и получения комбинации рекомбинантной экспрессирующей плазмиды pBudK-coVEGF-coANG, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VEGF, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ANG, и рекомбинантной экспрессирующей плазмиды pBudK-coGDNF, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок GDNF;

для индукции ангиогенеза, регенерации нервных волокон кровеносных сосудов и/или регенерации скелетной мышцы.

Указанная плазмидная комбинация позволяет одновременно экспрессировать несколько рекомбинантных генов и проявляет высокую функциональную активность.

В частных вариантах воплощения изобретения плазмида pBudK-coVEGF-coANG характеризуется последовательностью SEQ ID NO:1.

В частных вариантах воплощения изобретения плазмида pBudK-coGDNF характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также включает применение комбинации по изобретению для профилактики и/или лечения состояния и/или заболевания, связанного с недостаточностью кровообращения, нейродегенеративного заболевания и/или травматического повреждения скелетной мышцы у субъекта. В частных вариантах воплощения изобретения состояние и/или заболевание, связанное с недостаточностью кровообращения, представляет собой ишемическую болезнь сердца, ишемию нижних конечностей. В частных вариантах воплощения изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой боковой амиотрофический склероз, травму периферического нерва, травму спинного мозга. В частных вариантах воплощения изобретения травматическое повреждение скелетной мышцы представляет собой разрыв мышцы или сухожилия, перелом кости. В частных вариантах воплощения изобретения комбинация вводится субъекту внутримышечно.

Настоящее изобретение также включает способ индукции ангиогенеза, регенерации нервных волокон кровеносных сосудов и/или регенерации скелетной мышцы у субъекта, включающий введение субъекту комбинации по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения субъект характеризуется наличием состояния и/или заболевания, связанного с недостаточностью кровообращения, нейродегенеративного заболевания и/или травматического повреждения скелетной мышцы. В частных вариантах воплощения изобретения состояние и/или заболевание, связанное с недостаточностью кровообращения, представляет собой ишемическую болезнь сердца, ишемию нижних конечностей. В частных вариантах воплощения изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой боковой амиотрофический склероз, травму периферического нерва, травму спинного мозга. В частных вариантах воплощения изобретения травматическое повреждение скелетной мышцы представляет собой разрыв мышцы, сухожилия, перелом кости. В частных вариантах воплощения изобретения комбинация вводится субъекту внутримышечно.

Комбинация и способ по изобретению являются перспективными для применения в медицине, а именно для стимулирования ангиогенеза, более конкретно для лечения состояний, связанных с недостаточностью кровообращения, а также лечения нейродегенеративных заболеваний и травматических повреждений скелетной мышцы, и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии для лечения состояний, связанных с недостаточным кровообращением (в частности, ишемическая болезнь сердца, ишемия нижних конечностей), с нарушением нейротрофической функции, для лечения неврологических заболеваний (в частности, боковой амиотрофический склероз, травма периферического нерва, травма спинного мозга). Таким образом предметом настоящего изобретения также является способ профилактики и/или лечения состояния и/или заболевания у субъекта, связанного с недостаточным кровообращением (в частности, ишемическая болезнь сердца, ишемия нижних конечностей), с нарушением нейротрофической функции, способ лечения нейродегенеративных заболеваний (в частности, боковой амиотрофический склероз, травма периферического нерва, травма спинного мозга).

Помимо лечения ишемии нижних конечностей настоящее изобретение может быть использовано, в частности для лечения ишемической болезни сердца, диабетической ангио- и нейропатии, в спортивной медицине. Исходя из неожиданно выявленных свойств новой генной конструкции по изобретению возможно использование данной генной конструкции в спортивной медицине и травматологии при таких состояниях как: разрывы мышц, сухожилий, тяжелые переломы костей. При вышеуказанных состояниях для полноценного восстановления ткани крайне необходимо хорошее кровоснабжение, обеспечить которое организм иногда самостоятельно не может ввиду низких компенсаторных возможностей (пожилой возраст, сопутствующие заболевания и т.д.). Настоящее изобретение может применяться как в варианте самостоятельной терапии, так и в сочетании с хирургическим вмешательством для усиления эффекта операции. Полученные экспериментальные данные продемонстрировали выраженный эффект стимулирования регенерации скелетной мышцы, что может быть эффективным при различных травматических повреждениях мышц (у спортсменов, при травмах и т.д.). Таким образом, эффект усиления ангиогенеза может иметь широкую перспективу использования, в частности, в спортивной медицине и травматологии.

