Препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани и способ его использования Российский патент 2024 года по МПК A61K48/00 A61K38/18 C07K14/475 C12N15/864 A61P25/00 

Заявленная группа изобретений в целом относится к области медицины, более точно - к генной терапии, направленной на стимулирование регенерации и нейропротекции нервной ткани.

В мире существует проблема стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани. Известно, что в результате повреждения нервной ткани происходит дегенерация нейронов, снижение сосудистой проводимости, потеря нейронных связей, что усугубляет когнитивные и двигательные симптомы. У пациентов, принимающих препараты указанного назначения, со временем происходит привыкание к ним, поэтому остро стоит проблема разработки новых препаратов указанного назначения.

Глиальный нейротрофический фактор (GDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) являются факторами роста, способствующими выживанию нейронов, росту аксонов и восстановлению функций, поддерживая рост и дифференцировку нервных клеток, усиливая ангиогенез и способствуя восстановлению нейронных связей.

В заявленном техническом решении разработан препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, содержащий рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1 (AAV9-coGDNF); CNTF, представленную SEQ ID NO:2 (AAV9-coCNTF); VEGF, представленную SEQ ID NO:3 (AAV9-coVEGF); или любую их комбинацию (далее - заявленный препарат), и способ его использования.

Заявленный препарат по заявленному способу позволяет усилить экспрессию белков нейротрофических и ангиогенных факторов GDNF, CNTF, VEGF в нервной ткани пациента, способствуя стимулированию регенерации и нейропротекции нервной ткани.

Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка.

Аденоассоциированный вирус (AAV) - малый вирус, инфицирующий клетки человека и некоторых других приматов, который не вызывает заболевания у человека и, соответственно, вызывает слабый иммунный ответ.

Препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани - препарат, содержаний рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий заявленные последовательности.

Генная терапия - совокупность генно-инженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний (ФЗ от 5 июля 1996 г. N 86-ФЗ).

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) - сигнальный белок, вырабатываемый клетками для стимулирования васкулогенеза (образование эмбриональной сосудистой системы) и ангиогенеза (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе).

Глиальный нейротрофический фактор (GDNF) - белок, который является мощным стимулятором выживания нейронов, роста нервных волокон и миелинизации.

Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) - белок, для которого показана возможность защиты мотонейронов in vitro и in vivo после индуцированного аксотомией апоптоза у грызунов.

Нейротрофический фактор мозга (BDNF) - белок, относится к нейротрофинам, веществам, стимулирующим и поддерживающим развитие нейронов.

Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1) - белок из семейства инсулиноподобных факторов роста, участвует в эндокринной, аутокринной и паракринной регуляции процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма.

Иммуноцитохимия (ИЦХ, англ. Immunocytochemistry) - аналитический метод, используемый для визуализации локализации определенного белка или антигена в клетках с помощью специфического первичного антитела, которое связывается с ним. Первичное антитело позволяет визуализировать белок под флуоресцентным микроскопом, когда он связывается со вторичным антителом, имеющим конъюгированный флуорофор.

Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ.Western blot) - аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков. На первом этапе используют электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку.

Индекс адаптации кодонов (CAI) - наиболее распространенный метод анализа систематической ошибки использования кодонов. CAI измеряет отклонение кодирования белка, последовательность гена по отношению к эталонному набору генов. CAI используется в качестве количественного метода прогнозирования уровня экспрессии гена на основе его кодоновой последовательности.

GC состав - доля гуанина (G) и цитозина (C) среди всех нуклеотидов рассматриваемой нуклеотидной последовательности.

Интраспинальное введение - доставка вещества непосредственно в спинной мозг.

Интратекальное введение - доставка вещества в подоболочечное пространство, т. е. субарахноидально после прокола твердой мозговой оболочки.

Повреждение нервной ткани, вызванное различными факторами, приводит к тяжелым неврологическим осложнениям, приводящим к значительным нарушениям или полной потере функций. Несмотря на продолжающиеся научные исследования, разработка эффективных методов лечения повреждений нервной ткани центральной нервной системы (ЦНС) остается сложной задачей. Существующие методы лечения, включая хирургическое восстановление и физиотерапию, часто не дают адекватных результатов из-за ограниченной способности к регенерации и отсутствия нейропротекторных факторов в месте повреждения или неэффективной экспрессии и доставки нейропротекторных факторов.

С другой стороны, перспективным направлением лечения повреждений нервных волокон является генная терапия. Введение специфических генов, кодирующих нейропротекторные факторы, непосредственно в место повреждения, показало, что они могут способствовать выживанию нейронов, регенерации аксонов и восстановлению функций. При этом эффективная доставка и устойчивая экспрессия этих генов являются решающими факторами для достижения терапевтической эффективности. В контексте повреждения нервной ткани было установлено, что несколько факторов роста играют решающую роль в процессе регенерации и восстановления нервов.

Тремя такими факторами роста являются глиальный нейротрофический фактор (GDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Благодаря оптимизации кодонов в генетических конструкциях достигается повышенная и устойчивая экспрессия нейропротекторных факторов GDNF, CNTF и VEGF, что обеспечивает улучшение терапевтических результатов.

GDNF - это нейротрофический фактор, который в основном экспрессируется и секретируется глиальными клетками, являющимися опорными клетками для нейронов в нервной системе. GDNF играет важнейшую роль в росте, выживании и дифференцировке нервных волокон. После травмы нерва уровень GDNF в поврежденной области повышается, способствуя регенерации нерва. GDNF воздействует на поврежденные нервные волокна, связываясь со специфическими рецепторными тирозинкиназами, и запускает сигнальный каскад, способствующий выживанию и росту нейронов. Он защищает нейроны от клеточной гибели, стимулирует рост аксонов и привлекает конусы роста регенерирующих нервных волокон к тканям мишеням. GDNF также способствует прорастанию аксонов от соседних неповрежденных нервов, что позволяет восстанавливать поврежденные нейронные цепи.

CNTF - еще один нейротрофический фактор, играющий важную роль в регенерации и восстановлении нервов. Он вырабатывается различными типами клеток нервной системы, включая нейроны, астроциты и шванновские клетки. CNTF воздействует на поврежденные нервные волокна, связываясь со специфическими рецепторами на их поверхности. CNTF способствует выживанию нейронов, регенерации аксонов и восстановлению функций после повреждения нервной ткани. Он поддерживает рост и ветвление регенерирующих аксонов, способствует образованию новых синапсов и восстановлению связей между поврежденными нейронами. Стимулируя экспрессию специфических генов, CNTF также регулирует рост и дифференцировку шванновских клеток, которые имеют решающее значение для регенерации нерв.

VEGF - ангиогенный фактор, известный прежде всего своей ролью в стимулировании роста кровеносных сосудов. Однако он также играет важную роль в регенерации нервов. После повреждения нерва VEGF повышается, что приводит к увеличению кровоснабжения и насыщению кислородом поврежденного участка. Это способствует выживанию нервных клеток и создает благоприятные условия для регенерации нерва. Помимо ангиогенных свойств, VEGF также выступает в роли нейротрофического фактора. Он непосредственно способствует выживанию и росту нейронов. VEGF стимулирует рост и ветвление аксонов, которые являются важнейшими этапами регенерации нервов. Повышение уровня VEGF позволяет повысить регенеративную способность поврежденных нейронов, что приводит к улучшению их функционального восстановления.

Таким образом, GDNF, CNTF и VEGF являются факторами роста, играющими важнейшую роль в процессе регенерации и восстановления нервной ткани. В совокупности описанные факторы могут более эффективно способствовать выживанию нейронов, росту аксонов и восстановлению функций, поддерживая рост и дифференцировку нервных клеток, усиливая ангиогенез и способствовать восстановлению нейронных связей.

