СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИСТЕИНА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ НА ГРАФИТОВОМ ЭЛЕКТРОДЕ, МОДИФИЦИРОВАННОМ КОЛЛОИДНЫМИ ЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА Российский патент 2012 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения содержания цистеина в водных растворах методом циклической вольтамперометрии.

Известен способ определения цистеина, в объектах окружающей среды основанный на предварительном формировании ртутного пленочного электрода (РПЭ) на стеклоуглеродной подложке, и концентрирование электроактивного соединения на поверхности электрода в фоновом электролите состава: (0,1-0,4) М NaClO₄ + (0,1-1) M HClO₄, минимально определяемая концентрация составляет ~1·10^-4 моль/л [Патент №2238552 РФ. Способ вольтамперометрического определения цистеина / Алиева Э.Ш., Цюпко Т.Г., Темердашев З.А.; заявл. 13.05.2003, опубл. 20.10.2004, 7 с.]. Недостатком способа является использование токсичных соединений ртути, а также малая чувствительность - минимально определяемая концентрация 1·10^-4 моль/л.

Предложена методика вольтамперометрического определения цистеина на ртутно-пленочном электроде, на фоне боратного буфера с pH 9,18, со скоростью развертки, равной 60 мВ/с, в варианте циклической вольтамперометрии. Предел обнаружения составил 1·10^-5 моль/л. [Дорожко Е.В., Короткова Е.И. Исследование антиоксидантных свойств биологически активных серосодержащих соединений вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами. // Химико-фармацевтический журнал. - 2010. - №10. - С.53-56]. Основным недостатком является использование токсичной ртути, а также малая чувствительность, минимально определяемая концентрация составляет 1·10^-5 моль/л.

Вольтамперометрическое определение цистеина проводят на угольно-пастовом электроде, модифицированном эфиром дибензо-18-краун-6 и его производными. Предел обнаружения составляет (2-5)·10^-8 моль/л [Шайдарова Л.Г., Федорова И.Л., Улахович Н.А, Будников Г.К. Инверсионно-вольтамперометрическое определение некоторых аминокислот на угольно-пастовом электроде, модифицированном краун эфиром // Журн. аналит. химии. - 1997. - Т.52. - №3. - С.238-242]. Основным недостатком метода является изготовление угольно-пастового электрода, использующегося один раз, затем для следующего определения цистеина необходимо изготавливать другой электрод. Так же приходится концентрировать цистеин из раствора длительное время, а затем определение проводить с заменой фонового электролита. Методика достаточно чувствительна, но малоселективна.

В работе [Barroso M.F., Santos Т., Goreti М. and other. Cathodic behaviour of cysteine at a platinum electrode // Portugaliae electrochemical acta. - 2007, 25. - p.119 129] предложено вольтамперометрическое определение цистеина на платиновом электроде в режимах прямой, квадратно-волновой, дифференциально-импульсной вольтамперометрии на фоне 0,5 М KNO₃. Предел обнаружения цистеина в режиме катодной вольтамперометрии составляет 9,3·10^-6 моль/л, в режиме квадратно-волновой вольтамперометрии - 1,9·10^-4 моль/л, в режиме дифференциально-импульсной вольтамперометрии - 8,3·10^-6 моль/л. Основным недостатком является использование дорогостоящего материала (платины) для изготовления электрода, а также минимально определяемая концентрация составляет 8,3·10^-6 моль/л.

Вольтамперометрическое определение проводят в режиме циклической вольтамперометрии в растворе фонового электролита 0,1 М HClO₄ при скорости развертки потенциалов w=20 мВ/с на золото-графитовом электроде, полученном при сплавлении в вакууме при температуре 1200°C. Величины электрокаталитических токов пиков пропорциональны содержанию цистеина в интервале концентраций от 1·10^-6 моль/л до 1·10^-3 моль/л [Fawceyy W.R., Fedurco М., Kovakova S. and other. The oxidation of Cysteine, Cysteinesulfinic acid on a polycrystalline gold electrode / Department of chemistry University of California, Davis, CA 95616, 26 p.]. Основными недостатками являются трудоемкий способ изготовления электрода (сплавление в вакууме при температуре 1200°C) и малая чувствительность определения 1·10^-6 моль/л.

Предложена методика вольтамперометрического определения цистеина на алмазном электроде. Вольтамперные зависимости регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,0 до 1,2 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас. х.э.) при скорости развертки, равной 20 мВ/с, в растворе фонового электролита 0,5 М KHCO₃. Предел обнаружения составляет 0.9·10^-6 моль/л в растворе фонового электролита [Spataru N., Sarada B.V. and other. Voltammetric Determination of L-Cysteine at Conductive Diamond Electrodes / Anal. Chem. - 2001. - 73. - p.514-519]. Недостатком является использование дорогостоящего материала (алмаза) для изготовления электродов. Минимально определяемая концентрация составляет ~1·10^-6 моль/л.