За счет присутствия в комбинации по изобретению глиального нейротрофического фактора (GDNF) перспективным представляется использование данной генной комбинации при нейродегенеративных поражениях и травмах спинного мозга. Таким образом, перспективы клинического применения инновационной комбинации генов по изобретению охватывает широкую область биотехнологий и количество заболеваний, при котором возможно ее применение.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Карта плазмидного вектора pBudK-coGDNF (4183 п. о.).

Фигура 2. Карта плазмидного вектора pBudK-coVEGF-coANG (5762 п. о.).

Фигура 3. Сравнение результатов определения белка соединительной ткани виментина после создания ишемии в образце с применением комбинации плазмид по изобретению и в контрольном образце.

Определения и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.

В описании данного изобретения термин «индукция ангиогенеза» обозначает стимулирование роста новых кровеносных сосудов.

В описании данного изобретения термин «регенерация нервных волокон кровеносных сосудов» относится к регенерации нервных тканей путем восстановления поврежденных тканей (восстановление структуры и функции) и/или стимуляции роста нервных волокон.

В описании данного изобретения термин «регенерация скелетной мышцы» относится к регенерации мышечной ткани путем восстановления поврежденных мышечных волокон (восстановление структуры и функции) и/или стимуляции роста новых мышечных волокон.

Плазмиды, используемые как векторы, - кольцевые двойные молекулы ДНК, отделившиеся от бактериальной или дрожжевой хромосомы, способные к копированию независимо от собственных хромосом микроорганизма. Специально созданные для молекулярного клонирования плазмиды обычно невелики (несколько килобаз величиной) и содержат три обязательных компонента: оригинал для репликации (копирования в кишечной палочке или в дрожжах), один или более избирательных маркеров (например, ген, определяющий устойчивость к антибиотикам) и один или более сайтов рестрикции, которые могут быть использованы для удаления чужеродной ДНК. Важные этапы, связанные с клонированием в плазмиде чужеродной ДНК с сайтом рестрикции EcoRI. Идентификация колоний, которые содержат искомую рекомбинантную плазмиду с последующим массовым ростом и выделением чистой плазмидной ДНК, позволяет накопить большие количества клонированной вставки.

Способ терапевтического применения

Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества комбинации по изобретению. Термин «терапевтически эффективное количество» подразумевает такое количество комбинации по изобретению, которое при введении в качестве моно- или комбинированной терапии вызывает индукцию ангиогенеза, регенерацию нервных волокон кровеносных сосудов и/или регенерацию скелетной мышцы. При применении комбинации по изобретению в комбинированной терапии с другими терапевтическими средствами термин «терапевтически эффективное количество» относится к комбинации количеств активных ингредиентов, прием которых ведет к превентивному или терапевтическому эффекту при последовательном или одновременном приеме. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от вида млекопитающего, возраста и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Комбинация по изобретению может быть введена в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения и/или профилактики, предпочтительно внутримышечно. Количество комбинации по изобретению, которое будет эффективным в лечении или профилактике конкретного расстройства или состояния, зависит, в частности, от хорошо известных факторов, влияющих на эффективную дозировку препаратов. Точный уровень дозировки, определяемый лечащим врачом, зависит от хорошо известных факторов, включающих способ введения, а также возраста, массы тела, пола и общего состояния здоровья пациента; характера, тяжести и клинического состояния заболевания; использования (или неиспользования) сопутствующей терапии.

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат, комбинацию по изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, растворителей и/или наполнителей. Данные композиции также могут содержать один или несколько дополнительных терапевтических агентов. С другой стороны, комбинация данного изобретения может быть введена субъекту, нуждающемуся в соответствующей терапии, в комбинации с одним или более других терапевтических режимов.

Фармацевтические композиции по изобретению содержат комбинацию данного изобретения совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазочные материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. За исключением таких случаев, когда среда обычных носителей несовместима с комбинацией плазмид изобретения, например, при появлении любых нежелательных биологических эффектов и иных нежелательных взаимодействий с любым другим компонентом (компонентами) фармацевтической композиции, использование таких композиций находится в рамках данного изобретения. В некоторых вариантах воплощения изобретения композиции представляют собой раствор, включающий комбинацию по изобретения (соотношение плазмид 1:1) и стерильный изотонический раствор хлорида натрия.

Осуществление изобретения

1. Плазмидные векторы pBudK

В настоящем изобретении использовали вектор pBudK - вектор, предназначенный для одновременного клонирования двух генов. Вектор содержит немедленный ранний промотор цитомегаловируса CMV (англ. Human cytomegalovirus immediate-early promoter) и промотор фактора элонгации человека EF1 альфа (англ. Human elongation factor la subunit) для независимой экспрессии двух генов. В таблице ниже приведены характеристики структурных элементов данного вектора (Таблица 1).