Заявленное техническое решение основывается на идее того, что доставка факторов GDNF, CNTF и VEGF способствует стимулированию регенерации и нейропротекции нервной ткани. Заявленное техническое решение заключается в обеспечении возможности доставки GDNF, CNTF и VEGF с использованием известных как таковых методов генной терапии (однократная или многократная интраспинальная, и/или интратекальная, и/или внутривенная инъекция AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF). Известно, что AAV9 используют для лечения ряда заболеваний ЦНС. При этом AAV9 обладает способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер и специфически трансдуцировать клетки нервной системы, что позволяет эффективно доставлять гены к нейронам головного и спинного мозга.

Таким образом, для экспрессии трансгена, используя серотип специфически нацеленного на нейроны ЦНС, достижение максимального эффекта генной терапии становится возможным. Указанный технический результат становится возможным вследствие введения AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF который позволяет предотвратить развитие процессов на фоне повреждения нервной ткани. Заявленное техническое решение обеспечивает возможность восполнения недостатка нейропротекторных факторов GDNF, CNTF и VEGF в ЦНС и, как следствие, обеспечивает возможность стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани.

На дату представления заявочных материалов выявлено, что для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани преимущественно используется хирургическое восстановление и физиотерапия, при этом также активно исследуются новые подходы к терапии этих заболеваний.

Выявлены находящиеся на стадии разработки перспективные терапевтические стратегии, которые активно исследуются на дату представления заявочных материалов.

Так, известно проведение инъекций AAV-CNTFmCherry самкам крыс линии Fisher в корковые области мозга за 2 недели до травмы спинного мозга. Векторы AAV состояли из основной цепи ДНК AAV2 в капсиде AAV1. В опытной группе было отмечено прорастание неповрежденных аксонов, что подтверждает потенциал CNTF усиливать регенерацию аксонов в спинном мозге путем преобразования соответствующих популяций нейронов в сенсомоторной коре [Hodgetts et al. Cortical AAV-CNTF Gene Therapy Combined with Intraspinal Mesenchymal Precursor Cell Transplantation Promotes Functional and Morphological Outcomes after Spinal Cord Injury in Adult Rats.].

Известны внутриполостные инъекции AAV-BDNF и AAV-GDNF взрослым самцам крыс линии Wistar, которых распределили на 2 группы и были проведены две односторонние внутриполостные инъекции AAV-BDNF и AAV-GDNF. Через 3 недели на крыс воздействовали нейроцитотоксином QA для имитации проявлений болезни Хантингтона, затем через 2 недели проводили оценку влияния AAV-BDNF и AAV-GDNF на нейроны полосатого тела. Была показана возможность обеспечения нейротрофической поддержки субпопуляций нейронов полосатого тела, которые уязвимы к дегенерации после воздействия QA [Kells et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease].

Известны интрацеребровентрикулярные инъекции AAV4-IGF-1 или AAV4-VEGF-165 самкам и самцам мышей SOD1G93A. При использовании комбинации вводили AAV4-IGF-1 и AAV4-VEGF-165, при этом не наблюдалось статистически значимых улучшений выживаемости по сравнению с контрольной группой. Эти данные показали, что и IGF-1, и VEGF-165 могут оказывать умеренный положительный эаффект в замедлении прогрессирования заболевания, однако комбинация этих двух факторов не дала дополнительных или синергических преимуществ [Dodge et al. AAV4-mediated expression of IGF-1 and VEGF within cellular components of the ventricular system improves survival outcome in familial ALS mice.].

Известно введение мышам линии SOD1G93A вектора EIAV-VEGF в икроножные мышцы задних конечностей, диафрагму, межреберные, мышцы лица и языка до начала заболевания в возрасте трех недель, при этом были отмечены отсроченные признаки проявления бокового амиотрофического склероза при сравнении с контрольной группой [Azzouz et al., VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.].

Недостатками всех вышеперечисленных источников, по мнению заявителя, является отсутствие комплексного стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, включающего в себя комбинацию нейротрофических и ангиогенных факторов.

Заявителем проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани и выявлен ряд аналогов, которые используются в настоящее время для облегчения симптомов и для остановки усугубления нейродегенерации.

Из исследованного уровня техники выявлен ряд функциональных (по назначению) и структурных аналогов, применяющихся для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани на дату представления заявочных материалов.

Известно изобретение по патенту US20190062391 «Использование VEGF-B для лечения заболеваний, вызванных окислительным повреждением». Сущностью является способ лечения расстройства или заболевания, вызванного окислительным стрессом, включая введение VEGF-B субъекту; и химическое вещество, содержащее белок VEGF-B, VEGF-B, экспрессирующий плазмиды, VEGF-B, экспрессирующие вирусы и/или клетки, экспрессирующие VEGF-B, в качестве активных ингредиентов для лечения расстройства или заболевания, вызванного окислительным стрессом, включая заболевания нервной ткани. Сущностью является способ лечения расстройства или заболевания, вызванного окислительным стрессом у субъекта, включающий: введение субъекту VEGF-B. Метод по п. 1, где расстройство или заболевание, вызванное повреждением окислительного стресса, выбрано из рака, дегенеративного заболевания, воспаления, инсульта, болезни Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, катаракта, возрастная дегенерация желтого пятна, диабет, диабетическая дегенерация сетчатки, артрит, атеросклероз и сердечно-сосудистые заболевания. Метод по п. 1, отличающийся тем, что расстройство или заболевание, вызванное окислительным стрессом, представляет собой дегенеративное заболевание. Метод по п. 3, отличающийся тем, что дегенеративное заболевание представляет собой пигментный ретинит. Метод по п. 4, отличающийся тем, что VEGF-B лечит пигментный ретинит путем ингибирования дегенерации ткани сетчатки и дегенерации сосудов сетчатки. Метод по п. 5, отличающийся тем, что VEGF-B ингибирует дегенерацию ткани сетчатки и дегенерацию сосудов сетчатки путем усиления экспрессии антиоксидантных генов и генов, связанных с выживанием. и/или путем подавления экспрессии генов окислительного стресса и генов, связанных с апоптозом. Метод по п. 6, отличающийся тем, что антиоксидантные гены включают Gpx1, Sod1, Prdx5, Prdx6-rs1, Txnrd13, Sod2, Gpx5, Zmynd17, Gpx2, Txnrd1, Prdx1, Gpx6 и Gsr; гены, связанные с выживанием, включают SGK1, GDNF, CNTG, MDM4, SKP2, UNC5C, BDNF, Ubqln1 и CDNF; гены окислительного стресса включают Ptgs1, Nox4, Ncf2, Tpo и Ppp1r15b; а гены, связанные с апоптозом, включают Bid, Bax, Bik, Bad и Pmaip. Метод по п. 1, отличающийся тем, что VEGF-B вводят в форме белка VEGF-B, плазмид, экспрессирующих VEGF-B, вирусов, экспрессирующих VEGF-B, и/ или клетки, экспрессирующие VEGF-B. Метод по п. 1, где VEGF-B представляет собой VEGF-B 167 и/или VEGF-B 186. Метод по п. 1, где VEGF-B представляет собой модифицированный VEGF-B, модифицированный VEGF-B представляет собой циклизованный, фосфорилированный и/или метилированный VEGF-B.; или VEGF-B представляет собой рекомбинантный белок или полипептид, содержащий на 1-5 или меньше аминокислот, чем VEGF-B. Химическое вещество, содержащее белок VEGF-B, плазмиды, экспрессирующие VEGF-B, вирусы, экспрессирующие VEGF-B, и/или клетки, экспрессирующие VEGF-B, в качестве активных ингредиентов для лечения расстройств или заболеваний, вызванных окислительным стрессом. Химическое вещество по п. 11, где химическое вещество представляет собой фармацевтическую композицию, антиоксидант, продукт медицинского назначения или продукт против старения.