Предложена методика вольтамперометрического определения цистеина на угольно-пастовом электроде, модифицированном оксидом рутения (IV) на фонах 0,1 М H₂SO₄, 0,1 М Na₂SO₄, 0,1 М NaOH, в варианте циклической вольтамперометрии. В состав угольно-пастового электрода помимо угольного порошка и связующего вещества (вазелинового масла) вводили 2% (весовых) модификатора оксида рутения (IV). Величины электрокаталитических токов пиков пропорциональны содержанию цистеина в интервале концентраций от 1·10^-6 до 1·10^-3 моль/л [Шайдарова Л.Г., Зиганшина Г.А., Будников Г.К. Электрокаталитическое окисление цистеина и цистина на угольно-пастовом электроде, модифицированном оксидом рутения (IV) // Журн. аналит. химии. - 2003. - Т.58. - №6. - С.640-645].

Недостатками являются использование дорогостоящих соединений рутения для модифицирования поверхности индикаторного электрода и низкая чувствительность определения цистеина, которая составляет 1·10^-6 моль/л.

Предложена методика электрокаталитического определения цистеина на угольно-пастовом электроде, модифицированном неорганической пленкой из гексацианоферрата рутения в условиях проточно-инжекционного анализа в растворе фонового электролита 0,1 М H₂SO₄. Модификацию поверхности угольно-пастового электрода осуществляли в электрохимической ячейке, заполненной свежеприготовленным раствором 1·10^-3 М RuCl₃, 1·10^-3 М K₄[Fe(CN)₆] и 0,1 М H₂SO₄, рН 2 при сканировании потенциала от -0,5 до 1,2 B и в обратном направлении со скоростью 50 мВ/с. Предел обнаружения составляет 4·10^-9 моль/л. Зависимость проточно-инжекционного аналитического сигнала от концентрации цистеина линейна в интервале (0,1-5,0) мкмоль/л [Шайдарова Л.Г., Зиганшина С.А., Тихонова Л.Н., Будников Г.К. Электрокаталитическое окисление и проточно-инжекционное определение серосодержащих аминокислот на графитовых электродах, модифицированных пленкой из гексацианоферрата рутения // Журн. аналит.химии. - 2003. - Т.58. - №12. - С.1277-1283]. Недостатками являются использование фона состоящего из токсичного комплексного цианида и введение дополнительного и дорогостоящего соединения рутения, который непосредственно готовят перед аналитическим определением цистеина.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является электрокаталитическое окисление и проточно-инжекционное определение цистеина на стеклоуглеродном электроде, модифицированном бинарной системой золото-иридий. Поверхность стеклоуглеродного электрода бинарной системой золото-иридий модифицировали при потенциодинамическом осаждении бинарной системы золото-иридий в интервале потенциалов -0.3--0.5 B в течение трех циклов. Определение цистеина проводили в трехэлектродной ячейке методом циклической вольтамперометрии. В качестве рабочего электрода использовали электрод из стеклоуглерода с видимой поверхностью 0,1 см², модифицированный бинарной системой золото-иридий. Электродом сравнения служил насыщенный хлоридсеребряный электрод, вспомогательным - платиновая проволочка. Вольтамперограммы регистрировали в растворе фонового электролита 0,1 М H₂SO₄. Метод характеризуется высокой чувствительностью, интервал определяемых содержаний 5·10^-3-5·10^-7 моль/л. Использование каталитического отклика модифицированного электрода в потоке приводит к уменьшению предела обнаружения аминокислоты на порядок до 5·10^-8 моль/л [Шайдарова Л.Г., Гедмина А.В., Челнокова И.А., Будников Г.К. Электрокаталитическое окисление и проточно-инжекционное определение цистеина на стекло-углеродном электроде, модифицированном бинарной системой золото-иридий // Журн. аналит. химии. - 2008. - Т.81. - №6. - С.949-954]. Недостатком является сложность условий модифицирования поверхности электрода бинарной системой золото-иридий из-за множества степеней окисления иридия, получаемых при восстановлении его из растворов дорогостоящих соединений на поверхности рабочего электрода.

В работе была поставлена задача - снизить предел обнаружения и нижнюю границу определяемых содержаний цистеина по величине обратного пика на катодной ветви циклической кривой, полученного на графитовом электроде (ГЭ), модифицированном коллоидными частицами золота методом циклической вольтамперометрии.

