СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2012 года по МПК C07F15/00 C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу детекции гибридизации нуклеиновых кислот посредством электрохимических методов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детекции определенной последовательности ДНК, наличия несовпадения в указанной последовательности, а также его положения, основанному на применении соединения, полученного из рутения, формулы (Ι) в качестве индикатора гибридизации в электрохимических биосенсорах.

Предшествующий уровень техники

Молекулярная диагностика, основанная на анализе коротких последовательностей ДНК, предлагает чувствительные и количественные методы для ранней детекции инфекционных заболеваний, вызванных патогенами (Garg, S. K. et al. Clin. Lab. Anal. 2003, 17(5), 155-163; Vernet, G. Virus Res. 2002, 82(1-2), 65-71).

Гибридизация ДНК представляет собой наиболее распространенный метод анализа и детекции определенного гена или сегмента нуклеиновой кислоты. Среди методов, основанных на гибридизации, существуют методы, основанные на поверхностном плазмонном резонансе (Mullet, W. M. et al. Methods 2000, 22, 77-91; Sawata, S. et al. Biosens. Bioelectron. 1999, 14, 397-404; Livache, T. et al. Synth. Met. 2001, 121, 1443-1444; Wood, S. J. Microchem. J. 1993, 47, 330-337), флуоресценции (Piunno, P.A.E. et al. Anal. Chim. Acta, 1994, 288, 205-214; Fodor, S. et al. Scince, 1991, 251, 767-773), гравиметрии (Okahata, Y. et al. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 8299-8300; Minnuni, M. et al. Anal. Chim. Acta, 2003, 481, 55-64) или радиоизотопных метках (Seller, G.H. et al. DNA Probes, 2 ^nd ed. Stockton Press: New York, 1993; pp 149-213). Наиболее используемый метод основан на применении радиоактивно-меченых фрагментов ДНК или РНК, известных как зонды. Фактически, данная методология представляет собой основу контролируемой амплификации ДНК, известной как ПЦР (полимеразная цепная реакция), которая используется для клонирования и секвенирования ДНК.

Среди методов, основанных на гибридизации ДНК, биосенсоры имеют преимущества по сравнению с вышеупомянутыми способами. Одно из преимуществ этих методов - возможность разработки простых портативных устройств для данного типа диагностики. Более того, совмещение данных ДНК-биосенсоров и методов ПЦР-амплификации может обеспечить высокую чувствительность детекции последовательностей нуклеиновых кислот (Meric, B. et al. Talanta 2002, 56(5), 837-846). Применение иммобилизованных на поверхности флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов позволило разработать ДНК-микрочипы высокой плотности для анализа определенных последовательностей ДНК и экспрессии генов. Однако эти методы требуют мечения ДНК-мишени (Berre, V.L. et al. Nucleic Acids Res. 2003, 31, e88; Dolan, P.L. at al. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 107).

Поскольку ДНК имеет электроактивные нуклеиновые участки, также были разработаны системы электрохимической детекции, основанные на данном свойстве, для прямой детекции гибридизованной ДНК, без необходимости применения маркера (Park, S. et al. Science, 2002, 295, 1503-1506; Drummond, T.G. et al. Nat. Biotech., 2003, 21, 1192-1199). ДНК обычно иммобилизируется на электроде и разница электрического тока измеренного до и после гибридизации зависит от количества ДНК, зафиксированного на электроде (WO93/20230). Однако данная прямая детекция без маркера не является очень чувствительной.

С целью улучшения чувствительности были разработаны различные подходы, использующие электроактивную молекулу-зонд или электроактивный маркер. Так, Palanti et al. (1996, Analytical Letters, 29, pp. 2309-31) описал различные электроактивные соединения, которые могут быть ассоциированы с ДНК и могут, таким образом, быть детектированы через окислительно-восстановительные процессы при приложении потенциала к электроду. Так используются комплексы переходных металлов, антибиотики, акридиновые или бензамидные красители и другие ДНК-интрекалирующие агенты.

Так как данные электроактивные зонды или маркеры обладают лучшими окислительно-восстановительными свойствами, чем ДНК, их применение позволяет получать более высокое отношение сигнал-шум и лучшую чувствительность.

Соединения, получаемые из салофена (Revenga Parra, M. et al. "Comprehensive study of the interactions between DNA and new Schiff base ligands containing quinone functional groups" Biosensors and Bioelectronics. Volume: 22; Pages 2675-2681) и комплексов осмия (Del Pozo, M. V. et al. Anal. Chem. 2005a. 77 (8), 2550-2557), также применяются в качестве электрохимических индикаторов. В документе CAO02524263 комплексы рутения, встроенные в двойную спираль в разомкнутом состоянии, применяются в качестве индикаторов гибридизации.

Авторы настоящего изобретения разработали способ, позволяющий улучшить чувствительность электрохимической детекции последовательностей нуклеиновых кислот в результате применения нового комплекса рутения, получаемого “in situ”, известного как комплекс пентаамина рутения [3-(2-фенантрен-9-ил-винил)пиридин] (называемого RuL) в качестве индикатора гибридизации в электрохимических биосенсорах.