Применение способа, описанного в известном техническом решении, имеет недостаток - отсутствие дополнительных факторов трофической поддержки ткани, направленной на стимулирование регенерации и нейропротекции нервной ткани.

Для решения указанной проблемы необходимо применение дополнительных мер для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани - комплексную терапию, например, с применением заявленного препарата, что позволит обеспечить усиленную экспрессию нейротрофических и ангиогенных факторов.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU 2758760 «Способ лечения травматического повреждения спинного мозга». Краткой сущностью известного технического решения является способ лечения травматического повреждения спинного мозга, заключающийся в интратекальном введении генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих рекомбинантные гены человека, кодирующие нейротрофические факторы, а именно сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF и глиальный нейротрофический фактор GDNF, и молекулу адгезии нейрональных клеток NCAM. Сущностью является способ лечения травматического повреждения спинного мозга, включающий генную терапию и эпидуральную электростимуляцию, выделение тем, что сначала через четыре часа после травмы спинного мозга путем интратекальной инъекции вводит 2×10^6 и глиальный нейротрофический фактор GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, в 200 мкл раствора - 0,9% NaCl, а затем после купирования спинального шока начинается двухуровневая эпидуральная электростимуляция спинного мозга однонаправленным током с напряжением 25-35 Гц, силой тока 7-25 мА и длительность импульса 0,2 мс с электростимулятором Digitimer DS7A в течение шести недель через дневную продолжительность 30 минут в утреннее время, при этом процедура включает стимуляцию выше травмы уровня С5 позвонка и силу тока выбирают таким образом, чтобы она не вызывала болевых ощущений, и продолжительность 30 минут в вечернее время, при которой процедура направлена на возбуждение генераторов шагания ниже травмы на уровне L2 позвонка одновременно с тренировкой на беговой дорожке, при этом сила тока подстраивается индивидуально так, чтобы возникали шагательные движения. VEGF генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины человека, сверхэкспрессирующие рекомбинантные гены человека, кодирующие нейротрофические факторы, а именно сосудистый эндотелиальный фактор роста.

Таким образом, в известном изобретении описывается интратекальная доставка генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих рекомбинантные гены человека, кодирующие нейротрофические факторы VEGF и клеток GDNF, и молекулу адгезии нейрональных клеток NCAM, имеющего недостаток, связанный с неспецифической доставкой трофических факторов в области повреждения нервной ткани ввиду применения клеточной терапии.

Использование AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению позволяет добиться высокого уровня трансдукции клеток нервной системы, за счет способности данных векторов к нейротропизму и эффективной трансдукции клеток ЦНС [Zincarelli C. et al. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection], тем самым обеспечивая доставку нейротрофических и ангиогенных факторов в клетки поврежденной нервной ткани.

Известно изобретение по патенту US20170189488 «Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимулирования регенерации периферических нервов и способ лечения повреждений нервов у человека». Сущностью изобретения является способ лечения повреждения или травмы периферической нервной системы или регенерации ткани периферической нервной системы, включающий введение вектора, содержащего полинуклеотидные последовательности, кодирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF2). Способ по п. 1 для лечения повреждения или травмы периферической нервной системы. Способ по п., направленный на регенерацию тканей периферической нервной системы. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вектор вводят in vivo. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вектор вводят в участок повреждения или травмы периферической нервной системы или в ткань, подлежащую регенерации. Способ по п. 1, согласно которому вектор вводят в участок повреждения или повреждения периферической нервной системы, в участке, проксимальном или дистальном от повреждения периферической нервной системы, или на участках проксимальнее и дистальнее указанного повреждения. Способ по п. 1, включающий введение вектора интра-, пери- и/или параневрально. Способ по п. 1, включающий приведение вектора в контакт с нейроном или шванновской клеткой, астроцитом, микроглией и/или нейроном. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у субъекта имеется нейротмезис. Способ по п. 1, согласно которому у субъекта имеется диастатическое повреждение периферических нервов. Способ по п. 1, согласно которому у субъекта имеется повреждение периферических нервов, отличное от невротмезиса или диастатического повреждения периферических нервов. Способ по п. 1, согласно которому субъектом является человек. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вектор дополнительно содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует устойчивость к канамицину. Способ п. 1, отличающийся тем, что вектор содержит нуклеотиды, кодирующие FGF2, в положениях 699-1166 и нуклеотиды, кодирующие VEGF165, в положениях 3723-4298 SEQ ID NO: 1. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вектор содержит устойчивость к нуклеотидам канамицина в положениях 1469-2511 SEQ ID NO: 1. Способ по п. 1, где вектор представляет собой pBud(Kan)-VEGF-FGF2 (SEQ ID NO: 1). Вектор, содержащий полинуклеотидные последовательности, которые кодируют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF2) и устойчивость к канамицину. Вектор по п. 16, который содержит нуклеотиды, кодирующие FGF2, в положениях 699-1166 и нуклеотиды, кодирующие VEGF165, в положениях 3723-4298 SEQ ID NO: 1. 18. Вектор п. 16, имеющий SEQ ID NO: 1.

Таким образом, в известном изобретении описывается способ лечения повреждения или травмы периферической нервной системы путем введения кодон-оптимизированной рекомбинантной плазмиды с факторами VEGF и FGF2.

Недостатками известного технического решения является то, что, во-первых, эффективность проникновения композиции на основе плазмидного вектора ниже по сравнению с другими векторами, во-вторых, композиция на основе плазмидного вектора не специфически модифицирует клетки нервной ткани, в-третьих, эффективность сверхэкспрессии нейротрофических и ангиогенных факторов в составе двухкассетной плазмиды остается низкой.

При этом использование AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению позволяет добиться высокого и долгого уровня трансдукции клеток нервной ткани за счет способности данного вектора к тропизму нейронов, тем самым обеспечивая эффективную целевую доставку нейротрофических и ангиогенных факторов и их сверхэкспрессию.

Известно изобретение по патенту CN1569221 «Плазмидно-липосомный комплекс VEGF и его использование». Сущностью является плазмидно-липосомный комплекс сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF и его использованию при получении фармацевтической композиции, в частности к использованию плазмидно-липосомного комплекса VEGF при приготовлении фармацевтической композиции для лечения церебральной ишемии, способствующей дифференцировке стволовые клетки черепных нервов взрослых и регенерация нервных клеток. Комплекс плазмиды фактора роста эндотелия сосудов с липосомой, характеризующийся наличием полноразмерной последовательности ДНК VEGF165 человека, вставленной между промотором pCMV плазмиды pEGFP-N 1 и последовательностью гена-репортера EGFP, причем комплекс получают путем смешивания плазмиды VEGF с липосомой, при котором соотношение смешивания липосомы и плазмиды составляет: 2ul-20ul:1ug-10ug. Использование комплекса по п. 1 для приготовления мозгопротекторного препарата, способствующего восстановлению функций мозга, снижению гибели клеток нейронов и уменьшению очагов инфаркта мозга. Использование комплекса по п. 1 в приготовлении препарата для стимулирования индукции и дифференцировки нейрональных стволовых клеток в мозге взрослого человека, способствующего регенерации нейронов в мозге после черепно-мозговых травм и восстановления мозга. Использование комплекса по п. 1 для получения препарата, защищающего мозг, для лечения повреждений мозга, включающих инсульт и травматическое повреждение мозга, травматическую операцию на мозге и нейротоксическое повреждение мозга, вызванное лекарственными препаратами. Использование комплекса по п. 1 в приготовлении препарата для стимулирования дифференцировки регенерирующих зрелых нейронов в нейроны с ГАМК-эргической передачей функции. 6. использование комплекса по п. 1 в приготовлении препарата для стимулирования дифференцировки регенерирующих зрелых нейронов в нейроны с холинергической передачей функции. Использование комплекса по пункту 1 в препарате для восстановления локализованных нервов в стриатуме. Применение комплекса по п. 1 для получения препарата для профилактики и лечения болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера - заболеваний, связанных с нарушением двигательной или обучающей памяти вследствие повреждения нейронов в головном мозге.