Поставленная задача достигается тем, что проводят модифицирование графитовых электродов коллоидными частицами золота с последующей регистрацией обратных пиков электроокисления цистеина на катодной кривой при скорости развертки потенциала 100 мВ/с на фоне 0,1 М раствора NaOH, концентрацию цистеина определяют по величине максимумов вольтамперных кривых в диапазоне потенциалов от минус 0,20 до плюс 0,10 B относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода методом добавок аттестованных смесей. Новым в способе является то, что для получения полезного сигнала, зависящего от концентрации цистеина, используется ГЭ, модифицированный колодными частицами золота, позволяющего увеличить каталитическую активность за счет увеличения рабочей поверхности электрода, увеличением числа активных центров и большей электрокаталитической активностью коллоидных частиц золота по сравнению с ионами золота (III).

В предлагаемом способе впервые установлена способность цистеина окисляться на ГЭ, модифицированном коллоидными частицами золота, полученными по боргидрид-цитратной методике.

В качестве индикаторного электрода применяли ГЭ, модифицированный коллоидными частицами золота (в прототипе применяли стеклоуглеродный электрод, модифицированный бинарной системой золото-иридий).

Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов, простотой нанесения модификатора, механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности (не используются опасные или вредные вещества при работе с электродом).

В данном изобретении предлагается способ модификации поверхности электрода коллоидными частицами золота из аликвоты золя объемом 0,1 мл (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5). Модифицированная поверхность электрода чувствительна к присутствию цистеина в растворе, что позволяет судить о его наличии. Максимальное значение регистрируемого тока цистеина наблюдается на графитовом электроде, модифицированном коллоидными частицами золота.

Предлагаемый в заявляемом изобретении фон 0,1 М NaOH позволяет определять низкие содержания цистеина с хорошей воспроизводимостью при минимальной концентрации, равной 1·10^-11 моль/л, что соответствует минимально определяемой концентрации (в прототипе предел обнаружения 5·10^-8 моль/л). Тогда как в кислых растворах фоновых электролитов (0,1-1 М H₂SO₄ и 0,1-1 М HClO₄) наблюдается разовый прирост максимума окисления цистеина, что свидетельствует о невозможности использования данных растворов фоновых электролитов при концентрации, равной 1·10^-7 моль/л.

Рассчитанные коэффициенты чувствительности исследованных электродов, модифицированных аликвотой 0,1 мл золя (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5), на фоне 0,1 М NaOH приведены в таблице 1. Из таблицы видно, что у графитового электрода, модифицированного аликвотой золя золота, самый высокий коэффициент чувствительности.

Электроокисление цистеина проводят на поверхности модифицированного ГЭ. Модифицирование поверхности ГЭ коллоидными частицами золота проводят из аликвоты 0,1 мл золя золота (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5) в течение 300 с при потенциале электролиза Е_э=-1,0 В. Вольтамперные зависимости регистрируют в растворе фонового электролита 0,1 М NaOH в диапазоне потенциалов от -1,0 до 1,0 B относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода (нас. х.э.) при скорости развертки, равной 100 мВ/с. Концентрацию цистеина определяют по величине максимумов вольтамперных кривых в диапазоне потенциалов от минус 0,2 до плюс 0,1 B. На фиг.1 представлены циклические вольтамперные кривые цистеина с поверхности графитового электрода, предварительно электрохимически модифицированного коллоидными частицами золота. Кривая 1ан, 1кат ветвь - фон 0,1 М NaOH, кривая 2ан, 2кат ветвь - C_Cyst=4·10^-11 моль/л.

Таким образом, установленные условия впервые позволили количественно определять содержание цистеина на основе реакции электрокаталитического окисления цистеина на поверхности графитового электрода, предварительно электрохимически модифицированного коллоидными частицами золота. Кривая 1 - фон 0,1 М NaOH, кривая 2 - C_Cyst=2·10^-11 моль/л, кривая 4 - C_Cyst=4·10^-11 моль/л (фиг.2).

Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил улучшить метрологические характеристики анализа цистеина, повысить чувствительность определения (1·10¹¹ моль/л), что на два порядка ниже по сравнению с прототипом (табл.2).

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Измерения были проведены в модельном растворе. Графитовый электрод помещают в электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора HCl и добавкой 0,1 мл золя золота (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5). Проводят электролиз раствора для модификации ГЭ коллоидными частицами золота при условии: Е_э=-1,0 В, τ_э=300 с. Для проверки работы электрода регистрируют вольтамперную кривую электроокисления золота в диапазоне от 0,20 до 1,00 В при скорости развертки 50 мВ/с. На кривой регистрируется пик окисления золота при Е=0,70±0,10 B. Наличие пика золота свидетельствует об электроконцентрировании золота из его боргидрид-цитратного золя на поверхности графитового электрода. Затем проводят электролиз еще раз при тех же условиях, но не проводят съемку вольтамперной кривой. Полученный модифицированный графитовый электрод ополаскивают бидистиллированной водой и помещают в другую электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора NaOH. Не проводя накопления регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 В. На катодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается обратный максимум в диапазоне потенциалов от минус 0,2 до плюс 0,1 B. При добавлении раствора цистеина происходит увеличение высоты обратного максимума в диапазоне потенциалов от минус 0,2 до плюс 0,1 B.

