Криопротектор для цельной крови при низкотемпературной заморозке Российский патент 2025 года по МПК A01N1/125 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, а именно созданию криопротекторного раствора для хранения крови, в частности человека, в условиях низкой температуры, с сохранением форменных элементов клеток крови в физиологически активном состоянии после оттаивания.

Уровень техники

Криоконсервации биоматериала позволяет длительно хранить биообразцы без изменений клеточной структуры с сохранением функциональной активности. Существенное замедление метаболизма в клетке начинается при температуре -70°С, поэтому применяют консервирование с использование жидкого азота, но это требует громоздкого, дорогостоящего оборудования, регулярного пополнения запасов жидкого азота, что сказывается на себестоимости хранения материала, в связи с чем востребованы эффективные криоконсерванты для температурного диапазона до -80°С. Ключевым вопросом в применении криомедицинских технологий является использование нетоксичных или малотоксичных криопротекторов и криоконсервантов на их основе для замораживания клеток. Для включения компонентов в состав криоконсерванта необходимо учитывать требования: отсутствие токсичности, отсутствие неприятного запаха, хорошая растворимость в воде, способность образовывать мелкие кристаллы льда, не откладываться в клетках и тканях, быстро выводиться из организма.

Известны способы получения комбинированного криопротекторного раствора для замораживания тромбоцитов (патент RU 2477953, опубл. 27.03.2013), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, лимонная кислота и вода для инъекций; хладоограждающий раствор для замораживания тромбоцитов при умеренно-низкой температуре (патент RU 2230454, опубл. 20.06.2004), в котором используется гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина, фумарат натрия, лимонная кислота, вода для инъекций. Недостатки заключаются в том, что данные растворы предназначены для замораживания концентрата тромбоцитов, а не цельной крови.

Известны способы получения криопротекторного раствора для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-40°С) (патент RU 2439877, опубл. 27.06.2011), в котором используется глицерин, сукцинат оксиметилэтилпиридина, гидроксиэтилкрахмал, трехзамещенный цитрат натрия; криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре (патент RU 2290808, опубл. 20.05.2006), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, диметилсульфоксид, оксиметилэтилпиридин сукцина и вода; раствор для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре (патент RU 2311027, опубл. 27.11.2007), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, глюкоза, оксиметилэтилпиридин сукцинат, желатиноль, трехзамещенный цитрат натрия и вода для инъекций; криоконсервант для лейкоцитов (патент RU 2301524, опубл. 27.06.2007), в котором используется лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат, вода для инъекций и гидроксид натрия; протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С (патент RU 2261595, опубл. 10.10.2005), в котором используется глицерин, оксиметилэтилпиримидина сукцинат, модежель; хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре (патент RU 2240000, опубл. 20.11.2004), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, оксиметилэтилпиритдин сукцинат, вода для инъекций; криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (патент RU 2184449, опубл. 10.07.2002), в котором используется гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина, фумарат натрия, лимонная кислота и вода для инъекций. Недостатки заключается в том, что данные растворы предназначены для замораживания лейтоцитов, а не цельной крови.

Известны способы получения хладоограждающего раствора для замораживания ядерных клеток крови (патент RU 2464991, опубл. 27.10.2012), в котором используется глицерин, комаруман, трилон Б, вода для инъекций; криоконсерванта для замораживания ядерных клеток крови (патент RU 2530149, опубл. 10.10.2014), в котором используется диметилацетамид, гидроксиэтилкрахмал, фосфатный буфер; раствор для консервирования клеточных взвесей (патент RU 2621295, опубл. 24.05.2017), в котором используется пектиновый полисахарид каллуса раувольфии змеиной, глицерин, трилон Б и вода для инъекций. Недостатки заключаются в том, что данные растворы предназначены для замораживания лейкоцитов, ядерных клеток крови, а не цельной крови.

Известен способ консервирования цельной крови (патент SU 959786, опубл. 1982.09.23), в котором используется 15-30 %-ный водный раствор глюкозы-сахарозы при соотношении компонентов 4:1 и для восстановления концентрата крови добавляют 30-50 %-ный водный раствор глюкозы сахарозы или 20-23 %-ный водный раствор хлорида натрия, недостаток заключаются в том, что данный способ предназначены для консервирования крови животных (свиньи); известен способ консервирования донорской крови (патент RU 2410103, опубл. 27.01.2011), в котором используется гемоконсервант глюгицир, при этом дополнительно в состав гемоконсерванта глюгицир вводят 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат, недостаток заключаются в том, что данный способ предназначен для хранения крови при +4°C, а не при замораживании.

