Способ повышения продуктивности растений картофеля эпибрассинолидом в оптимальных условиях и при хлоридном засолении Российский патент 2024 года по МПК A01G22/25 A01G7/00 A01N45/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве для повышения продуктивности растений картофеля и/или их защиты от действия абиотических стрессоров, в частности хлоридного засоления при выращивании на открытом грунте или закрытом грунте.

Одной из причин сокращения площади земель, доступных для сельского хозяйства, является засоление. Выращивание сельскохозяйственных культур на засоленных территориях приводит к снижению их продуктивности, что, в свою очередь, сопровождается серьезными экономическими потерями. Применение соединений гормональной природы для повышения продуктивности растений в условиях абиотического стресса является эффективной и безопасной технологией. Стероидные гормоны демонстрируют протекторные свойства в условиях хлоридного засоления. Брассиностероиды с лактоновым кольцом, к которым относится 24-эпибрассинолид (ЭБЛ), являются наиболее активными и применяются для создания агропрепаратов. Ранее показана эффективность фунгицидной композиции, главным составляющим которой является ЭБЛ, при обработке вегетирующих растений и семян (Пат. BY 022248).

Известен способ повышения роста и развития растений комплексным препаратом для предпосевной обработки семян на основе брассиностероидов. В состав препарата входят: брассинолид 250-350 мг/л, гумат 8-12 г/л, кальциевый бентонит 35-45 г/л, автолизат пивных дрожжей 10-14 г/л. Изобретение позволяет ускорить прорастание семян яровой пшеницы и развитие проростков, в частности, приводит к достоверному увеличению их длины (Пат. RU 2728677).

Основной недостаток способа заключается в необходимости использования ряда химических соединений, в том числе брассинолида, в относительно высокой концентрации, что сопровождается увеличением финансовых затрат при выращивании растений.

Известен способ повышения устойчивости растений эпибрассинолидом. Технология предполагает предпосевную обработку семян томатов в течение 10-12 часов раствором фитопрепарата, в его состав включен эпибрассинолид в концентрации 10 нМ/л, с последующей вторичной обработкой молодых растений раствором эпибрассинолида в концентрации 10 мкМ/л при норме расхода 2-3 мл/растение. Изобретение позволяет стимулировать рост и развитие растений, усиливать процессы генеративного развития и повышать продуктивность на фоне стрессовых условий (Пат. RU 2349088). Показано увеличение количества плодов томатов и ускорение наступления фазы бутонизации.

Основной недостаток способа - вторичная обработка растений фитопрепаратом, гормон в котором находится в высокой концентрации, что приводит к повышенному расходу эпибрассинолида, и также способствует удорожанию конечного продукта.

Ранее был разработан способ повышения устойчивости растений рапса к интенсивному хлоридному засолению, включающий культивирование растений рапса в условиях хлоридного засоления и обработку растений раствором биологически активного вещества, отличающийся тем, что растения рапса культивируют на питательной среде Хогланда-Снейдера в течение трех недель, после чего растения подвергают засолению хлоридом натрия при концентрации приблизительно 175 мМ, во время которого в раствор двукратно вносят 24-эпибрассинолид, в первый день засоления и через 7 суток после засоления (Пат. RU 2522519).

Основными недостатками способа являются двукратное внесение активного вещества, кроме того, концентрация используемого стрессора слишком высока, что не соответствует реальному засолению пахотных земель. Засоленными признаются почвы, в которых электропроводность составляет и 4 дСм/м или более, что эквивалентно раствору 40 мМ NaCl.

Биологически активные вещества (БАВ) - это соединения, которые способны оказывать выраженное воздействие на процессы жизнедеятельности даже при использовании в низких концентрациях. В предложенном способе в качестве такового выступает 24-эпибрассинолид, который является биологически активным веществом, фитостимулятором, регулирующим рост растений, ингибирующим транспирацию и снижающим увядание, а также средством, усиливающим холодостойкость, ускоряющим рост, утолщение или созревание плодов, корней и корнеплодов.

Технической задачей изобретения является разработка экономичного способа повышения продуктивности растений картофеля, как в обычных условиях выращивания, так и при действии хлоридного засоления.

Технический результат заключается в увеличении количества ярусов и биомассы растений картофеля, содержания в них фото синтетических пигментов, снижении уровня окислительного стресса при последующем действии солевого стресса.

Задача решается однократным добавлением экологически безопасного фитогормона 24-эпибрассинолида в концентрации 10 нМ или 1000 нМ в питательную среду Мурасиге-Скуга на этапе трехнедельного клонирования растений картофеля in vitro.