Пример 2. Измерения были проведены в водопроводной воде.

Графитовый электрод помещают в электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл 0,1 М раствора HCl и добавкой 0,1 мл золя золота (мольное соотношение HAuCl₄:Na₃C₆H₅O₇:NaBH₄=1:15:5). Проводят электролиз раствора для модификации ГЭ коллоидными частицами золота при условии: Е_э=-1,0 B, τ_э=300 с. Для проверки работы электрода регистрируют вольтамперную кривую электроокисления золота при скорости развертки 50 мВ/с, в диапазоне от 0,20 до 1,00 B. На кривой регистрируют пик окисления золота при Е=0,70±0,10 B. Наличие пика золота свидетельствует об электроконцентрировании золота, из боргидрид-цитратного золя золота, на поверхности графитового электрода. Затем проводят электролиз еще раз при тех же условиях, но не проводят съемку вольтамперной кривой. Потом полученный модифицированный графитовый электрод ополаскивают бидистиллированной водой и помещают в другую электрохимическую ячейку (кварцевый стаканчик), заполненную 10 мл водопроводной воды с добавлением 1 мл 1 М раствора NaOH. Не проводя накопления регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 B. На катодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается обратный максимум в диапазоне потенциалов от минус 0,2 до плюс 0,1 B.

Затем добавляют 0,02 мл аттестованной смеси цистеина концентрации 1·10^-11 моль/л и не проводя накопления регистрируют анодную ветвь, а затем катодную ветвь циклической вольтамперной кривой фонового электролита при скорости развертки 100 мВ/с, начиная с потенциала минус 1,0 и до плюс 1,0 B. На катодной ветви вольтамперной кривой фонового электролита наблюдается обратный максимум в диапазоне потенциалов от минус 0,2 до плюс 0,1 B (относительно нас. х.э.).

Делают 0,02 мл добавку аттестованной смеси цистеина и снова регистрируют аналитический сигнал. По разнице высоты обратного пика вычисляют концентрацию цистеина в растворе.

Таким образом, впервые показана возможность количественного определения цистеина по обратным катодным пикам.

Предложенный способ прост, не используются токсические вещества из-за их отрицательного физиологического действия. Способ может быть применен в любой химической лаборатории, имеющей компьютеризированные анализаторы типа ТА или полярограф. Предложенный способ может быть использован для определения цистеина в водных растворах.

Таблица 1
Коэффициенты чувствительности различных углеродсодержащих электродов Коэффициенты чувствительности Электрод Сажевый горячее литье Графитовый импрегнированный полиэтиленом стеклоуглеродный 0,16 0,52 0,33

Таблица 2
Результаты определения цистеина в модельных растворах Объект исследования Введено, C_Cyst, моль/л Найдено, С_Сные, моль/Л Sr, (t_0,95) n=6 0,1 М NaOH 2·10^-11 (2,02±0,78)·10^-11 0,305 Водопроводная вода 4·10^-11 (3,82±1,87)·10^-11 0,489

Изобретение относится к электроаналитической химии, направлено на определение цистеина и может быть использовано в анализе водных растворов методом циклической вольтамперометрии по высоте обратного пика на катодной кривой. Способ определения цистеина в водных растворах методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде, модифицированном коллоидными частицами золота, согласно изобретению включает концентрирование электроактивного соединения на поверхности электрода и получение аналитического сигнала при изменении потенциала, при этом проводят модифицирование графитовых электродов коллоидными частицами золота с последующей регистрацией обратных пиков электроокисления цистеина на катодной кривой при скорости развертки потенциала 100 мВ/с на фоне 0,1 М раствора NaOH, концентрацию цистеина определяют по величине максимумов вольтамперных кривых в диапазоне потенциалов от минус 0,20 до плюс 0,10 В относительно насыщенного хлорид серебряного электрода методом добавок аттестованных смесей. Изобретение обеспечивает более чувствительный способ определения цистеина в водных растворах методом циклической вольтамперометрии. 2 пр., 2 табл., 2 ил.

Способ определения цистеина в водных растворах методом циклической вольтамперометрии на графитовом электроде, модифицированном коллоидными частицами золота, включающий концентрирование электроактивного соединения на поверхности электрода и получение аналитического сигнала при изменении потенциала, отличающийся тем, что проводят модифицирование графитовых электродов коллоидными частицами золота с последующей регистрацией обратных пиков электроокисления цистеина на катодной кривой при скорости развертки потенциала 100 мВ/с на фоне 0,1 М раствора NaOH, концентрацию цистеина определяют по величине максимумов вольтамперных кривых в диапазоне потенциалов от минус 0,20 до плюс 0,10 В относительно насыщенного хлорид серебряного электрода методом добавок аттестованных смесей.