СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ ХЛОРОПЛАСТНЫХ ГЕНОВ ЯЧМЕНЯ (HORDEUM VULGARE) Российский патент 2012 года по МПК A01H1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве в области растениеводства как на открытом грунте, так и в сооружениях защищенного грунта.

Среди сельскохозяйственных культур, активно возделываемых на территории России, значительную долю занимает ячмень (второе место в структуре посевных площадей зерновых культур РФ, 21.4% на 2001 г.). Ячмень не только кормовая культура, он является основным сырьем для пивоваренной промышленности, широко используется для продовольственных и технических целей.

Известен способ активации фотосинтеза с помощью консорциума бактерий (патент РФ №2054403). Консорциум бактерий, выделенных с растений, образует молочную кислоту и цитокинины. Обработка растений полученной культуральной жидкостью и микроэлементами способствует повышению интенсивности фотосинтеза и урожая растений.

Недостатком известного является сложность получения и очистки целевого препарата. При этом экологическая безопасность данного препарата (комплекс культуральной жидкости и микроэлементов) не показана.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ повышения транскрипции хлоропластных генов у растений ячменя с помощью некоторых фитогормонов (Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kusnetsov V.V., Börner Т. Methyl jasmonate, gibberellic acid, and auxin affect transcription and transcript accumulation of chloroplast genes in barley // J Plant Physiol. - 2011. doi: 10.1016/j.jplph. 2011.01.009). Среди веществ, снижающих транскрипцию генов фотосинтеза, показаны метил жасмонат, ауксин и гиббереллин. Единственный гормон, усиливающий транскрипцию некоторых генов ячменя, - фитогормон цитокинин (6-бензиламинопурин) (способ принят за прототип).

Среди недостатков способа-прототипа можно отметить то, что используемая концентрация гормона (цитокинина), повышающего активность фотосинтетических генов, очень высока (2,2·10^-5 M), что экономически не выгодно. Эпибрассинолид в анализируемой авторами концентрации (10^-7 M) заметного влияния на экспрессию генов не оказывает.

Задачей изобретения является разработка способа активации процесса фотосинтеза у растений ячменя hordeum vulgare путем регуляции транскрипции хлоропластных генов.

Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем культивирование проростков ячменя в почвенной культуре и обработку фитогормонами, проростки ячменя на фазе формирования первого листа подвергают одноразовой обработке 24-эпибрассинолидом в концентрации 10^-6 M. Этим увеличивают фотосинтетическую активность, что вносит существенный вклад в повышение продуктивного потенциала растений ячменя.

Таким образом, сущность изобретения состоит в регуляции транскрипции хлоропластных генов у растений ячменя экологически чистым фитогормоном - брассиностероидом, а именно 24-эпибрассинолидом.

Брассиностероиды (БС) фитогормоны нового поколения, обладающие высокой биологической активностью. Активное использование брассиностероидов в качестве принципиально новых препаратов сельскохозяйственного назначения обусловлено их экологической безопасностью и способностью снижать накопление нитратов, тяжелых металлов и радионуклидов. БС активируют синтез белков и нуклеиновых кислот, изменяют не только состав аминокислот и жирных кислот, но и соотношение эндогенных фитогормонов. Происходящие на клеточном уровне сдвиги отражаются на уровне целого растения не только усилением роста и урожайности сельскохозяйственных культур, но и повышением устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды (Khripach V.A. et al., 2003).

Уникальность брассиностероидов состоит и в том, что они могут «имитировать» регуляторную и фотосинтетическую активности света в темноте.

Регуляция активности транскрипции пластидных генов в первых листьях 6-дневных проростков hordeum vulgare согласно изобретению иллюстрируется рисунками.

На фиг.1 показана радиограмма радиоавтографа эксперимента с хлоропластами растений ячменя и схема нанесения ДНК-зондов исследованных генов на мембрану.

На фиг.2 показана гистограмма, полученная при обработке данных радиоавтографов.

Реализация способа иллюстрируется следующим примером.

Зерна ячменя или листья обрабатывали раствором эпибрассинолида (ЭБЛ) на фазе формирования первого листа в концентрации 10^-6 M и проверяли способность фитогормона стимулировать прорастание семян и регулировать транскрипцию ключевых генов фотосинтеза.

Обработка ячменя раствором ЭБЛ способствует синхронизации и сокращению сроков прорастания. Несмотря на высокую скороспелость ячменя (от 55 дней), сроки его вегетации могут достигать 120 дней. Сокращение вегетационного периода позволит расширить ареал этой культуры, включая возможность ее возделывания у самых северных границ земледелия России.

С помощью известного run-on анализа была исследована скорость транскрипции ключевых фотосинтетических генов hordeum vulgare под действием экзогенного эпибрассинолида и воды (на фиг.2 - ЭБЛ и H₂O, соответственно). Основой транскрипционной системы служили лизированные хлоропласты, выделенные из первых листьев 6-дневных растений ячменя. В ходе реакции транскрипции во вновь синтезированные молекулы РНК включался радиоактивно-меченый УТФ (α³²Р-УТФ), что позволило в дальнейшем анализировать только вновь синтезированные транскрипты. Радиоавтографы типичного опыта, полученные в ходе run-on эксперимента с хлоропластами листьев ячменя, схема нанесения фрагментов выбранных генов на мембрану показаны на фиг.1.