Для решения поставленной задачи предложен способ повышения продуктивности растений картофеля эпибрассинолидом в оптимальных условиях и при хлоридном засолении, включающий микроклональное размножение in vitro и выращивание растений картофеля на питательной среде Мурасиге-Скуга с обработкой растений картофеля раствором биологически активного вещества, в качестве которого добавляют 24-эпибрассинолид, отличающийся тем, что на начальном этапе трехнедельного (21 день) клонирования растений картофеля in vitro и до воздействия солевого стресса однократно добавляют 24-эпибрассинолид в концентрации 10 нМ или 1000 нМ, биологически активное вещество добавляют в питательную среду.

Далее растения картофеля адаптировали к жидкой питательной среде. Ростовые показатели (длина побега и корня) фиксировали сразу после переноса растений из условий in vitro, затем через 7 и 14 суток. После адаптации к жидкой среде растения подвергались стрессу, вызванному избыточной концентрацией хлорида натрия (75 мМ NaCl) на протяжении 5 суток. Брассиностероды в условиях стресса вызывали отложенное ростостимулирующее действие на рост побега. Кроме того, защитный эффект ЭБЛ проявлялся в сохранении биомассы растений и количества ярусов. Известно, что продуктивность растения определяется не только его массой, но и фотосинтетической активностью его листьев, которая зависит от содержания фото синтетических пигментов. Отмечено поддержание уровня пигментов (хлорофилла и каротиноидов) на уровне контрольных значений для растений, выращенных с добавлением ЭБЛ в питательную среду. Так же для обработанных гормоном растений отмечено снижение величины перекисного окисления липидов и эндогенного уровня пролина по сравнению с необработанными растениями.

На Фиг. 1 показаны гистограммы, отображающие ростовые показатели растений картофеля (А - побег, Б - корневая система) в период адаптации.

На Фиг. 2 показаны гистограммы, отражающие ростовые характеристики растений картофеля (А - побег, Б - корневую систему, В - ярусы; Г - листья; Д - массу; Е - столоны).

На Фиг. 3 показаны гистограммы, отражающие содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов , b и каротиноидов) в листьях растений картофеля.

На Фиг. 4 и на Фиг. 5 показаны гистограммы, отражающие физиологическое состояние растений картофеля на примере содержания ТБК-АП (тиобарбитуровой кислоты - активных продуктов) и пролина.

Примеры осуществления изобретения иллюстрируют действие на растения картофеля (ЭБЛ) разных концентраций в условиях in vitro. Проведены испытания длительного влияния 24-эпибрассинолида (10 и 1000 нМ) в условиях in vitro, при последующем солевом стрессе (75 мМ NaCl) в условиях гидропоники.

Опыты проведены на растениях Soianum tuberosum L. среднеспелого сорта Луговской (идентификатор 8301891). При микроклональном размножении картофеля в культуре in vitro на начальном этапе выращивания в питательную среду Мурасиге-Скуга (75% МС) добавляли в одном варианте 10 нМ ЭБЛ, во втором - 1000 нМ ЭБЛ. Далее все растения через 21 сутки переносили на жидкую (50% МС) питательную среду без добавления гормонов для адаптации их к условиям фитокамеры на 14 суток. На следующем этапе в питательную среду вносили 75 мМ хлорида натрия для моделирования условий засоления.

Ростовые характеристики (длину побега, корня) фиксировали сразу при переносе растений в условия гидропоники на этапе адаптации и через 7 или 14 суток. После воздействия хлоридом натрия дополнительно оценивали ростовые (количество ярусов и сформированных листьев, массы микроклонов, развитие столонов) и физиологические параметры (содержание пигментов, пролина, величину перекисного окисления липидов).

Экстракцию фотосинтезирующих пигментов осуществляли 96% этанолом. Пробы растирали в керамических ступках с добавлением жидкого азота и переносили не менее 15 мг в пробирки Эппендорфа объемом 2 мл. В пробирки добавляли 2 мл 96% этанола для экстракции пигментов. Затем растительный материал осаждали на центрифуге MiniSpin (Eppendorf, Германия) в течение 10 минут при 8000 g. Оптическую плотность надосадочного раствора измеряли на спектрофотометре Genesys 10S UV-Vis (ThermoScientific, Германия) при длине волн: 470.0, 648.6 и 664.2 нм. В качестве контрольного образца использовали 96% этанол. Для расчета количества фотосинтетических пигментов использовали формулы, предложенные Lichtenthaler (1987).

