КРИОКОНСЕРВАНТ ДЛЯ ЛЕЙКОЦИТОВ Российский патент 2007 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине и физиологии и касается создания криоконсерванта для лейкоцитов.

В качестве прототипа нами выбран протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С (Патент на изобретение №2261595), который включает модежель, глицерин и оксиметилэтилпиридина сукцинат.

Существенным недостатком прототипа является то, что данный раствор не может быть реализован, т.к. модежель, входящий в него, перестал выпускаться промышленностью, кроме того, модежель не обладает стимулирующим действием на фагоциты, в частности, на нейтрофилы.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание криоконсерванта для лейкоцитов, позволяющего сохранить лейкоциты в физиологически полноценном состоянии при температуре -10°С.

Технический результат достигается тем, что в предложенный криоконсервант для лейкоцитов включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - лемнан, обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -10°С выраженный криобиологический (технический) эффект и оказывающий стимулирующее влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов: под действием лемнана увеличивается способность нейтрофилов поглощать частицы латекса на 20-50% (Ovodov Yu.S. et.al. // XIX Intern. Carbohydr. Symp. August 9-14, 1998, San Diego, 1998 - P.DPO 41; Попов С.В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф....дис. канд. биол. наук; Сыктывкар, 1999-19 с.), поэтому включение лемнана в криоконсервант, не требующий отмывания после выхода нейтрофильных клеток из криогипобиоза, усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 100% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев: Наукова думка, 1978. - с.5-64) и производное янтарной кислоты оксиметилэтилпиридина сукцинат (кратко ОМЭПС), обладающий антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием, восстанавливает нарушенные функции мембран клеток, тормозит перекисное окисление липидов. Сукцинат участвует в энергетическом обмене клетки (Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. - М.: Мир, 1980. - с.317-319 и с.321-322).

Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.

Пример использования средства

Консервант, содержащий лемнан в концентрации 0,3%, глицерин - 7%, оксиметилэтилпиридина сукцинат - 0,3%, воду для инъекций до 100 мл и 4 М. раствор гидроксид натрия (1-2 кап.) до рН раствора 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 18 мин при комнатной температуре, помещают на 24 часа в электрический морозильник (в 3-литровую ванну с этиловым 96° спиртом, охлажденным до -10°С). Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 2-3 секунд при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в сек). Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - N 9. - с.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.

Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава».

Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов представлен в таблице 1.

Таблица 1Характеристика состава различных вариантов криоконсерванта для сохранения лейкоцитов при температуре -10°С в расчете на 100 г сухого вещества (в г)Номер варианта криоконсервантаСостав хладоограждающего раствораЛемнан, в%Глицерин, в%ОМЭПС, в%Вода для инъекций, в мл.10,207,00,30До 10020,307,00,30До 10030,407,00,40До 100

Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта N1, N2 и N3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.

Таблица 2.Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейкоцитным концентратомНомер варианта криоконсервантаКонечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесьюЛемнан, в%Глицерин, в%ОМЭПС, в%Вода для инъекций, в мл.10,100,350,15До 20020,150,350,15До 20030,200,350,20До 200

Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (табл.3).

Таблица 3.Результаты после замораживания до -10°С и оттаивания лейкоцитов с различными вариантами предложенного криоконсервантаВариант консервирующего раствораПоказатели, в % к исходному уровню. n=7Жизнеспособность лейкоцитовМорфологическая сохранность гранулоцитовФагоцитарная активность нейтрофиловВерхний предел дозировок ингредиентов раствора83,50±12,15*95,50±5,7598,75±2,99Оптимальное соотношение ингредиентов раствора97,58±1,73100,00±0,0099,75±0,71Нижний предел дозировок ингредиентов раствора81,62±15,96*78,86±10,54*86,14±5,61** - различие достоверное (р<0,05)

Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения - отогрева при использовании криконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.

Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН 7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при охлаждении лейкоцитов до -10°С.

Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -10°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных лейкоцитарных клеток. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.

Изобретение относится к области медицины и физиологии. Криоконсервант содержит в оптимальном соотношении лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат, воду для инъекций и гидроксид натрия (для доведения рН раствора до 7,0-7,4). Экспозиция лейкоконцентрата с криоконсервантом в течение 18 мин, охлаждение по экспоненциальной программе до -10°С. Изобретение обеспечивает при быстром отогреве сохранить 99,75±0,71% физиологически полноценных лейкоцитов нейтрофильных клеток. 3 табл.

Криоконсервант для лейкоцитов, характеризующийся тем, что он содержит лемнан, глицерин, оксиметилэтилпиридина сукцинат и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов, %:

Лемнан 0,2-0,4Глицерин 7,0Оксиметилэтилпиридина сукцинат0,3-0,4Вода для инъекций До 100 млГидроксид натрия 1 М раствор До рН 7,0-7,4