2. Кодонная оптимизация нуклеотидных последовательностей генов VEGF, ANG, GDNF.

Кодонная оптимизация повышает эффективность трансляции мРНК в полипептиды, тем самым повышая эффективность экспрессионных векторов, применяемых, в том числе, в генной терапии. Чем выше частота встречаемости того или иного кодона, используемого для кодирования аминокислоты в организме, тем с большей скоростью он будет транслироваться рибосомами вследствие высокой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такой кодон. При этом в качестве оптимальных кодонов используют наиболее часто встречающиеся синонимические кодоны генов организма-реципиента. Считается, что такие модификации могут повысить эффективность экспрессии терапевтического гена. Оптимизация кодонного состава реализуется с помощью сайт направленного мутагенеза или химического синтеза нуклеотидной последовательности de novo. Дикий тип нуклеотидных последовательностей кодирующей части генов VEGF, ANG, GDNF содержат тандем редких кодонов, которые могут остановить трансляцию или снизить ее эффективность. При оптимизации кодонного состава дикого типа генов VEGF, ANG, GDNF был улучшен индекс адаптации кодонов CAI (англ. Codon Adaptation Index) до 0,95. Для увеличения стабильности мРНК был оптимизирован GC-состав и удалены протяженные участки с высоким содержанием GC-nap. Кроме того, процесс оптимизации удалил потенциальные цис-действующие сайты. В результате кодонной оптимизации аминокислотные последовательности генов VEGF, ANG, GDNF не изменились.

3. Создание плазмид pBudK-coVEGF-coANG и pBudK-coGDNF по изобретению.

Была проведена модификация двухкассетного плазмидного вектора pBudCE4.1:

1. Добавлены рекомбинационные последовательности Gateway attBI и attBII;

2. Последовательность гена устойчивости к зеоцину и его промотор заменены на последовательность гена устойчивости к канамицину. Гены устойчивости к зеоцину и канамицину используют как для селекции плазмидного вектора в клетках бактерий, так и для селекции трансфицированных плазмидным вектором эукариотических клеток. Замена гена устойчивости к зеоцину обусловлена тем, что его экспрессия в эукариотических клетках (в том числе клетках человека) приводит к появлению чужеродного белка (продукта экспрессии гена), который может вызывать появление устойчивости к антибиотику и представлять собой потенциальный аллерген. Как результат была снижена вероятность возникновения нежелательных иммунных реакций.

3. Удалены последовательности меток (тэгов) V5-His (3127-3195 п. н.) и myc-His (719-782 п. н.). Целевому продукту модификации присвоено обозначение pBudK.

Правильность сборки генетических конструкций pBudK-coVEGF-coANG и pBudK-coGDNF подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру.

Пример 1. Оценка индукции ангиогенеза после введения плазмид с ангиогенными и нейротрофическими факторами.

Экспериментальные исследования были проведены на вьетнамских вислобрюхих свиньях. Первоначально было выполнено хирургическое вмешательство по моделированию ишемии задних конечностей с последующим введением комбинации плазмид pBudK-coVEGF-coANG+pBudK-coGDNF по изобретению. Животные сразу после создания ишемии получали инъекцию генетических конструкций в 4 точки в следующие мышцы (по 2 точки в каждой мышце) ишемизированной конечности: 1) икроножная мышца, на 2 и 5 см отступя от ахиллова сухожилия, 2) передняя большеберцовая мышца, на 3 и 5 см отступя от латеральной лодыжки. Оценку эффективности стимулирования ангиогенеза и улучшения кровотока в конечности производили посредством двух методов: проведения иммуногистохимического (далее ИГХ) исследования с антителами против маркеров эндотелиальных клеток (CD31) и посредством измерения кровотока в прооперированной конечности с помощью аппарата лазерной допплеровской флоуметрии. С помощью ИГХ-исследования было выявлено увеличение количества кровеносных сосудов более чем в 2,5 раза по сравнению с группой контроля (группе контроля вводили NaCl). Лазерная допплеровская флоуметрия позволяет количественно оценить перфузию в ишемизированной конечности после введения генетических конструкций. Выявлено усиление перфузии в ишемизированной конечности на 45% после введения генетических конструкций по изобретению.

Пример 2. Определение белка соединительной ткани методом вестерн-блотта после создания ишемии и введения плазмид с ангиогенными и нейротрофическими факторами.