Применение способа, описанного в известном техническом решении, имеет ряд недостатков - отсутствие дополнительных факторов трофической поддержки ткани, а также менее эффективная доставка генов в клетки нервной ткани, связанная с неспецифическим агентом.

Для решения указанной проблемы возможно применение дополнительных мер для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, например, терапия с применением заявленного препарата, что позволит более эффективно стимулировать регенерацию и нейропротекцию нервной ткани и обеспечить целевую доставку нейротрофических и ангиогенных факторов в нейроны.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту CN113454225 «ДНК-вектор генной терапии и его применение». Сущностью является генетическая конструкция ДНК-вектора VTvaf 17, несущего терапевтический ген, выбранный из группы генов BDNF, VEGFA, BFGF, NGF, GDNF, NT3, CNTF и IGF1. Генно-терапевтический ДНК-вектор на основе генно-терапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для использования в лечении заболеваний, связанных с дисфункцией центральной и периферической нервной системы, нарушениями нейрогенеза; для стимуляции роста нейронов, в том числе для использования в улучшении потенциала клеточной терапии и аллотрансплантации; и для улучшения нейрогенеза, в том числе для использования в лечении таких заболеваний, как травмы, нейродегенеративные заболевания, диабетическая половая нейропатия, состояния, приводящие к повреждению центральной нервной системы, и состояния после острой ишемии; для улучшения когнитивных функций в качестве нейропротекторного эффекта против окислительного стресса, где указанный ДНК-вектор генной терапии имеет кодирующую область терапевтического гена VEGFA, клонированную в ДНК-вектор генной терапии VTvaf17 для формирования генной терапии, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA. Генно-терапевтический ДНК-вектор VTvaf17 для применения при лечении заболеваний, связанных с дисфункцией центральной и периферической нервной системы, нарушениями нейрогенеза; для стимуляции роста нейронов, в том числе для улучшения потенциала клеточной терапии и аллогенных трансплантатов; для улучшения нейрогенеза, в том числе для лечения таких заболеваний, как травмы, нейродегенеративные заболевания, диабетическая половая нейропатия, состояния, приводящие к повреждению центральной нервной системы, и состояния после острой ишемии; для улучшения когнитивных функций в качестве нейропротекторного эффекта против окислительного стресса, где указанный ДНК-вектор генной терапии имеет кодирующую область терапевтического гена GDNF, клонированную в ДНК-вектор генной терапии VTvaf17 с образованием генной терапии, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 5 ДНК-вектор VTvaf17-GDNF. Генно-терапевтические ДНК-векторы на основе генно-терапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для использования в лечении заболеваний, связанных с дисфункцией центральной и периферической нервной системы, нарушений нейрогенеза; для стимуляции роста нейронов, в том числе для улучшения потенциала клеточной терапии и аллогенных трансплантатов; для улучшения нейрогенеза, в том числе для лечения таких заболеваний, как травмы, нейродегенеративные заболевания, диабетическая половая нейропатия, состояния, приводящие к повреждению центральной нервной системы, и состояния после острой ишемии; для улучшения когнитивных функций в качестве нейропротекторного эффекта против окислительного стресса, где указанный вектор ДНК генной терапии имеет кодирующую область, клонированную в терапевтический ген CNTF вектора ДНК генной терапии VTvaf17 для формирования генной терапии, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 7 ДНК-вектор VTvaf17-CNTF.

Применение вектора, описанного в известном техническом решении, имеет недостаток - отсутствие тропности ДНК-вектора VTvaf17 к нейронам, что уменьшает эффективность его использования в ЦНС.

Для решения указанной проблемы необходима разработка препарата для более специфичной доставки нейротрофичеких и ангиогенных факторов. AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению имеют способность трансдуцировать нейроны в связи с высоким уровнем тропности используемого серотипа к нейрональным клеткам, тем самым обеспечивая целевую доставку нейротрофических и ангиогенных факторов.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту CN101397573 «Ретровирусный вектор для экспрессии нейротрофического фактора, происходящего из линии глиальных клеток, и его применение». Краткой сущностью известного технического решения является лентивирусный вектор для экспрессии глиального нейротрофического фактора GDNF, и его применения, относящиеся к области медицинской биотехнологии. Лентивирусный вектор, экспрессирующий глиально-производный нейротрофический фактор, депозитный номер которого CGMCC No. 2086. Метод in vitro трансфекции нейральных стволовых клеток лентивирусным вектором CGMCC No.2086, экспрессирующим глиально-производный нейротрофический фактор и экспрессию, характеризующийся тем, что: нейросферы разбивают трипсином на одноклеточную суспензию, инокулируют в покрытую фибронектином чашку Петри при плотности 2,5×105/мл и культивируют не менее шести часов, затем в 250 мл среды для культивирования нейральных стволовых клеток добавляют MOI=0,5-10 лентивирусного вектора CGMCC No.2086. После, по крайней мере, шести часов инкубации, 250 мл лентивирусного вектора CGMCC No.2086 с MOI=0,5-10 добавляют в среду нейральных стволовых клеток, полибрен (когезивный амин) добавляют к супернатанту, и клетки трансфецируют в течение 20 часов. Метод in vitro трансфекции нейральных стволовых клеток лентивирусным вектором CGMCC № 2086, экспрессирующим глиально-производный нейротрофический фактор и экспрессию по пункту 2, характеризующийся тем, что: указанный MOI = 1,0. Использование лентивирусного вектора CGMCC № 2086, экспрессирующего глиально-производный нейротрофический фактор, для получения препарата для лечения нейродегенеративных заболеваний. Использование лентивирусного вектора CGMCC № 2086, экспрессирующего глиально-производный нейротрофический фактор, для приготовления терапевтического средства для лечения нейродегенеративного заболевания по п. 4, характеризующееся тем, что: указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

Недостатком известного технического решения является выбор рекомбинантного вектора на основе ретровируса для доставки генов нейротрофических факторов. Ретровирусы неспецифически трансдуцируют клетки организма и могут вызывать иммунные реакции и изменения функционирования клеток.

Для решения указанной проблемы необходим выбор более безопасного и специфического препарата для доставки генов нейротрофических и ангиогенных факторов в клетки организма. AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению способны специфично трансдуцировать нейроны и обладают низкой иммуногенностью.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту WO2023183594 «Способы и композиции для лечения болезни Паркинсона». Сущностью является способ лечения болезни Паркинсона, включающий местное или системное введение пациентам рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего трансген глиального нейротрофического фактора (GDNF). Способ замедления или ингибирования прогрессирования болезни Паркинсона (БП) у субъекта, нуждающегося в этом, метод включает в себя: введение субъекту рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащего трансген глиального нейротрофического фактора (GDNF), оперативно связанный с промотором, где по меньшей мере 30% объема путамена субъекта трансдуцировано трансгеном GDNF, и где у субъекта не наблюдается усиления симптомов, связанных с БП, в течение по меньшей мере 6 месяцев после введения по сравнению с предшествующим введением. Способ по пункту 1, где rAAV вводится путем системного введения. Способ по пункту 1, где rAAV вводится путем местного введения. Способ по пункту 3, где локальное введение - это введение непосредственно в путамен субъекта. Способ по пункту 3 или 4, где локальное введение включает в себя непосредственное введение rAAV в каждый из путаменов субъекта. Способ по пункту 1, где rAAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10 или их рациональный гаплоид.

