СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЯ ЦИТОКИНОВОГО БАЛАНСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для ранней диагностики воспалительных процессов и определения реактивности иммунной системы организма на основе оценки соотношения про- и противовоспалительных цитокинов.

Целью изобретения является повышение точности и достоверности оценки цитокинового баланса организма и воспалительных изменений. Преимущество разработанного способа - возможность интегрального количественного выражения активности цитокинового звена воспаления, с учетом направленности действия его фракций, что позволяет объективно оценить степень отклонений в иммунной системе, в том числе на доклинических стадиях.

Способ включает в себя определение иммуноферментным методом в сыворотке крови с применением тест-систем уровней провоспалительных (ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1β) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4; ИЛ-8), установление значений индексов интерлейкинов как отношений их концентраций к референтным значениям (в зависимости от используемой тест-системы), расчет интегрального цитокинового индекса (И_Ц) в усл. ед. по формуле:

И_Ц=И₁+(И₂-1),

где И₁ - среднее арифметическое значение индексов провоспалительных интерлейкинов, И₂ - среднее арифметическое значение индексов противовоспалительных интерлейкинов.

По значению И_Ц устанавливают цитокиновый баланс и при значениях И_Ц≤1 констатируют оптимальный баланс цитокинов (отсутствие воспалительного процесса), при И_Ц>1 - его нарушение (усиление воспалительных процессов), включая ранние изменения.

Технический результат - определение соотношения про- и противовоспалительных интерлейкинов, имеющее диагностическое и прогностическое значение в оценке дисфункции иммунной защиты, в том числе на ранних стадиях развития патологии.

Согласно современным научным данным цитокины играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа и процессов воспаления. По доминирующему биологическому действию выделяют группу провопалительных цитокинов (интерлейкины ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1β и др.), которые принимают участие в индукции и дальнейшем развитии процессов воспаления и тканевого повреждения. Противовоспалительные цитокины, в частности (ИЛ-4, ИЛ-10) являются их антагонистами, способствующими пролиферации В- и Т-клеток, относящихся к различным субпопуляциям [1]. Вместе с тем, при избытке противовоспалительных интерлейкинов отмечается эозионофилия, накопление тучных клеток, активация синтеза IgG₄ и IgE [2].

Соотношение вышеперечисленных ингредиентов крайне существенно для определения нарушений равновесия цитокиновой системы на разных стадиях.

Близким к заявленному является «Способ оценки противовоспалительной активности цитокинов» [3], включающий определение ингибирования супероксидных радикалов в модельной системе гемоглобин-пероксид водорода-люминол при добавлении оцениваемого цитокина с регистрацией показателя интенсивности хемилюминесценции, и при его снижении на 50% и более относительно исходного уровня оценивают активность цитокина как противовоспалительную. Недостатком способа является односторонний подход к определению активности цитокинового звена с учетом только противовоспалительного действия и невозможность определения цитокинового баланса в организме.

Наиболее близкий по технической сущности - Способ диагностики воспалительного процесса при раннем ревматоидном артрите [4], который осуществляется путем определения экспрессии мРНК генов цитокинов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-1β периферической крови или синовиальной жидкости методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции и оценкой баланса цитокинов по их флюоресценции по формуле: ИЛ'/ИЛ”=Е ИЛ”^Ct”/Е ИЛ'^Ct', где ИЛ' - концентрация мРНК гена цитокина, характеризующийся повышенной экспрессией, ИЛ” - концентрация мРНК гена цитокина, характеризующийся пониженной экспрессией, Е - эффективность амплификации, Ct' и Ct” - значение пороговых циклов для соответствующего цитокина, с последующим расчетом парного баланса экспрессии различных цитокинов, исходя из их функциональной взаимосвязи, констатацией наличия воспалительного процесса при получении следующих балансов: ИЛ-2/ИЛ-4>10; ИЛ-1β/ИЛ-4>5000; ИЛ-8/ИЛ-4>1000 и пр. Способ учитывает обе стороны функционирования цитокинов, однако не позволяет провести интегральную оценку их взаимного влияния в сети цитокинового каскада. Кроме того, способ не учитывает изменение направленности действия противовоспалительных цитокинов при их нормальном содержании и в избытке.