Наиболее близким по составу к заявляемому криопротектору является криопротектор для цельной крови (патент RU 2816446, опубл. 29.03.2024). Недостатком прототипа является отсутствие должного криопротекторного действия на клетки в условиях замораживания при низких температурах.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является понижение температуры при замораживании цельной крови и увеличение процента сохранности форменных элементов клеток крови путем создания криопротекторного раствора для замораживания крови в условиях низкой (-80°С) температуры с сохранением форменных элементов клеток крови в физиологически активном состоянии после оттаивания.

Технический результат достигается тем, что предлагаемый криопротектор дополнительно содержит в качестве криоагента, проникающего в клетку, диметилсульфоксид, стабилизирующий внеклеточную, а также свободную и связанную внутриклеточную воду при охлаждении, переводя ее в аморфный лед, устраняющего его рекристаллизацию - образование крупных кристаллов при оттаивании, обеспечивая высокую сохранность и функционально активное состояние ядросодержащих клеток крови, а в качестве криоагента, не проникающего в клетку, используют дисахарид лактулозу, действие которой заключается в защите структуры форменных элементов крови, поддержанию резистентности мембраны и сохранению равновесия осмотического давления, что уменьшает набухание клетки и ее гемолиз.

Преимущества использования полученного криопротектора включают в себя:

- криопротектор может храниться в течение длительного времени без потери криопротекторных свойств;

- достоинством дисахарида лактулозы кроме криопротекторных свойств является то, что это вещество не проникает внутрь клетки и не токсично;

- приготовление криопротектора не требует громоздкого, дорогостоящего оборудования;

- криопротектор позволяет стабилизировать состояние форменных элементов клеток крови к воздействию низкой температуры -80°С.

Раскрытие сущности изобретения

В составе заявляемого криопротектора, содержащего в качестве растворов солей, поддерживающих изотоническую концентрацию, используют натрия хлорид, в качестве естественным макроэргического соединения используют натрия аденозинтрифосфат, улучшающего метаболизм и энергообеспечение клеток, в качестве криоагентов, проникающих в клетку, используют глицерин (криагент эндоцеллюлярного действия) и диметилсульфоксид, которые стабилизируют внеклеточную, а также свободную и связанную внутриклеточную воду при охлаждении и переводят ее в аморфный лед, не разрушающий внутриклеточные органеллы и плазматическую мембрану, и устраняют его рекристаллизацию - образование крупных кристаллов при оттаивании, обеспечивая высокую сохранность и функционально активное состояние ядросодержащих клеток крови, в качестве криоагента, не проникающего в клетку, используют лактулозу, действие которой заключается в защите структуры форменных элементов крови, поддержанию резистентности мембраны и сохранению равновесия осмотического давления, что уменьшает набухание клетки и ее гемолиз.

Конечный состав криопротектора имеет следующие соотношения компонентов, об. %: глицерин 20, диметилсульфоксид 10, лактулоза 10, натрия аденозинтрифосфат 30 и хлорид натрия (0,9%) - до 100%.

Компьютерное цитоморфометрическое исследование клеток крови выполняли на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц2» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», Россия), состоящего из микроскопа с тринокуляром «NIKON», цифровой фотокамеры «Delta Pix - 300», персонального компьютера и программы «Анализ мазков крови».

Для проведения in vitro диагностических тестов образцов крови в лабораторных условиях использовали автоматический гематологический анализатор Гемалайт 1270 производство фирмы Dixion. На гематологическом анализаторе определяли 21 лабораторных показателя, из которых было выбрано 7 показателей, характеризующих состояние периферического лейкоцитарного звена, 5 показателей, характеризующих состояние периферического тромбоцитарного звена, 6 показателей, характеризующих состояние периферического эритроцитарного звена, 1 показатель, указывает на соотношение форменных элементов к жидкой части крови.

Для проведения статистической обработки данных использовали методы параметрического анализа и пакета Microsoft Exel. Определяли следующие параметры: среднее (Х), ошибка среднего (м) и стандартное отклонение (δ). Достоверность различия средних показателей определяли по критерию Стьюдента (t) для коэффициентов вариации, уровень значимости р выбран менее 0,05.

В группу исследования вошли условно здоровые добровольцы женского пола в количестве 30 человек, в возрасте от 18 до 23 лет, с отсутствием хронических заболеваний в период обострения, из числа которых были сформированы контрольная группа и опытная группы. Материалом для исследования послужила венозная кровь, взятая в утренние часы из локтевой вены. Взятие материала осуществлялось натощак в вакуумную систему с цитратом натрия, которая включает вакуумную пробирку с крышкой, двухстороннюю иглу, иглодержатель. Комплектация системы может отличаться в зависимости от типа анализа, состояния вен человека.