Таким образом, в известном изобретении описывается местная и сАистемная доставка терапевтических рекомбинантных векторов (rAAV), содержащих трансген нейротрофического фактора GDNF для лечения болезни Паркинсона, имеющего недостаток, связанный с отсутствием дополнительных мер трофической и ангиогенной поддержки нервной ткани.

Для решения описанной проблемы необходима разработка комбинации нейротрофических и ангиогенных препаратов. AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению позволяют более эффективно стимулировать регенерацию и нейропротекцию нервной ткани.

Известно изобретение по патенту RU 2527169 «Генетическая конструкция, содержащая HGDNF под контролем температурочувствительного промотора для регулируемой экспрессии нейротрофического фактора как в клетках, так и непосредственно в организме млекопитающих». Сущностью является генетическая конструкция на основе векторной плазмиды pEGFP-N1 с геном устойчивости к неомицину, содержащая под контролем терморегулируемого промотора гена белка теплового шока hsp70 Drosophila melanogaster ген человеческого нейротрофического фактора GDNF с элементами теплового шока HSE 4-8 и ген зеленого флуоресцентного белка GFP. Генетическая конструкция для экспрессии GDNF в клетках и тканях млекопитающих (в том числе и человека) при повышении температуры, сконструированная на основе векторной плазмиды pEGFP-N1 с геном устойчивости к неомицину, содержащая фрагмент ДНК, кодирующий регуляторную последовательность промотора гена белка теплового шока hsp70 Drosophila melanogaster с элементами теплового шока HSE 4-8, ген нейротрофического фактора GDNF человека, ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), находящиеся под контролем данного промотора, при этом промотор способен активироваться под действием температуры теплового шока млекопитающих или токсическом воздействии и регулировать интенсивность экспрессии гена GDNF за счет наличия элементов теплового шока HSE 4-8.

Недостатками известного технического решения является низкая эффективность трансфекции композиции на основе плазмидного вектора в тела нейронов и неспецифичность модификации клеток нервной ткани.

Использование AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению позволяет добиться высокого уровня трансдукции клеток нервной ткани за счет способности заявленного препарата к тропизму нейронов, тем самым обеспечивая эффективную целевую доставку нейротрофических и ангиогенных факторов.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту US20020187951 «Генная терапия лентивирусными факторами роста при нейродегенеративных заболеваниях». Сущностью является способы лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний путем введения лентивирусного вектора, который экспрессирует GDNF, такого как GDNF человека, или его варианта, гомолога, аналога или производного. Метод лечения или профилактики нейродегенеративного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в нервной системе млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, оперативно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанное нейродегенеративное заболевание. Метод лечения или профилактики нейродегенеративного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в мозге млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, оперативно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанное нейродегенеративное заболевание. Метод лечения или предотвращения симптомов нейродегенеративного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в нервной системе млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, оперативно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанное нейродегенеративное заболевание. Метод лечения или предотвращения симптомов нейродегенеративного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в мозге млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, оперативно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанное нейродегенеративное заболевание. Метод лечения или профилактики болезни Паркинсона у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в нервной системе млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, операбельно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанную болезнь Паркинсона. Метод лечения или профилактики болезни Паркинсона у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в мозге млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновых кислот, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, оперативно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанную болезнь Паркинсона. Метод лечения или предотвращения симптомов болезни Паркинсона у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в нервной системе млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, операбельно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанные симптомы болезни Паркинсона. Метод лечения или предотвращения симптомов болезни Паркинсона у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в мозге млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, операбельно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанные симптомы болезни Паркинсона. Метод лечения или предотвращения нигростриатальной дегенерации и/или индуцирования нигростриатальной регенерации у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в мозге млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновых кислот, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, оперативно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанную нигростриатальную дегенерацию и/или индуцируя нигростриатальную регенерацию. Метод лечения или предотвращения нигростриатальной дегенерации и/или индуцирования нигростриатальной регенерации у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение лентивирусного вектора в клетку-мишень в нервной системе млекопитающего, причем лентивирусный вектор включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность, кодирующую фактор роста, операбельно связанную с промотором, где фактор роста экспрессируется в клетке-мишени, тем самым леча или предотвращая указанную нигростриатальную дегенерацию и/или индуцируя нигростриатальную регенерацию.

Недостатками заявленного технического решения являются существенные ограничения лентивирусных векторов, которые способны интегрироваться в геном клетки, что вызывает опасения по поводу безопасности, поскольку существует риск злокачественного новообразования клеток.

Для решения указанной проблемы необходим выбор более безопасного и специфического препарата для доставки комбинации нейротрофических и ангиогенных факторов в клетки организма. AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению способны специфично трансдуцировать нейроны, обладают низкой иммуногенностью и оказывают усиленную трофическую и ангиогенную поддержку.

Известно изобретение по патенту WO2023202637 «Рекомбинантные векторы aav для лечения нейродегенеративных заболеваний». Краткой сущностью является рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор, содержащий один или два из от (a) до (c): (a) нуклеотидную последовательность, кодирующую декарбоксилазу ароматических L-аминокислот (AADC), (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую глюкоцереброзидазу (ГБА1); и (c) нуклеотидную последовательность, кодирующую нейротрофический фактор (NTF), такой как церебральный дофаминовый нейротрофический фактор (CDNF) или глиальный нейротрофический фактор (GDNF), для лечения нейродегенеративных расстройств, в частности болезни Паркинсона, множественной системной атрофии, болезнь Гоше и другие протеинопатии.

Недостатком известного технического решения является отсутствие кодонной оптимизации генетической последовательности в составе рекомбинантных векторов, что сказывается на снижении экспрессии генов нейротрофических факторов в клетках пациентов.

При этом использование AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF по заявленному техническому решению позволяет обеспечить более эффективную экспрессию нейротрофических и ангиогенных факторов.

Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что для решения описанных выше технических проблем необходима разработка препарата и способа его использования, позволяющего эффективно стимулировать регенерацию и нейропротекцию нервной ткани.

При введении AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF специфично трансдуцируются нейроны, а кодонная оптимизация позволяет достигнуть высокого уровня экспрессии кодируемых факторов.

Выявленные аналоги совпадают с заявленным техническим решениям по отдельным совпадающим признакам, поэтому прототип не выявлен и формула изобретения составлена без ограничительной части.

Техническим результатом заявленного технического решения является расширение арсенала средств указанного назначения путем разработки препарата для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани и способа его использования.

Сущностью заявленного технического решения являются препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, содержащий рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию. Способ стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, заключающийся в однократном или многократном интраспинальном, или интратекальном, или внутривенном введении препарата по п.1, содержащего кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 4.

На Фиг. 1 представлены изображения клеток, на которых показан анализ экспрессии белков GDNF, CNTF, VEGF в клетках линии HEK293T путем иммуноцитохимического анализа, подтверждающий успешную генетическую модификацию данных клеток после проведения трансфекции pAAV-coGDNF, pAAV-coCNTF, pAAV-coVEGF. В клетках линии HEK293T были обнаружены сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF клетки. В контрольной группе сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF клетки обнаружены не были.

На Фиг. 2 представлены изображения срезов органов (полученных методом конфокальной микроскопии), на которых показан анализ экспрессии белков GDNF, CNTF, VEGF на криостатных срезах спинного мозга интактных крыс путем иммуногистохимического анализа, что подтверждает успешную генетическую модификацию клеток нервной системы подопытных животных после интраспинального введения AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF. В спинном мозге были обнаружены сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF мотонейроны. В контрольной группе сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF мотонейроны обнаружены не были.

