КРИОПРОТЕКТОР ДЛЯ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ Российский патент 2024 года по МПК A01N1/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно созданию криопротекторного раствора для хранения крови, в частности человека, в условиях субумеренно низкой и умеренно низкой температурах, с сохранением форменных элементов клеток крови в физиологически активном состоянии после оттаивания.

Уровень техники

Криоконсервация - это единственная современная технология, которая поддерживает биологическую функцию клеток ex vivo и обеспечивает длительное хранение биопродукта. Ключевым вопросом в применении криомедицинских технологий является использование нетоксичных или малотоксичных криопротекторов и криоконсервантов на их основе для замораживания клеток. Для включения какого-либо компонента в состав криозащитной смеси нужно учитывать следующие требования: отсутствие токсичности, отсутствие неприятного запаха, хорошая растворимость в воде, способность образовывать мелкие кристаллы льда, не откладываться в клетках и тканях, быстро выводиться из организма.

Известны способы получения комбинированного криопротекторного раствора для замораживания тромбоцитов (патент RU 2477953, опубл. 27.03.2013), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, лимонная кислота и вода для инъекций; хладоограждающий раствор для замораживания тромбоцитов при умеренно-низкой температуре (патент RU 2230454, опубл. 20.06.2004), в котором используется гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина, фумарат натрия, лимонная кислота, вода для инъекций. Недостатки заключаются в том, что данные растворы предназначены для замораживания концентрата тромбоцитов, а не цельной крови.

Известны способы получения криопротекторного раствора для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-40°С) (патент RU 2439877, опубл. 27.06.2011), в котором используется глицерин, сукцинат оксиметилэтилпиридина, гидроксиэтилкрахмал, трехзамещенный цитрат натрия; криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре (патент RU 2290808, опубл. 20.05.2006), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, диметилсульфоксид, оксиметилэтилпиридин сукцина и вода; раствор для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре (патент RU 2311027, опубл. 27.11.2007), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, глюкоза, оксиметилэтилпиридин сукцинат, желатиноль, трехзамещенный цитрат натрия и вода для инъекций; криоконсервант для лейкоцитов (патент RU 2301524, опубл. 27.06.2007), в котором используется лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат, вода для инъекций и гидроксид натрия; протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С (патент RU 2261595, опубл. 10.10.2005), в котором используется глицерин, оксиметилэтилпиримидина сукцинат, модежель; хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре (патент RU 2240000, опубл. 20.11.2004), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, оксиметилэтилпиритдин сукцинат, вода для инъекций; криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (патент RU 2184449, опубл. 10.07.2002), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, фумарат натрия, лимонная кислота и вода для инъекций. Недостатки заключается в том, что данные растворы предназначены для замораживания лейтоцитов, а не цельной крови.

Известны способы получения хладоограждающего раствора для замораживания ядерных клеток крови (патент RU 2464991, опубл. 27.10.2012), в котором используется глицерин, комаруман, трилон Б, вода для инъекций; криоконсерванта для замораживания ядерных клеток крови (патент RU 2530149, опубл. 10.10.2014), в котором используется диметилацетамид, гидроксиэтилкрахмал, фосфатный буфер; раствор для консервирования клеточных взвесей (патент RU 2621295, опубл. 24.05.2017), в котором используется пектиновый полисахарид каллуса раувольфии змеиной, глицерин, трилон Б и вода для инъекций. Недостатки заключаются в том, что данные растворы предназначены для замораживания лейкоцитов, ядерных клеток крови, а не цельной крови.

Известен способ консервирования цельной крови (патент SU 959786, опубл. 1982.09.23), в котором используется 15-30 %-ный водный раствор глюкозы-сахарозы при соотношении компонентов 4:1 и для восстановления концентрата крови добавляют 30-50 %-ный водный раствор глюкозы сахарозы или 20-23 %-ный водный раствор хлорида натрия, недостаток заключаются в том, что данный способ предназначены для консервирования крови животных (свиньи); известен способ консервирования донорской крови (патент RU 2410103, опубл. 27.01.2011), в котором используется гемоконсервант глюгицир, при этом дополнительно в состав гемоконсерванта глюгицир вводят 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат, недостаток заключаются в том, что данный способ предназначен для хранения крови при +4°C, а не при замораживании.