Заявляемый раствор получен растворением компонентов раствора в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Флакон с приготовленным криопротектором герметично укупоривают, маркируют, стерилизуют автоклавированием (1,2 атм - 30 минут) без диметилсульфоксид. При соприкосновении с воздухом диметилсульфоксид окисляется, распадается на соединения, усиливающие токсичность химического вещества, поэтому автоклавированию не подлежит. Стерилизацию ДМСО осуществляли фильтрованием, используя установку стерилизующей фильтрации и хранили в стерильных пробирках при температуре -10°С. Раствор ДМСО готовили непосредственно перед замораживанием образцов с криоконсервантом. Готовый раствор хранят в холодильнике при +2÷+4°C.

Изобретение осуществляется примером, но не ограничивается им.

Пример. После аспирирования порции венозной крови при температуре +22°C кровь делили на равные части в пробирки, часть из которых были контрольными пробами крови без криопротектора, а в другие добавляли разработанный криопротектор - опытные пробы. Все пробирки герметизировали пробками, содержимое перемешивали на шейкере при покачивании пробы 3-4 раза в секунду, при температуре +22°C в течение 10 мин. Пробирку №1 - с цельной кровью, контрольную, без криопротектора, и пробирку №2 с цельной кровью и внесенным с помощью дозаторной пипетки криопротектором в соотношении 1:2 и поэтапно замораживали до температуры -80°С в предварительно охлажденном хладоагенте в виде раствора этилового спирта 96 об. % с температурой холодовой адаптации -68°С в морозильной камере, при этом объем замораживаемого образца составляет 10% объема хладагента, выдерживали в нем 30 мин и перемещали для замораживания и хранения в камеру электроморозильника. Опытные образцы оставляли на 24 ч при исследуемой температуре, после чего образцы оттаивали в водяном термостате при температуре +37°С в течение 60 секунд при активном перемешивании содержимого колебательными движениями. Далее исследовали характеристики и параметры форменных элементов крови.

В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого криопротектора приводим результаты опытов, которые подтверждают его эффективность при практическом применении.

Опыт 1. При анализе данных общего анализа крови и морфометрических характеристик лейкоцитов цельной крови в норме и при добавлении разработанного криопротектора установили тенденцию к снижению показателей, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений, так в опытной группе WBC 10,⁹/l - количество лейкоцитов в единице периферической крови (5,78±0,12×10,⁹/l и 3,92±0,35×10,⁹/l р≤0,05) различия контрольной группы по отношению к опытной группе считаются статистически значимы. Lym 10,⁹/l - количество лимфоцитов в единице периферической крови (3,63±0,29×10,⁹/l и 2,17±0,36×10,⁹/l р≤0,05) данный показатель считается статистически значимым. Mid-10,⁹/l - абсолютное содержание смеси моноцитов, базофилов и эозинофилов (3,38±0,17×10,⁹/l и 2,14±0,19×10,⁹/l р≤0,05) данный показатель статистически значим. При анализе данных показателей морфометрии лейкоцитов наблюдаются статистически значимые различия в контрольной группе в сравнении с опытной группой на фоне заморозки при -80°С. Площадь клетки, мкм² в (58,92±0,57и 56,52±2,42 р≤0,05). Формфактор клетки (18,1±0,36 и 17,22±0,75 р≤0,05). Индекс поляризации клетки (0,33±0,04 и 0,14±0,03 р≤0,05. Площадь ядра, мкм² (40,45±0,89 и 32,06±1,17 р≤0,05). Ядерно-клеточное отношение (0,96±0,02 и 0,46±0,02 р≤0,05). Таким образом, криопротектор позволил стабилизировать состояние лейкоцитов и повысить степень устойчивости клеток крови к воздействию низкой температуры -80°С.