Для экстракции и определения свободного пролина навеску растительного материала (150-200 мг) растирали в жидком азоте, переносили в охлажденную пробирку Эппендорфа и добавляли 1,5 мл 3% сульфосалициловой кислоты. Далее содержимое пробирки перемешивали на вортексе и центрифугировали (15 минут, при 10000 g, 4°С). Переносили 500 мкл экстракта в стеклянные пробирки, затем добавляли 500 мкл нингидринового реактива и 500 мкл ледяной уксусной кислоты. Каждый образец был в трехкратной аналитической повторности. В контрольные образцы вместо растительного экстракта добавляли 0,5 мл 3% сульфо салициловой кислоты. Пробирки кипятили 60 минут на водяной бане под вытяжкой, затем их переносили на ледяную баню для быстрого охлаждения. Далее добавляли в каждую пробирку 1,5 мл толуола, закрывали пробирку и интенсивно перемешивается на вортексе 20 секунд. Оставляли на несколько минут до полного разделения фаз, после чего переносили верхнюю фазу с толуолом в пробирки Эппендорфа. Оптическую плотность измеряли при 520 нм на спектрофотометре Genesys 10S UV-Vis (ThermoScientific, Германия). Содержание пролина рассчитывали согласно Bates с соавторами (1973).

Величину перекисного окисления липидов (ПОЛ) измеряли спектрофотометрическим методом по концентрации ТБК-АП. Ткани листа, стебля и корня растирали в керамической ступке с добавлением жидкого азота. Переносили навеску около 100 мг в пробирку Эппендорфа и добавляли 1 мл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Перемешивали на вортексе (Vortex Microspin FV-2400), центрифугировали 15 минут при 12000 g × 4°С. В стеклянные пробирки отбирали по 500 мкл супернатанта. В контрольные образцы вместо супернатанта добавляли равный объем ТХУ В пробирки вносили 1,5 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты (300 мл ТХУ, 1,5 г ТБК).

Реакцию, с образованием окрашенного комплекса, проводили в течение 30 минут при 98°С на водяной бане. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре (Genesys 10S UV-Vis ThermoElectron, США) при длинах волн 532 и 600 нм. Использовали формулу для расчета концентрации ТБК-АП по Buege и Aust (1978).

Спустя неделю после переноса на жидкую среду, предобработка ЭБЛ увеличивала прирост длины побега в среднем на 17% и 11% соответственно при концентрациях 10 и 1000 нМ (Фиг 1А). Эффект усиливался при продолжении эксперимента, через 19 суток длина побега составляла в среднем 15 см для двух вариантов обработки гормона, в то время как у необработанных растений данный параметр был ниже, и составил 12,4 см. При этом, после прекращения гормонального воздействия, скорость роста корня была замедлена (Фиг. 1Б).

Избыточное содержание хлорида натрия в среде приводит к нарушению ростовых процессов растений, отражающих их продуктивность. Наиболее выраженное действие хлорида натрия (75 мМ NaCl) было продемонстрировано на формировании ярусов и накоплении биомассы (Фиг. 2В, Г). Так, первый показатель сократился на 30%, а второй на 33% относительно контроля. ЭБЛ в концентрации 10 нМ снижал негативный эффект на накопление биомассы и формирование ярусов при отложенном действии хлорида натрия.

Хлоридное засоление в меньшей степени оказывало влияние на длину осевых органов (Фиг. 2А, Б). При этом ЭБЛ при 10 нм и 1000 нм увеличивал прирост побега на 14% и 11%, соответственно, относительно солевого контроля, однако, дополнительно замедлял рост корня соответственно на 17% и 18%.

Далее оценивали влияние ЭБЛ на растения при отложенном действии хлорида натрия (75 мМ) по физиологическим параметрам (содержание пигментов, пролина и степень перекисного окисления липидов).

Известно, что зеленые фотосинтетические пигменты, в большей степени, подвержены действию засоления, поэтому содержание хлорофиллов используют в качестве чувствительного индикатора состояния клеточного метаболизма. При анализе влияния хлоридного засоления (75 мМ NaCl) на накопление фотосинтетических пигментов в листьях растений, обработанных 10 и 1000 нМ ЭБЛ, определяли содержание хлорофилла , хлорофилла b и каротиноидов. Нами показано, что хлоридное засоление снижало содержание хлорофилла и каротиноидов на 7%. Длительное воздействие 10 нМ ЭБЛ, способствовало поддержанию количества фотосинтетических пигментов на уровне контрольных значений (Фиг. 3). При этом хлоридное засоление не оказывало значимого эффекта на уровень хлорофилла b, как у контрольных, так и у обработанных брассиностероидом растений картофеля.

Снижение содержания хлорофилла , в результате действия хлорида натрия, способствовало изменению соотношения пигментов (Таблица 1). Гормональное воздействие полностью восстанавливало данный показатель при концентрации 10 нм и частично при концентрации 1000 нМ ЭБЛ.