Целью изобретения является большая точность и информативность оценки выраженности воспалительных процессов на основе диагностики ранних нарушений цитокинового баланса человека.

Цель достигается определением концентрации интерлейкинов в сыворотке крови (в пг/мл) иммуноферментным методом с применением тест-систем и последующим установлением индексов интерлейкинов как отношений их параметров к референтным значениям (в зависимости от используемой тест-системы), расчетом среднего арифметического для про-(ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1β) и противовоспалительных (ИЛ-4; ИЛ-8) цитокинов и установлением интегрального цитокинового индекса (И_Ц) в усл.ед. по формуле: И_Ц=И₁+(И₂-1).

По значению И_ц определяют соотношение двух разнонаправленных фракций цитокинов и при значениях И_ц≤1 констатируют оптимальный баланс цитокинов, свидетельствующий об отсутствии воспалительного процесса, при ИЦ>1 - его изменение (усиление воспалительных процессов).

Способ позволяет установить как индивидуальные изменения цитокинового баланса организма, отражающие глубину формирования воспалительного процесса, в том числе на ранних стадиях, так и его состояние в равновесных группах для объективизации лечебно-профилактических комплексов по результатам обследования различных контингентов взрослого и детского населения.

В сравнении со способом прототипа предлагаемый способ является более точным и информативным, так как базируется на интегральной оценке, наиболее полно отражающей состояние цитокиновой системы, что существенно при установлении степени риска для здоровья.

Применение способа иллюстрируется следующими примерами.

Примеры выполнения способа

Пример 1

С целью диагностики фазы воспалительного процесса у больного Г., 38 лет, страдающего начальными проявлениями хронического пылевого бронхита, обусловленного воздействием цементной пыли, проведено иммунологическое обследование с определением уровней интерлейкинов сыворотки.

Согласно полученным данным:

- ИЛ-1β=10,8 пг/мл;

- ИЛ-2=13,1 пг/мл;

- ИЛ-4=3,9 пг/мл;

- ИЛ-6=12,5 пг/мл;

- ИЛ-8=11,3 пг/мл;

- ИЛ-10=33,7 пг/мл.

Референтные значения при выбранном способе их определения в сыворотке крови составляют соответственно: ИЛ-1β=11 пг/мл; ИЛ-2=10 пг/мл; ИЛ-4=4 пг/мл; ИЛ-6=10 пг/мл; ИЛ-8=10 пг/мл; ИЛ-10=31 пг/мл.

Индексы интерлейкинов составляют:

- И ИЛ-1β=0,98 усл.ед.;

- И ИЛ-2=1,31 усл.ед;

- И ИЛ-4=0,97 усл.ед;

- И ИЛ-6=1,25 усл.ед.;

- И ИЛ-8=1,13 усл.ед.;

- И ИЛ-10=1,1 усл.ед..

Значение И₁=(И ИЛ-1β+И ИЛ-2+И ИЛ-6+И ИЛ-8)/4=(0,98+1,31+1,25+1,13)/4=1,17.

Значение И₂=(И ИЛ-4+И ИЛ-10)/2=(0,97+1,1)/2=1,035.

Расчет интегрального цитокинового индекса проведен следующим образом:

И_Ц=И₁+(И₂-1)=1,17+(1,035-1)=1,2

В результате интегральный цитокиновый индекс составил 1,2, что выше 1 и свидетельствовало об начальных проявлениях воспалительного процесса. Полученные данные аргументировали необходимость коррекции лечебных мероприятий у данного больного.

При определении способом прототипа парного соотношения цитокинов получены следующие результаты: ИЛ-1β/ИЛ-4=2,77; ИЛ-2/ИЛ-4=3,36; ИЛ-6/ИЛ-4=3,2; ИЛ-8/ИЛ-4=2,9. Следовательно, при оценке уровня воспалительного процесса не выявлено превышение пороговых значений, что не позволяет констатировать наличие его нарастания.

Таким образом, определение цитокинового соотношения различными способами - предлагаемым и способом-прототипом, привело к разным заключениям. По сравнению со способом-прототипом, разработанный способ более чувствителен и информативен при воспалительных процессах слабой степени выраженности, что особенно значимо для ранней диагностики.

Эффективность предлагаемого способа оценена после проведения больному лечебно-профилактического комплекса противовоспалительной физио- и медикаментозной терапии.