Опыт 2. При анализе данных общего анализа крови и морфометрических характеристик эритроцитов цельной крови в норме и при добавлении разработанного криопротектора установили тенденцию к снижению показателей, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений. RBC 10^,12/l - количество эритроцитов в единице периферической крови (4,63±0,35×10,¹²/l и 2,60±0,44 ×10,¹²/l р≤0,05), HGB g/l - гемоглобин крови (125,40±16,27 g/l и 111,27±14,95 g/l р≥0,05), HCT% -гематокрит (38,58±2,48 % и 33,15±1,12 % р≤0,05), MCV fl - средний объем эритроцитов (81,67±4,87 fl и 78,35±3,64 fl р≥0,05), MCH pg - среднее содержание гемоглобина в эритроците (28,69±1,78 pg и 22,39±0,81 pg р≤0,05), MCHC - средняя концентрация гемоглобина в Эр (350,78±21,33 g/l и 221,47±10,74 g/l р≤0,05). По данным показателя RDW% - анизоцитоз эритроцитов, наблюдается снижение в опытной группе при -80°С в криоконсерванте (15,09 ±1,37 % и 12,11±1,78 % р≤0,05). При анализе данных морфометрии эритроцитов получили следующие значения. Площадь клетки, мкм.² в (52,06±2,97 и 36,09±3,44 р≤0,05). Средний диаметр, мкм (7,75±0,32 и 6,20±0,39 р≤0,05). Фактор формы (13,50±0,27 и 11,24±0,65 р≤0,05). Данные морфометрии эритроцитов демонстрируют снижение показателей в опытной группе в сравнении с группой контроля, однако полученные показатели указывают на стабильность образцов и укладываются в пределы допустимых изменений качества форменных элементов. Таким образом, наблюдается тенденция к снижению показателей, однако криопротектор позволил стабилизировать состояние эритроцитов и повысить степень устойчивости клеток крови к воздействию низкой температуры -80°С.

Опыт 3. При анализе данных общего анализа крови и морфометрических характеристик тромбоцитов цельной крови в норме и при добавлении разработанного криопротектора установили тенденцию к снижению показателей, однако все полученные данные не выходят за пределы допустимых значений. PLT - количество тромбоцитов в единице периферической крови (241,10±36,38 ×10,⁹/l и 163,80±13,71×10,⁹/l р≤0,05). MPV - средний объем тромбоцитов (9,54±0,04 fl и 7,44±0,41 fl р≤0,05). PDW- относительная ширина распределения тромбоцитов по объему крови (12,78±2,06 % и 10,43±1,87 % р≤0,05). PCT % тромбокрит, доля (%) объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами (0,18±0,02 и 0,15±0,02 % р≤0,05). P-LCR % - лабораторный критерий, отражающий долю содержания гигантских тромбоцитарных клеток в крови, измеряется в %. (28,36±6,78 % и 24,07±3,17 % р≥0,05). P-LCC 10,⁹/l - лабораторный критерий, отражающий долю содержания гигантских тромбоцитарных клеток в крови (54,11±10,95 и 48,33±10,33 р≥0,05). При анализе данных морфометрии тромбоцитов получили значения, отражающие тенденцию к снижению площади клетки, мкм² в (7,25±0,31 и 6,05±0,12 р≤0,05), средний диаметр, мкм (2,95±0,57 и 2,36±0,26 р≤0,05)., фактор формы (12,18±0,23 и 10,43±0,68 р≤0,05). Полученные результаты в ходе сравнительного анализа демонстрируют тенденцию к снижению по всем показателям, однако все значения укладываются в пределы допустимых изменений характеристик форменных элементов. Таким образом, наблюдается тенденция к снижению показателей, однако криопротектор позволил стабилизировать состояние тромбоцитов и удержать значения на нижней границе, тем самым повысить степень устойчивости клеток крови к воздействию низкой температуры -80°С.

Готовый криопротектор прозрачен, без запаха, хорошо смешивается с кровью, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность клеток крови при замораживании.

Состав разработанного криопротектора позволяет применять его для замораживания цельной крови при низкой (-80°С) температуре. Разработанный криопротектор является, эффективным, доступным для широкого использования, что позволит существенно расширить спектр применяемых криопртекторов при низких температурах, что позволяет расширить спектр применяемых криоконсервантов в условиях чрезвычайных ситуаций, при ликвидации последствий аварий техногенного или природного происхождения, террористических актов, вооруженных конфликтов, хранения биоматериала в длительных экспедициях и отдаленных местностях, для восполнения временной нехватки крови, при экстренной необходимости переливания собственной криоконсервированной цельной крови.

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам для хранения крови. Криопротектор для замораживания цельной крови при низкой температуре -80°С в качестве исходных ингредиентов содержит, об.%: глицерин 20, диметилсульфоксид 10, лактулозу 10, натрия аденозинтрифосфат 30, стерильный 0,9% раствор натрия хлорида - до 100%. Предлагаемый криопротектор для цельной крови обеспечивает хранение крови в условиях низких температур с сохранением форменных элементов клеток крови в физиологически активном состоянии после оттаивания. 4 пр.

Криопротектор для замораживания цельной крови при низкой температуре -80°С, характеризующийся тем, что в качестве исходных ингредиентов содержит глицерин, стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, диметилсульфоксид, лактулозу и натрия аденозинтрифосфат при следующем соотношении, об.%:

глицерин - 20,

диметилсульфоксид - 10,

лактулоза - 10,

натрия аденозинтрифосфат - 30,

стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида - до 100%.