Вестерн-блоттинг представляет процедуру, включающую разделение смеси белков гель-электрофорезом с последующим электропереносом на подходящую мембрану (например, PVDF). После переноса белков на мембрану PVDF, они могут быть окрашены для визуализации и непосредственно идентифицированы методами N-концевого секвенирования, масс-спектрометрии или иммунологического анализа. Иммунодетекция включает идентификацию белка через его реакцию со специфичным антителом. За счет пространственного разрешения, этот метод обеспечивает информацию о молекулярной массе отдельных белков и различает изоформы, промежуточные продукты, и другие постгрансляционно модифицированные формы.

Непосредственно сразу после вывода животных из эксперимента икроножную и переднюю болыпеберцовую мышцы в области ишемии немедленно удаляли и подвергали вестерн-блоттингу (n=4 для каждой группы). Общий белок экстрагировали из икроножной и передней болыпеберцовой мышцы в буфере RIPA (Sigma) по стандартному протоколу. После измерения концентрации белка в каждом образце белковые лизаты подвергали SDS-PAGE и переносили на поливинилиденфторидные мембраны. Мембраны блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре в 5% обезжиренном сухом молоке в PBS / 0,5% Твин 20. Затем мембраны промывали в PBS / 0,5% Твин 20 и инкубировали в течение ночи при 4°С с антителом. Комплексы антиген-антитело детектировали с помощью антител, конъюгированных с хреном (HRP), и разрабатывали с использованием набора субстратов для вестерн-блоттинга ECL (HRP) в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies, Carlsbad, СА, USA). Плотность полос определяли количественно с использованием Image J версии 1.46 после вычитания фона и нормализовали относительно уровня b-actin.

Полученные результаты:

Виментин (англ. Vimentin) - белок промежуточных филаментов соединительных тканей и других тканей мезодермального происхождения. В данном случае, уменьшение виментина в группах, в которых применяли комбинацию плазмид по изобретению, можно рассматривать как уменьшение количества соединительной ткани (т.е. фиброза) в мышцах, т.е. уменьшение степени ишемии по сравнению с контролем (табл. 2, фиг. 3).

Помимо этого, настоящее изобретение является перспективным для повышения эффективности лечения травм соединительной ткани и/или заболеваний опорно-двигательного аппарата человека. В частности, это касается травматических повреждений скелетной мышцы. Результаты проведенных экспериментов показали, что при введении данной генетической конструкции увеличивается количество центрально-ядерных мышечных волокон в 81 раз по сравнению с группой контроля (группе контроля вводили NaCl). Увеличение количества центрально-ядерных мышечных волокон происходит в фазе активной регенерации скелетной мышцы, что является неочевидным доказательством регенераторного эффекта применения данной генной конструкции.

Комбинация двух двухкассетных плазмид по изобретению позволяет осуществлять одновременную экспрессию генов, что увеличивает эффективность проводимой генной терапии за счет наличия синергизма между генами посредством одновременной экспрессии терапевтических генов по изобретению. В результате, помимо более высокой биобезопасности плазмидного вектора можно рассчитывать на более выраженное усиление ангиогенеза и усиление регенеративных процессов.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к комбинации двух рекомбинантных экспрессирующих плазмид - pBudK-coVEGF-coANG и pBudK-coGDNF. Изобретение эффективно для лечения состояний, связанных с недостаточностью кровообращения, в частности в сердечно-сосудистой хирургии, а также лечения травматических повреждений скелетной мышцы, с применением комбинации генов, кодирующих синтез проангиогенных и нейротрофических факторов. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Комбинация рекомбинантной экспрессирующей плазмиды pBudK-coVEGF-coANG, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VEGF, и нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ANG, и рекомбинантной экспрессирующей плазмиды pBud-coGDNF, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок GDNF;

для индукции ангиогенеза.

2. Комбинация по п. 1, в которой последовательность рекомбинантной экспрессирующей плазмиды pBudK-coVEGF-coANG представляет собой последовательность SEQ ID NO:1.

3. Комбинация по п. 1, которой последовательность рекомбинантной экспрессирующей плазмиды pBud-coGDNF представляет собой последовательность SEQ ID NO:2.

4. Применение комбинации по п. 1 для профилактики или лечения состояния или заболевания, связанного с недостаточностью кровообращения у субъекта.

5. Применение по п. 4, в котором состояние или заболевание, связанное с недостаточностью кровообращения, представляет собой ишемическую болезнь сердца, ишемию нижних конечностей.

6. Применение по п. 4, в котором комбинация вводится субъекту внутримышечно.

7. Способ индукции ангиогенеза у субъекта, включающий введение субъекту комбинации по п. 1.