Концентрации интерлейкинов сыворотки крови составили: ИЛ-1β=6,7 пг/мл; ИЛ-2=10,5 пг/мл; ИЛ-4=3,1 пг/мл; ИЛ-6=10,7 пг/мл; ИЛ-8=8,6 пг/мл; ИЛ-10=26,8 пг/мл.

И_Ц=И₁+(И₂-1)=0,9+(0,8-1)=0,7

В результате интегральный цитокиновый индекс был равен 0,7, что соответствовало оптимальному балансу цитокинов и указывало на снижение активности воспалительного процесса у данного больного.

Пример 2

Группу из 30 обследованных составили практически здоровые рабочие цементного производства в возрасте 24-35 лет со стажем работы во вредных условиях до 10 лет. В результате иммунологического обследования у 4 человек (13,3%) интегральный цитокиновый индекс И_Ц превышал 1 (среднее значение 1,36±0,35). У 86,7% обследованных данный показатель не превышал установленных пределов (среднее значение 0,76±0,12). Таким образом, выявленные у части рабочих изменения послужили обоснованием для углубленного обследования и проведения лечебно-профилактических мероприятий по показаниям.

При определении выраженности воспалительного процесса способом-прототипом установлены нормальные значения парного соотношения цитокинов у всех обследованных. Средние значения парного баланса цитокинов составили: ИЛ-2/ИЛ-4=4,6±1,3; ИЛ-1β/ИЛ-4=1,7±0,7; ИЛ-8/ИЛ-4=4,1±1,5, что не дало оснований для выделения среди рабочих «группы риска» и проведения соответствующих профилактических мероприятий.

Таким образом, групповое обследование, проведенное предлагаемым способом, по сравнению со способом-прототипом, дало более дифференцированную оценку наличия воспалительных изменений, требующих адекватных лечебно-профилактических мероприятий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бережная Н.М. Цитокиновая регуляция при патологии: стремительное развитие и неизбежные вопросы // Журнал «Цитокины и воспаление». - 2007. - №2. - С.3-8.

2. Железникова Г.Ф. Цитокины как предикторы течения и исхода инфекций // Журнал «Цитокины и воспаление». - 2009. - №1. - С.10-17.

3. Описание изобретения к патенту RU 2150113 С1. Способ оценки противовоспалительной активности цитокинов, опубликованному 27.05.2000. Авторы: Еричев В.П., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Василенкова Л.В., Клебанов Г.И., Долгига Е.Н., Никанкина Л.В.

4. Описание изобретения к патенту RU 2417263 С2. Способ диагностики воспалительного процесса при раннем ревматоидном артрите, опубликованному 27.04.2011. Авторы: Ребриков Д.В., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю.

Изобретение относится к медицине и описывает способ диагностики нарушения цитокинового баланса организма человека, где устанавливают значения индексов интерлейкинов как отношения параметров про- и противовоспалительных фракций в сыворотке крови к референтным значениям, определяют средние арифметические для каждой фракции, расчет интегрального цитокинового индекса И_ц (усл.ед) осуществляют по формуле: И_Ц=И₁+(И₂-1), где И₁ - среднее арифметическое значение индексов провоспалительных интерлейкинов, И₂ - среднее арифметическое значение индексов противовоспалительных интерлейкинов, и при значениях И_Ц ≤1 констатируют оптимальный баланс цитокинов, при И_Ц>1 - его нарушение (усиление воспалительных процессов). Способ обеспечивает повышение точности и достоверности оценки цитокинового баланса организма и воспалительных изменений. 2 пр.

Способ диагностики нарушения цитокинового баланса организма человека, отличающийся тем, что устанавливают значения индексов интерлейкинов как отношения параметров про- и противовоспалительных фракций в сыворотке крови к референтным значениям, определяют средние арифметические для каждой фракции, расчет интегрального цитокинового индекса И_ц (усл.ед) осуществляют по формуле И_ц=И₁+(И₂-1), где И₁ - среднее арифметическое значение индексов провоспалительных интерлейкинов, И₂ - среднее арифметическое значение индексов противовоспалительных интерлейкинов, и при значениях И_ц ≤1 констатируют оптимальный баланс цитокинов, при И_ц>1 - его нарушение (усиление воспалительных процессов).