Избыточные концентрации солей, поступающие в растения, стимулируют генерацию активных форм кислорода (АФК), таких как синглентный кислород, супероксидный радикал, гидроксильный радикал, перекись водорода. Названные АФК приводят к перекисному окислению белков и липидов, разрушению ДНК, окислительно-восстановительному дисбалансу. В связи с чем, далее спектрофотометрическим методом измеряли величину перекисного окисления липидов (ПОЛ) по концентрации соединений, активных в реакции с тиобарбитуровой кислотой при нагревании (ТБК-АП).

При действии хлорида натрия степень ПОЛ в листьях и стебле возросла на 7% и 28% соответственно (Фиг. 4). В то время как, в корнях данный показатель, напротив, снижался на 9%. Гормональная предобработка растений способствовала снижению степени ПОЛ. Однако в зависимости от концентрации гормона эффект характеризовался органоспецифичностью. Так, в листьях и стеблях 10 нМ ЭБЛ снижал значения ПОЛ относительно солевого контроля. В то время как, 1000 нМ ЭБЛ значительно понижал содержание ТБК-АП только в листьях (Фиг. 4).

Типичным ответом растений на стрессовые условия является накопление пролина - иминокислоты, которая выполняет различные функции, в том числе является осмопротектором, стабилизатором белков и ингибитором перекисного окисления липидов. В нашем исследовании было установлено, что содержание пролина повышалось в листьях в 9 раз, в стеблях и корнях в 4 раза в ответ на действие хлорида натрия, относительно контрольных значений (Фиг. 5). Гормональная обработка ЭБЛ в концентрации 10 нМ, при последующем хлоридном засолении, снижала содержание пролина в листьях, стеблях и корнях, примерно на 10% (Фиг. 5).

Таким образом, экспериментально показано, что длительная прикорневая обработка ЭБЛ способствовала снижению негативного эффекта отложенного действия хлорида натрия на формирование ярусов и накопление биомассы растений картофеля. Также, в растениях предобработанных 10 нМ ЭБЛ, при хлоридном засолении сохраняется содержание фотосинтетических пигментов (хлорофилла и каротиноидов) и понижается степень перекисного окисления липидов, свидетельствующая о величине окислительного стресса. О снижении негативного воздействия хлорида натрия у обработанных ЭБЛ растений, так же указывает частичное уменьшение содержания эндогенного пролина.

На основании этих результатов предложен способ повышения продуктивности растений картофеля и его агрономической устойчивости в условиях хлоридного засоления согласно заявленной формуле изобретения.

Использованные источники:

1. Пат. BY 022248 Фунгицидная композиция и способ ее применения Опубл.: 30.11.2015.

2. Пат. RU 2728677. Сорбционно-стимулирующий препарат для предпосевной обработки семян яровой пшеницы на основе брассиностероидов Опубл.: 30.07.2020.

3. Пат. RU 2349088. Способ повышения термоустойчивости овощных культур Опубл.: 20.03.2009.

4. Пат. RU 2522519. Способ повышения устойчивости растений рапса к интенсивному хлоридному засолению Опубл.: 20.07.2014.

5. Lichtenthaler Н.K. Chlorophylls and Carotenoids, the Pigments of Photosynthetic Biomembranes / Methods Enzymology // Eds. Douce R., Packer L. - New York: Academik. - 1987. - P. 350 - 382.

6. Bates L.S. Rapid determination of free proline for water stress studies / L.S. Bates, R.P Waldran, I.D. Teare // Plant Soil. 1973. Vol. 39. P. 205 - 208.

7. Microsomal lipid peroxidation / J.A. Buege, S.D. Aust // Methods Enzymol. 1978. Y 52. P. 302-310.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Способ включает микроклональное размножение in vitro и выращивание растений картофеля на питательной среде Мурасиге-Скуга с обработкой растений картофеля раствором биологически активного вещества, в качестве которого добавляют 24-эпибрассинолид. На начальном этапе трехнедельного - в течение 21 дня - клонирования растений картофеля in vitro и до воздействия солевого стресса однократно добавляют 24-эпибрассинолид в концентрации 10 нМ или 1000 нМ в питательную среду. Способ обеспечивает увеличение количества ярусов и биомассы растений картофеля, содержания в них фотосинтетических пигментов, снижение уровня окислительного стресса при последующем действии солевого стресса. 5 ил., 1 табл.

Способ повышения продуктивности растений картофеля эпибрассинолидом в оптимальных условиях и при хлоридном засолении, включающий микроклональное размножение in vitro и выращивание растений картофеля на питательной среде Мурасиге-Скуга с обработкой растений картофеля раствором биологически активного вещества, в качестве которого добавляют 24-эпибрассинолид, отличающийся тем, что на начальном этапе трехнедельного - в течение 21 дня - клонирования растений картофеля in vitro и до воздействия солевого стресса однократно добавляют 24-эпибрассинолид в концентрации 10 нМ или 1000 нМ, биологически активное вещество добавляют в питательную среду.