Наиболее близким по составу к заявляемому криопротектору является раствор «Криосин» (Кирьянова Г.Ю., Волкова С.Д., Касьянов А.Д., Гришина Г.В., Голованова И.С., Чечеткин А.В. Криоконсервирование эритроцитов при температурах -40°С и -80°С // Вестник Международной академии холода. 2017. № 1. - С. 72-78; Криоконсервирование эритроцитов при умеренно низких температурах и пролонгированное хранение после размораживания в учреждениях службы крови: Методические рекомендации / А. В. Чечеткин, С. С. Бессмельцев, С. Д. Волкова, Г. Ю. Кирьянова, Г. В. Гришина. - СПб., ФМБА России, 2020. - Агентство «ВиТ-принт», 2020. - 24 с.), который содержит глицерин, маннитол (маннит), хлорид натрия, натрий фосфорнокислый двузамещенный и воду для инъекций, обеспечивающим сохранность крови при +4°С. Недостатком прототипа является отсутствие должного криопротекторного действия на клетки при низких температурах в условиях медленного нерегулируемого замораживания.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является понижение температуры при замораживании цельной крови и увеличение процента сохранности форменных элементов клеток крови путем создания криопротекторного раствора для замораживания крови в условиях субумеренно низкой (-20°С) и умеренно низкой температурах (-40°С), с сохранением форменных элементов клеток крови в физиологически активном состоянии после оттаивания.

Технический результат достигается тем, что предлагаемый криопротектор дополнительно содержит в качестве криоагента, проникающего в клетку, диметилсульфоксид, стабилизирующий внеклеточную, а также свободную и связанную внутриклеточную воду при охлаждении, переводя ее в аморфный лед, устраняющего его рекристаллизацию - образование крупных кристаллов при оттаивании, обеспечивая высокую сохранность и функционально активное состояние ядросодержащих клеток крови, а в качестве криоагента, не проникающего в клетку, используют дисахарид лактулозу, действие которой заключается в защите структуры форменных элементов крови, поддержанию резистентности мембраны и сохранению равновесия осмотического давления, что уменьшает набухание клетки и ее гемолиз.

Преимущества использования полученного криопротектора включают в себя:

- криопротектор может храниться в течение длительного времени без потери криопротекторных свойств;

- достоинством дисахарида лактулозы кроме криопротекторных свойств является то, что это вещество не проникает внутрь клетки и не токсично;

- приготовление криопротектора не требует громоздкого, дорогостоящего оборудования;

- криопротектор позволяет стабилизировать состояние форменных элентов клеток крови к воздействию субумеренно-низкой температуры -20°С и умеренно-низкой температуры -40°С.

Раскрытие сущности изобретения

В составе заявляемого криопротектора, содержащего в качестве растворов солей, поддерживающих изотоническую концентрацию, используют натрия хлорид и натрия фосфат двузамещенный, воду для инъекций, в качестве криоагентов, проникающих в клетку, используют глицерин (криагент эндоцеллюлярного действия) и диметилсульфоксид, которые стабилизируют внеклеточную, а также свободную и связанную внутриклеточную воду при охлаждении и переводят ее в аморфный лед, не разрушающий внутриклеточные органеллы и плазматическую мембрану, и устраняют его рекристаллизацию - образование крупных кристаллов при оттаивании, обеспечивая высокую сохранность и функционально активное состояние ядросодержащих клеток крови, в качестве криоагента, не проникающего в клетку, используют лактулозу, действие которой заключается в защите структуры форменных элементов крови, поддержанию резистентности мембраны и сохранению равновесия осмотического давления, что уменьшает набухание клетки и ее гемолиз.

Конечный состав криопротектора имеет следующие соотношения компонентов, об. %: глицерин - 20, диметилсульфоксид - 10, лактулоза - 2,5, хлорид натрия - 0,25, натрия фосфата двузамещенного - 0,25, вода для инъекций - до 100 %.

Компьютерное цитоморфометрическое исследование клеток крови выполняли на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц2» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», Россия), состоящего из микроскопа с тринокуляром «NIKON», цифровой фотокамеры «Delta Pix - 300», персонального компьютера и программы «Анализ мазков крови».