На Фиг. 3 представлены диаграммы, на которых показано наличие сверхэкспрессии кодон-оптимизированных генов GDNF (Фиг. 3а), CNTF (Фиг. 3б), VEGF (Фиг. 3в) в интактном спинном мозге крыс на 7 и 14 сутки после введения соответствующих препаратов на основе рекомбинантных AAV, которым интраспинально вводили AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF. В интактном спинном мозге крысы на 7 и 14 сутки после введения детектировано 19719 и 42323 копий мРНК гена GDNF на 1 мкг общей РНК, соответственно (Фиг. 3а). В интактном спинном мозге крысы на 7 и 14 сутки после введения детектировано 20844 и 3625000 копий мРНК гена CNTF на 1 мкг общей РНК, соответственно (Фиг. 3б). В интактном спинном мозге крысы на 7 и 14 сутки после введения детектировано 183045 и 135020 копий мРНК гена VEGF на 1 мкг общей РНК, соответственно (Фиг. 3в).

На Фиг. 4 приведены данные по результатам введения комбинации препаратов на примере комбинации AAV9-coGDNF и AAV9-coCNTF. Из данных, приведенных на Фиг. 4, видно, что анализ экспрессии белков GDNF и CNTF на криостатных срезах спинного мозга интактных крыс путем иммуногистохимического анализа подтверждает успешную генетическую модификацию нейронов подопытных животных после интраспинального введения комбинации AAV9-coGDNF и AAV9-coCNTF на 14 сутки. В спинном мозге были обнаружены сверхэкспрессирующие GDNF и CNTF мотонейроны. В контрольной группе сверхэкспрессирующие GDNF и CNTF мотонейроны обнаружены не были.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Выявленная проблема и заявленный технический результат достигаются путем однократного или многократного интраспинального, и/или интратекального, и/или внутривенного введения заявленного препарата, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1 (AAV9-coGDNF); CNTF, представленную SEQ ID NO:2 (AAV9-coCNTF); VEGF, представленную SEQ ID NO:3 (AAV9-coVEGF); или любую их комбинацию (далее - заявленный препарат), по заявленному способу. Последовательности, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, приведены в Приложении.

Заявленное техническое решение в целом основано на том, что, благодаря способности аденоассоциированного вируса 9 серотипа эффективно трансдуцировать нейроны, дегенерация которых связана с патогенезом повреждения нервной ткани различного генеза, кодонная оптимизация генов нейротрофических и ангиогенных факторов GDNF, CNTF и VEGF способствует более эффективной и сильной экспрессии трансгена. Это позволяет достичь стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани. В результате разработки получен препарат, содержащий рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1(AAV9-coGDNF); CNTF, представленную SEQ ID NO:2 (AAV9-coCNTF); VEGF, представленную SEQ ID NO:3 (AAV9-coVEGF); или любую их комбинацию.

Практическая реализация заявленного изобретения осуществляется в 3 этапа в нижеприведенной последовательности, а именно:

1 этап: Получение и анализ функциональности векторной плазмиды pAAV-coGDNF, содержащей уникальную кодон-оптимизированную последовательность гена GDNF, представленную SEQ ID NO:1; кодон-оптимизированную последовательность гена CNTF, представленную SEQ ID NO:2; кодон-оптимизированную последовательность гена VEGF, представленную SEQ ID NO:3.

2 этап: Получение заявленного препарата для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1 (AAV9-coGDNF); CNTF, представленную SEQ ID NO:2 (AAV9-coCNTF); VEGF, представленную SEQ ID NO:3 (AAV9-coVEGF), полученную на 1 этапе.

3 этап: Изучение эффективности заявленного препарата, полученного на 2 этапе, содержащего кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию, при однократном или многократном интраспинальном, и/или интратекальном, и/или внутривенном введении мелким лабораторным животным.

Далее заявителем приведено подробное описание этапов осуществления заявленного технического решения.

Пример 1. Проведение 1 этапа - получение и анализ функциональности векторной плазмиды pAAV-coGDNF, содержащей уникальную кодон-оптимизированную последовательность гена GDNF, представленную SEQ ID NO:1; кодон-оптимизированную последовательность гена CNTF, представленную SEQ ID NO:2; кодон-оптимизированную последовательность гена VEGF, представленную SEQ ID NO:3.

Производят кодонную оптимизацию нуклеотидной последовательности гена. Для оптимизации кодонного состава гена GDNF используют известные алгоритмы с применением программы OptimumGene (GeneScript, США). На уровень экспрессии генов влияет множество факторов, алгоритм учитывает как можно больше из них, создавая единственный ген, способный достичь максимально возможного уровня экспрессии. При этом в нативном гене используются тандемные редкие кодоны, которые могут снижать эффективность трансляции или даже отключать трансляционный механизм. Смещение кодонов в гене повысило индекс адаптации кодонов для наиболее высокого уровня экспрессии гена. Изменение GC состава было оптимизировано до 61,01% для увеличения периода полураспада мРНК. Были разрушены структуры шпилек, влияющие на связывание с рибосомами и стабильность мРНК. Кроме того, в процессе оптимизации были проверены и успешно модифицированы негативные цис-сайты.

Для оптимизации кодонного состава гена CNTF используют известные алгоритмы с применением программы OptimumGene (GeneScript, США). На уровень экспрессии генов влияет множество факторов, алгоритм учитывает как можно больше из них, создавая единственный ген, способный достичь максимально возможного уровня экспрессии. При этом в нативном гене используются тандемные редкие кодоны, которые могут снижать эффективность трансляции или даже отключать трансляционный механизм. Смещение кодонов в гене повысило индекс адаптации кодонов до 0,95, что считается желаемым для наиболее высокого уровня экспрессии гена. Изменение GC состава было оптимизировано с 50,08% до 57,66% для увеличения периода полураспада мРНК. Были разрушены структуры шпилек, влияющие на связывание с рибосомами и стабильность мРНК. Кроме того, в процессе оптимизации были проверены и успешно модифицированы негативные цис-сайты.

Для оптимизации кодонного состава гена VEGF используют известные алгоритмы с применением программы OptimumGene (GeneScript, США). На уровень экспрессии генов влияет множество факторов, алгоритм учитывает как можно больше из них, создавая единственный ген, способный достичь максимально возможного уровня экспрессии. При этом в нативном гене используются тандемные редкие кодоны, которые могут снижать эффективность трансляции или даже отключать трансляционный механизм. Смещение кодонов в гене повысило индекс адаптации кодонов с 0,81 до 0,92, что считается желаемым для наиболее высокого уровня экспрессии гена. Изменение GC состава было оптимизировано с 52,33% до 54,26% для увеличения периода полураспада мРНК. Были разрушены структуры шпилек, влияющие на связывание с рибосомами и стабильность мРНК. Были удалены повторяющиеся последовательности. Кроме того, в процессе оптимизации были проверены и успешно модифицированы негативные цис-сайты.

Синтез и клонирование оптимизированной по кодонному составу кДНК гена GDNF, CNTF и VEGF в плазмидный вектор pAAV-MCS (Addgene, США) осуществляет компания GenScript (США). Правильность сборки рекомбинантной генетической конструкции pAAV-coGDNF, pAAV-coCNTF и pAAV-coVEGF подтверждают рестрикционным анализом.

Для подтверждения функциональности генетических конструкций, содержащих кодон-оптимизированные последовательности генов GDNF (pAAV-coGDNF), CNTF (pAAV-coCNTF) и VEGF (pAAV-coVEGF) ими трансфицируют (генетически модифицируют) иммортализированую линию первичных человеческих эмбриональных клеток почки HEK293T. Для этого используют трансфекционный агент TurboFect (Thermo Fisher Scientific Inc., США) в соответствии с методикой, рекомендуемой производителем. Для оценки эффективности трансфекции в качестве положительного контроля используют плазмидный вектор pAAV-CMVenCBh-Katushka2S, кодирующий дальне-красный флуоресцентный белок.