Авторами проведен сравнительный анализ активности 12 хлоропластных генов, относящихся к функционально-различным группам генов пластома. Прежде всего, это гены, продукты которых выполняют первостепенную роль для реализации фотосинтеза - гены фотосистемы I - psa (psaA и psaB), фотосистемы II - psb (psbA, psbD и psbK), ген большой субъединицы РБФК (rbcL), АТФ синтетазного комплекса - atp (atpB) и субъединица F НАДФН пластохиноноксидоредуктазы - ndhF. Среди генов «домашнего хозяйства» была изучена транскрипция гена, кодирующего β субъединицу РНК-полимеразы бактериального типа (rpoB), гены 16S и 23S рибосомальной РНК (rrn16 и rrn23) и гены тРНК-Глу и тРНК-Тир (trnE-Y) (см. таблицу).

Таблица
Характеристика генов Гены «домашнего хозяйства» Рибосома 16S pPHK rrn16 23S pPHK rrn23 тРНК тРНК-Глу и тРНК-Тир trnE/trnY Хлоропластная РНК-полимераза β-субъединица РНК-полимеразы rpoB Гены белков фотосинтетического аппарата Фотосистема I А1 апопротеин ФСI psaA А2 апопротеин ФСI psaB Фотосистема II полипептид реакционного центра D1 psbA 47 кДа хлорофилл апопротеин psbB полипептид реакционного центра D2 psbD НАДН-пластохинон оксидоредуктаза субъединица F ndhF АТФ-синтаза β-субъединица АТФ синтазы atpB Большая субъединица РБФК rbcL

На фиг.2 показана интенсивность транскрипции, выраженная в условных единицах. Видно, что транскрипция ключевых фотосинтетических генов в первых листьях ячменя под действие экзогенного ЭБЛ значительно возрастает. Достоверными считали 2-кратные различия активности генов. Значительная активация транскрипции (27 раз) отмечена для генов одной из субъединиц (F субъединицы) НАДН-пластохиноноксидоредуктазы, участвующей в дыхательном обмене растений (ndhF). Высокая активность транскрипции получена для генов, кодирующих А2 апопротеин фотосистемы I (22 раза, psaB), рибосомный белок 16S (17 раз, rrn16) и большую субъединицу основного фермента фотосинтеза (12 раз, rbcL). Для большинства изученных генов экзогенный ЭБЛ способствовал увеличению транскрипционной активности в 5-7 раз (psaA, psbA, psbD, psbK и rrn23).

Таким образом, экспериментально доказано, что экзогенный эпибрассинолид не только сокращает время прорастания семян ячменя, но и повышает активность транскрипции хлоропластных генов. Изменение интенсивности транскрипции хлоропластных генов способствует изменению содержания хлорофилла, что напрямую связано с фотосинтетической активностью (Kravtsov et al., 2011).

Техническим результатом является повышение транскрипции хлоропластных генов hordeum vulgare, что способствует увеличению продуктивности ячменя и повышению экологической безопасности производимой продукции.

Использованные источники

1. Жученко А.А. Ресурсный потенциал производства зерна в России (теория и практика) - М: ООО «Издательство Агрорус», 2004. 1109 с.

2. Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kusnetsov V.V., Börner Т. Methyl jasmonate, gibberellic acid, and auxin affect transcription and transcript accumulation of chloroplast genes in barley // J Plant Physiol. - 2011. doi: 10.1016/j.jplph. 2011.01.009.

3. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., Karnachuk R.A. // Chemical probes in biology / Science at the interface of brassinosteroids: a new role of steroids as biosignaling molecules. 2003. M.P.Schneider. Ed. Netherlands: Kluwer Academic Publishers. Vol.129. P.153-167. NATO Science Series. 391 p.

4. Kravtsov A.K., Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kulaeva O.N., Kusnetsov V.V. Cytokinin and abscisic acid control plastid gene transcription during barley seedling de-etiolation // Plant Growth Regulation. 2011. DOI 10.1007/s10725-010-9553-y.

5. Патент РФ №2054403. Консорциум бактерий (lactobacillus salivarius var salivarius, lactobacillus acidophilus, lactobacillus lactis) для активации фотосинтеза. Опубл. 1996.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве в области растениеводства на открытом грунте и в сооружениях защищенного грунта. Сущность изобретения состоит в активации прорастания семян ячменя и стимуляции транскрипции 12 хлоропластных генов растений путем обработки проростков ячменя 24-эпибрассинолидом. Предложенный способ способствует увеличению продуктивности выращиваемых растений и повышению экологической безопасности производимой продукции. 1 табл., 2 ил.

Способ регуляции транскрипции хлоропластных генов ячменя (hordeum vulgare), включающий культивирование проростков в почвенной культуре и одноразовую обработку 24-эпибрассинолидом на фазе формирования первого листа, отличающийся тем, что одноразовой обработке 24-эпибрассинолидом в концентрации 10^-6 М подвергают шестидневные растения ячменя (hordeum vulgare).