Для проведения in vitro диагностических тестов образцов крови в лабораторных условиях использовали автоматический гематологический анализатор Гемалайт 1270 производство фирмы Dixion. На гематологическом анализаторе определяли 21 лабораторных показателя, из которых было выбрано 7 показателей, характеризующих состояние периферического лейкоцитарного звена, 5 показателей, характеризующих состояние периферического тромбоцитарного звена, 6 показателей, характеризующих состояние периферического эритроцитарного звена, 1 показатель, указывает на соотношение форменных элементов к жидкой части крови.

Для проведения статистической обработки данных использовали методы параметрического анализа и пакета Microsoft Exel. Определяли следующие параметры: среднее (Х), ошибка среднего (м) и стандартное отклонение (δ). Достоверность различия средних показателей определяли по критерию Стьюдента (t) для коэффициентов вариации, уровень значимости р выбран менее 0,05.

В группу исследования вошли 20 добровольцев женского пола, среднего возраста. Данная группа была сформирована из числа условно здоровых пациентов. Материалом для исследования послужила венозная кровь, взятая в утренние часы из локтевой вены. Взятие материала осуществляли натощак в вакуумную систему с К3 ЭДТА, которая включает вакуумную пробирку с крышкой, двухстороннюю иглу, иглодержатель. Комплектация системы может отличаться в зависимости от типа анализа, состояния вен человека.

Заявляемый раствор получен растворением компонентов раствора в воде для инъекций. Флакон с приготовленным криопротектором герметично укупоривают, маркируют, стерилизуют автоклавированием (1,2 атм - 30 минут), но без диметилсульфоксид. При соприкосновении с воздухом диметилсульфоксид окисляется, распадается на соединения, усиливающие токсичность химического вещества, поэтому автоклавированию не подлежит. Раствор диметилсульфоксида готовят непосредственно перед замораживанием. Готовый раствор хранят в холодильнике при +2÷+4°C.

Изобретение осуществляется примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. После аспирирования порции венозной крови при температуре +22°C кровь делили на равные части в пробирки, часть из которых были контрольными пробами крови без криопротектора, а в другие добавляли разработанный криопротектор - опытные пробы. Все пробирки герметизировали пробками, содержимое перемешивали на шейкере при покачивании пробы 3-4 раза в секунду, при температуре +22°C в течение 10 мин. Пробирку №1 - с цельной кровью, контрольную, без криопротектора, и пробирку №2 с цельной кровью и внесенным с помощью дозаторной пипетки криопротектором в соотношении 1:2 и поэтапно замораживали до температуры -20°С в предварительно охлажденном хладоагенте в виде раствора этилового спирта 30-34 об. % с температурой холодовой адаптации -19 ÷ -24°С в морозильной камере, при этом объем замораживаемого образца составляет 10% объема хладагента, выдерживали в нем 25-30 мин и перемещали для замораживания и хранения в камеру электроморозильника. Опытные образцы оставляли на 24 ч при исследуемой температуре, после чего образцы оттаивали в водяном термостате при температуре +37°С в течение 45-60 секунд при активном перемешивании содержимого колебательными движениями. Далее исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови.

Пример 2. После аспирирования порции венозной крови при температуре +22°C кровь делили на равные части в пробирки, часть из которых были контрольными пробами крови без криопротектора, а в другие добавляли разработанный криопротектор - опытные пробы. Все пробирки герметизировали пробками, содержимое перемешивали на шейкере при покачивании пробы 3-4 раза в секунду, при температуре +22°C в течение 10 мин. Пробирку №1 - с цельной кровью, контрольную, без криопротектора, и пробирку №2 с цельной кровью и внесенным с помощью дозаторной пипетки криопротектором в соотношении 1:2 и поэтапно замораживали до температуры -40°С в предварительно охлажденном хладоагенте в виде раствора этилового спирта 39-46 об. % с температурой холодовой адаптации -28 ÷ -34°С в морозильной камере, при этом объем замораживаемого образца составляет 10% объема хладагента, выдерживали в нем 25-30 мин и перемещали для замораживания и хранения в камеру электроморозильника. Опытные образцы оставляли на 24 ч при исследуемой температуре, после чего образцы оттаивали в водяном термостате при температуре +37°С в течение 45-60 секунд при при активном перемешивании содержимого колебательными движениями. Далее исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови.

В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого криопротектора приводим результаты опытов, которые подтверждают его эффективность при практическом применении.