Эффективность экспрессии рекомбинантного белка in vitro с помощью полученной плазмидной конструкции подтверждают путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, иммуноцитохимическим анализом и вестерн-блот анализом.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени проводилась с использованием праймеров к кодон-оптимизированным последовательностям генов GDNF, CNTF и VEGF.

По результатам анализа заявителем в образцах кДНК клеток НЕК293Т, трансфицированных pAAV-coGDNF, pAAV-coCNTF и pAAV-coVEGF было отмечено увеличение числа копий мРНК кодон-оптимизированных последовательностей генов GDNF, CNTF и VEGF при сравнении с клетками НЕК293Т без проведения трансфекции.

Иммуноцитохимический анализ проводят с использованием первичных поликлональных антител кролика к GDNF (Кат. №PAA043Hu01, Cloud-Clone Corp., США), CNTF (Кат. №PAA021Hu01, Cloud-Clone Corp., США) и VEGFA (Кат. №RPA143Hu01, Cloud-Clone Corp., США), разведение 1:100 в растворе DBPS.

По результатам анализа заявителем в образцах клеток НЕК293Т, трансфицированных pAAV-coGDNF, pAAV-coCNTF и pAAV-coVEGF обнаружена сверхэкспрессия.

Вестерн-блот анализ проводят с использованием первичных поликлональных антител кролика к GDNF (Кат. №PAA043Hu01, Cloud-Clone Corp., США), CNTF (Кат. №PAA021Hu01, Cloud-Clone Corp., США) и VEGFA (Кат. №RPA143Hu01, Cloud-Clone Corp., США), разведение 1:500 в блокирующем буфере.

По результатам анализа заявителем в образцах лизатов клеток НЕК293Т, трансфицированных pAAV-coGDNF, pAAV-coCNTF и pAAV-coVEGF получены ожидаемые размеры белка GDNF около 17 кДа, CNTF около 23кДа и белка VEGF около 19кДа.

Пример 2. Проведение 2 этапа - получение заявленного препарата для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1 (AAV9-coGDNF); CNTF, представленную SEQ ID NO:2 (AAV9-coCNTF); VEGF, представленную SEQ ID NO:3 (AAV9-coVEGF), полученного на 1 этапе по Примеру 1.

На основе векторных плазмид, полученных по Примеру 1 - pAAV9-coGDNF, pAAV9-coCNTF, pAAV9-coVEGF получают AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF, соответственно.

Для получения AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF используют AAV Helper free system. Клетки HEK293T сеют в количестве 1,5 млн., монослой составляет 70-80%. На следующий день проводят ко-трансфекцию с использованием кальций-фосфатного метода тремя плазмидами (векторная плазмида, pAAV-RC и pHelper). AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF собирают через 72 часа после трансфекции. Клетки собирают скребком, проводят криолиз, центрифугируют при 10 000 × g в течение 10 минут для избавления от клеточного дебриса. Вирусный сток хранят при минус 80 °C. AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF концентрируют с использованием AAV Purification Mega Kit (Cell Biolabs, Inc., США) в соответствии с методикой, рекомендуемой производителем.

Пример 3. Проведение 3 этапа - изучение эффективности заявленного препарата, полученного на 2 этапе, содержащего кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию, при однократном или многократном интраспинальном, и/или интратекальном, и/или внутривенном введении мелким лабораторным животным.

Эффективность заявленного препарата, полученного по Примеру 2, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3, или любую их комбинацию, проверили на мелких лабораторных животных.

Животных содержали в специализированных помещениях Казанского (Приволжского) федерального университета под наблюдением квалифицированного персонала. Все эксперименты проводили в соответствии с этическими стандартами и действующим законодательством.

В работе использовали крыс линии Wistar в возрасте 3 месяцев (весом 200 г), которые случайным образом распределили на 22 группы, в каждой группе по четыре особи:

- контрольная группа,

- экспериментальные группы с введением AAV9-coGDNF,

- экспериментальные группы с введением AAV9-coCNTF,

- экспериментальные группы с введением AAV9-coVEGF,

- экспериментальные группы с введением различных комбинаций AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF.

При этом введение осуществляли однократно интраспинально, и/или интратекально, и/или внутривенно.

Заявленный препарат вводили в дозах:

- при интраспинальном и интратекальном введении в дозе, например, 1×10^10 геномных копий,

- при внутривенном введении в дозе, например, 1×10^12 геномных копий.

Далее подробно описаны группы испытуемых животных:

1) Контрольная группа интактных крыс без введения AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF.

2) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF, в дозе, например, 1×10^10 геномных копий на одну особь.

3) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coCNTF, в дозе, например, 1×10^10 геномных копий на одну особь.

4) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, 1×10^10 геномных копий на одну особь.

5) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF, в дозе, например, 1×10^10 геномных копий на одну особь.

6) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coCNTF, в дозе, например, 1×10^10 геномных копий на одну особь.

7) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, 1×10^10 геномных копий на одну особь.

8) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF, в дозе, например, 1×10^12 геномных копий на одну особь.

9) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coCNTF, в дозе, например, 1×10^12 геномных копий на одну особь.

10) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, 1×10^12 геномных копий на одну особь.

11) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF и рекомбинантный AAV9-coCNTF, в дозе, например, по 0,5х10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

12) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,5×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

13) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coCNTF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,5×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

14) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интраспинально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF, рекомбинантный AAV9-coCNTF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозем по 0,33×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

15) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF и рекомбинантный AAV9-coCNTF, в дозе, например, по 0,5×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

16) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,5×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

17) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coCNTF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,5×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

18) Экспериментальная группа интактных крыс, которым интратекально вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF, рекомбинантный AAV9-coCNTF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,33×10^10 геномных копий на одну особь, соответственно.

19) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF и рекомбинантный AAV9-coCNTF, в дозе, например, по 0,5×10^12 геномных копий на одну особь, соответственно.

20) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,5×10^12 геномных копий на одну особь, соответственно.

21) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coCNTF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,5×10^12 геномных копий на одну особь, соответственно.

22) Экспериментальная группа интактных крыс, которым внутривенно вводят заявленный препарат по варианту, содержащему рекомбинантный AAV9-coGDNF, рекомбинантный AAV9-coCNTF и рекомбинантный AAV9-coVEGF, в дозе, например, по 0,33×10^12 геномных копий на одну особь, соответственно.

Для достижения оптимального результата возможно многократное введение заявленного препарата по вышеприведенным пунктам 2-22.

Эксперимент проводили следующим образом.

На 7 и 14 сутки после описанного выше интраспинального, и/или интратекального, и/или внутривенного введения крыс подвергают эвтаназии (из них часть крыс на 7-е, а часть - на 14-е сутки) с использованием методов, которые соответствуют принципам, изложенным в Рекомендациях Европейской комиссии по эвтаназии экспериментальных животных.

Далее извлекали спинной мозг в области Th8 позвонка, а также 0,5 см каудальнее и 0,5 см ростральнее от данной области для проведения ПЦР-РВ и ИГХ анализов.

Далее на основании полученных экспериментальных данных строили графики, приведенные на Фиг. 1-4, которые иллюстрируют результаты, описанные на 1-3 этапах.

Графические материалы, представленные на Фиг. 1 - Фиг. 4, экспериментально доказывают возможность достижения заявленных технических результатов.

Из данных, приведенных на Фиг. 1, видно, что анализ экспрессии белков GDNF, CNTF, VEGF в клетках линии HEK293T путем иммуноцитохимического анализа подтверждает успешную генетическую модификацию данных клеток после проведения трансфекции pAAV-coGDNF, pAAV-coCNTF, pAAV-coVEGF. В клетках линии HEK293T были обнаружены сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF клетки. В контрольной группе сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF клетки обнаружены не были.

Из данных, приведенных на Фиг. 2, видно, что анализ экспрессии белков GDNF, CNTF, VEGF на криостатных срезах спинного мозга интактных крыс путем иммуногистохимического анализа подтверждает успешную генетическую модификацию нейронов подопытных животных после интраспинального введения AAV9-coGDNF, AAV9-coCNTF, AAV9-coVEGF на 14 сутки. В спинном мозге были обнаружены сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF мотонейроны. В контрольной группе сверхэкспрессирующие GDNF, CNTF, VEGF мотонейроны обнаружены не были.

Из данных, приведенных на Фиг. 3, видно наличие сверхэкспрессии кодон-оптимизированных генов GDNF (Фиг. 3а), CNTF (Фиг. 3б), VEGF (Фиг. 3в) в интактном спинном мозге крыс на 7 и 14 сутки после введения заявленного препарата, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3.

В интактном спинном мозге крыс на 7 и 14 сутки после введения заявленного препарата, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена GDNF, представленную SEQ ID NO:1, детектировано 19719 и 42323 копий мРНК гена GDNF на 1 мкг общей РНК, соответственно (Фиг. 3а).

В интактном спинном мозге крысы на 7 и 14 сутки после введения заявленного препарата, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена CNTF, представленную SEQ ID NO:2, детектировано 20844 и 3625000 копий мРНК гена CNTF на 1 мкг общей РНК, соответственно (Фиг. 3б).

В интактном спинном мозге крысы на 7 и 14 сутки после введения заявленного препарата, содержащего рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена VEGF, представленную SEQ ID NO:3, детектировано 183045 и 135020 копий мРНК гена VEGF на 1 мкг общей РНК, соответственно (Фиг. 3в).

На Фиг. 4 приведены данные по результатам введения комбинации препаратов на примере комбинации AAV9-coGDNF и AAV9-coCNTF. Из данных, приведенных на Фиг. 4, видно, что анализ экспрессии белков GDNF и CNTF на криостатных срезах спинного мозга интактных крыс путем иммуногистохимического анализа подтверждает успешную генетическую модификацию нейронов подопытных животных после интраспинального введения комбинации AAV9-coGDNF и AAV9-coCNTF на 14 сутки. В спинном мозге были обнаружены сверхэкспрессирующие GDNF и CNTF мотонейроны. В контрольной группе сверхэкспрессирующие GDNF и CNTF мотонейроны обнаружены не были.

Данные иммуногистохимического анализа по результатам однократного и многократного введения остальных комбинаций препаратов аналогичны представленным на Фиг. 4 - иммуногистохимический анализ на криостатных срезах спинного мозга интактных крыс после интраспинального, и/или интратекального, и/или внутривенного введения заявленного препарата с любой комбинацией кодон-оптимизированной последовательности гена также показал наличие сверхэкспрессии кодируемых белков в мотонейронах.

Из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем решены выявленные технические проблемы и достигнут заявленный технический результат, а именно: расширен арсенал средств указанного назначения путем разработки препарата для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани и способа его использования.

При введении заявленного препарата в интактном спинном мозге крыс детектировано по сравнению с контрольной группой значительное увеличение числа копий мРНК генов GDNF, CNTF, VEGF на 1 мкг общей РНК, а также обнаружена сверхэкспрессия кодируемых белков GDNF, CNTF, VEGF в мотонейронах спинного мозга экспериментальных групп крыс (см. Пример 3, Фигуры 2, 3, 4). Указанное свидетельствует о возможности использования заявленного препарата и заявленного способа для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции

нервной ткани и способ его использования.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023136340</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-30</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023136340</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-30</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

ответственностью &quot;ЭЙВИДЖИН&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Obshchestvo s ogranichennoi otvetstvennostiu

&quot;EIVIDZHIN&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Препарат для стимулирования

регенерации и нейропротекции нервной ткани и способ его

использования</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>637</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..637</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caccatgaagctgtgggatgtggtggccgtgtgcctggtgctgctgcac

accgccagcgccttcccactgccagcaggcaagagaccccctgaggcaccagcagaggataggagcctgg

gccggagaagggccccctttgccctgagcagcgactccaacatgcctgaggattacccagaccagttcga

cgatgtgatggacttcatccaggccacaatcaagcgcctgaagcggtcccccgacaagcagatggccgtg

ctgcctaggagggagagaaataggcaggctgccgccgccaaccctgagaacagccggggcaagggcagaa

ggggacagagaggcaagaacaggggctgcgtgctgaccgccatccacctgaatgtgaccgacctgggcct

gggctacgagaccaaggaggagctgatcttcagatattgctctggcagctgtgatgccgccgagaccaca

tacgacaagatcctgaagaacctgtcccgcaatcgccggctggtgtctgacaaagtgggacaggcctgct

gtcggcccatcgccttcgacgatgacctgtcttttctggatgacaacctggtgtatcacatcctgaggaa

gcacagcgccaagcggtgcggatgtatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>607</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..607</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caccatggcctttaccgagcacagccctctgacacctcaccggagagac

ctgtgcagcagaagcatctggctggctagaaagatccggtctgatctgaccgccctgacagagagctacg

tgaagcaccagggcctgaacaaaaacatcaatctggacagcgccgatggcatgcctgtggccagcaccga

ccagtggtccgagctgacagaagccgagagactgcaagaaaacctgcaagcttatagaaccttccacgtg

ctgctcgcccgcctgctcgaagatcagcaggtgcatttcacccccaccgagggcgacttccaccaggcca

tccacacactgctgctgcaggtcgccgcattcgcctaccagatcgaggaactgatgattctgctggaata

caagatccccagaaacgaggccgacggcatgccaatcaatgtgggcgacggaggactgtttgagaagaag

ctgtggggcctgaaggtgctgcaggagctttctcagtggaccgtgcggtccatccacgacctgagattca

tcagcagccaccagaccggcatccctgctcggggctctcactacatcgccaacaacaagaaaatgtga</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>592</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..592</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aagcttcaccatgaactttctgctgagttgggtccactggtcactggca

ctgctgctgtatctgcatcacgcaaaatggtcacaggccgcccctatggcagagggaggaggacagaacc

accacgaggtggtgaagttcatggacgtgtaccagaggtcctattgtcaccctatcgagacactggtgga

catcttccaggagtacccagatgagatcgagtatatctttaagccatcttgcgtgccactgatgagatgc

ggaggatgctgtaacgatgagggcctggagtgcgtgccaaccgaggagtctaatatcacaatgcagatca

tgcggatcaagcctcaccagggccagcacatcggcgagatgagcttcctgcagcacaacaagtgcgagtg

tagaccaaagaaggacagggcaaggcaggagaatccatgtggaccttgcagcgagcggagaaagcacctg

tttgtgcaggacccccagacctgcaagtgtagctgcaagaatacagattcccggtgtaaagcaaggcagc

tggaactgaacgagcggacctgtcggtgtgataagccaagaagataatctaga</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 объект представляет собой препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, содержащий рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию. 2 объект – способ стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, заключающийся в однократном или многократном интраспинальном, или интратекальном, или внутривенном введении препарата. Технический результат заключается в стимулировании регенерации и нейропротекции нервной ткани. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Препарат для стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, содержащий рекомбинантный аденоассоциированный вирус 9 серотипа, содержащий кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию.

2. Способ стимулирования регенерации и нейропротекции нервной ткани, заключающийся в однократном или многократном интраспинальном, или интратекальном, или внутривенном введении препарата по п.1, содержащего кодон-оптимизированную последовательность гена, выбранную из ряда: GDNF, представленную SEQ ID NO:1; CNTF, представленную SEQ ID NO:2; VEGF, представленную SEQ ID NO:3; или любую их комбинацию.