Опыт 1. При анализе данных общего анализа крови и морфометрических характеристик лейкоцитов цельной крови в норме и при добавлении разработанного криопротектора установили тенденцию к снижению показателей, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений, так в опытной группе WBC×10^,9/л составило 5,6±2,18, во 2-ой 4,55±3,05, в 3-ей 4,26±3,71, в 4-ой 4,14±3,71. Показатели морфометрии лейкоцитов, такие как площадь клетки, мкм² в 1-ой группе составило 70±2,1, во 2-ой 59±2,88, в 3-ей 60±2,88, в 4-ой 70±2,88. Таким образом, криопротектор позволил стабилизировать состояние лейкоцитов и повысить степень устойчивости клеток крови к воздействию субумеренно низкой температуры -20°С и умеренно низкой температуры -40°С.

Опыт 2. При анализе данных общего анализа крови и морфометрических характеристик эритроцитов цельной крови в норме и при добавлении разработанного криопротектора установили тенденцию к снижению показателей, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений, так в опытной группе RBC 10^,12/л составило 4,62±0,2, во 2-ой 4,08±0,2, в 3-ей 3,9±0,2, в 4-ой 3,5±0,5. Показатели морфометрии эритроцитов, такие как площадь клетки, мкм² в 1-ой группе составило 46,6±4,1, во 2-ой 53,3±4,6, в 3-ей 45,3±4,6, в 4-ой 41,1±2,4. Таким образом, наблюдается тенденция к снижению показателей, однако криопротектор позволил стабилизировать состояние эритроцитов и повысить степень устойчивости клеток крови к воздействию субумеренно низкой температуры -20°С и умеренно низкой температуры -40°С.

Опыт 3. При анализе данных общего анализа крови и морфометрических характеристик тромбоцитов цельной крови в норме и при добавлении разработанного криопротектора установили тенденцию к снижению показателей, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений, так в опытной группе PLT 10⁹/л составило 230,8±2,31, во 2-ой 198,6±2,36, в 3-ей 181,5±3,71, в 4-ой 150,1±3,71. Показатели морфометрии эритроцитов, такие как площадь клетки, мкм² в 1-ой группе составило 7,7±2,23, во 2-ой 7,5±2,23, в 3-ей 7,4±2,23, в 4-ой 7,2±2,23. Таким образом, наблюдается тенденция к снижению показателей, однако криопротектор позволил стабилизировать состояние тромбоцитов и удержать значения на нижней границе, тем самым повысить степень устойчивости клеток крови к воздействию субумеренно-низкой температуры -20°С и умеренно-низкой температуры -40°С.

Готовый криопротектор прозрачен, без запаха, хорошо смешивается с кровью, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность клеток крови при замораживании.

Состав разработанного криопротектора позволяет применять его для замораживания цельной крови при субумеренно низкой (-20°С) и умеренно низкой (-40°С) температурах в электроморозильниках. Разработанный криопротектор является эффективным, доступным для широкого использования, что позволит существенно расширить спектр применяемых криопротекторов при субумеренно и умеренно низких температурах в условиях чрезвычайных ситуаций, при ликвидации последствий аварий техногенного или природного происхождения, террористических актов, вооруженных конфликтов, хранения биоматериала в длительных экспедициях.

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию криопротекторного раствора для хранения крови. Криопротектор для замораживания цельной крови при субумеренно низкой -20°С и умеренно низкой -40°С температурах включает глицерин, натрия хлорид, натрия фосфат двузамещенный, воду для инъекций и дополнительно диметилсульфоксид и лактулозу при следующем соотношении ингредиентов, об. %: глицерин 20, диметилсульфоксид 10, лактулоза 2,5, натрия хлорид 0,25; натрия фосфата двузамещенный 0,25; вода для инъекций до 100%. Предлагаемый криопротектор для цельной крови обеспечивает сохранение морфофункциональной цельности клеток крови в условиях субумеренно и умеренно низких температур. 5 пр.

Криопротектор для замораживания цельной крови при субумеренно низкой -20°С и умеренно низкой -40°С температурах, включающий глицерин, натрия хлорид, натрия фосфат двузамещенный, воду для инъекций, отличающийся тем, что дополнительно используют диметилсульфоксид и лактулозу при следующем соотношении ингредиентов, об. %:

глицерин 20 диметилсульфоксид 10 лактулоза 2,5 натрия хлорид 0,25 натрия фосфата двузамещенный 0,25 вода для инъекций до 100%