RuL-комплекс, образованный в результате связывания комплекса пентаамина рутения с лигандом 3-(2-фенантрен-9-ил-винил)пиридин (L), является абсолютно новаторским, так же как и его применение для данных целей.

Высокая чувствительность и специфичность, достигаемые при помощи разработанного метода, позволяют без необходимости применения какого-либо типа мечения детектировать и количественно определять не только определенную последовательность ДНК, но также единичное несоответствие в основании указанной последовательности, а также его положение в определенной последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивая сверх того систему детекции более быструю и характеризуемую лучшим показателем “цена/эффективность” нежели ПЦР.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. а) Дифференциальная импульсная вольтамперограмма (DPV) RuL, аккумулированного в золотом электроде, модифицированном SEQ ID NO. 1 до (2) и после гибридизации с комплементарной цепью (SEQ ID NO. 2) (1) и некомплементарной цепью (SEQ ID NO. 3) (3). b) Амплификация DPV от -0,6 до 0 V потенциала развертки.

Фигура 2. Дифференциальная импульсная вольтамперограмма (DPV) RuL, аккумулированного в золотом электроде, модифицированном с (SEQ ID NO. 1): при гибридизации с последовательностью с нарушенной комплементарностью в основании, локализованном в середине последовательности (SEQ ID NO. 4) (2) при гибридизации с последовательностью, комплементарность которой нарушена вблизи 5'-конца последовательности (SEQ ID NO. 5), (3) при гибридизации с последовательностью, комплементарность которой нарушена вблизи 3'-конца последовательности (SEQ ID NO. 6), (4) и при гибридизации с неспаренной последовательностью (SEQ ID NO. 3) (1).

Цель изобретения

Целью данного изобретения является новое получаемое из рутения соединение формулы (Ι), известное как комплекс пентаамин рутения [3-(2-фенантрен-9-ил-винил)пиридин].

Способ детекции гибридизации между зондом и последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, основанный на применении упомянутого комплекса формулы (Ι) в качестве индикатора гибридизации, также является целью изобретения.

Наконец применение получаемого из рутения соединения формулы (Ι) в качестве электрохимического индикатора гибридизации между последовательностями нуклеиновых кислот является целью данного изобретения.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения после значительной научно-исследовательской работы разработали новое, получаемое из рутения соединение, структура которого позволяет применять его в качестве индикатора процесса гибридизации между последовательностями нуклеиновых кислот в электрохимических биосенсорах для детекции нарушения комплементарности в единичном основании, а также положения этого нарушения внутри последовательности.

Таким образом, основной аспект изобретения относится к новому получаемому из рутения соединению формулы (Ι):

Данный новый комплекс, известный как пентаамин рутения [3-(2-фенантрен-9-ил-винил)пиридин] (называемый RuL), получаемый in situ, в связи со своим строением имеет двойственную функциональность. С одной стороны, планарная структура ароматической группы лиганда 3-(2-фенантрен-9-ил-винил)пиридина (L) придает комплексу интеркалирующий характер и, вследствие этого, позволяет ему связываться с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами. Это свойство отличает его от комплексов, применяемых на существующем техническом уровне, основная форма связывания ДНК в котором электростатична (значительно меньшее специфическое связывание по сравнению с тем, что происходит посредством интеркаляции), что обеспечивает более специфическое связывание с ДНК, позволяющее получать лучшие результаты. С другой стороны, окислительно-восстановительный центр металла (Ru) представляет собой электрохимический индикатор для детекции процесса гибридизации.

Опираясь на преимущества, которыми обладает данное новое соединение, был разработан способ электрохимической детекции процесса гибридизации между последовательностями нуклеиновых кислот, основанный на применении упомянутого соединения в качестве индикатора гибридизации, позволяющего определять единичные неспаренные основания и их положение в нуклеотидной последовательности.

Таким образом, другой основной аспект изобретения подразумевает метод для детекции гибридизации между зондом и поледовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, включающий в себя следующие стадии:

a) иммобилизация зонда нуклеиновой кислоты на поверхности электрода,

b) инкубация электрода, модифицированного зондом нуклеиновой кислоты, в растворе, который может содержать последовательность-мишень так, чтобы происходила гибридизация,

c) погружение электрода после инкубации в раствор, содержащий соединение, получаемое из рутения, формулы (I),

d) применение циклической развертки потенциала для внедрения соединения, получаемого из рутения, в двуцепочечную нуклеиновую кислоту, формируемую при гибридизации, и

e) электрохимическая детекция гибридизации между зондом и последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени.

Детекция процесса гибридизации позволяет обнаруживать определенные последовательности нуклеиновых кислот, количественно определять последовательности нуклеиновых кислот, детектировать неспаренное основание в последовательности нуклеиновой кислоты или определять положение указанного неспаренного основания.

В настоящем изобретении “зонд” определен как фрагмент нуклеиновой кислоты, обладающий специфичностью гибридизации в определенных условиях при гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью.

В предпочтительном варианте осуществления “нуклеиновая кислота” определена как ДНК и/или РНК фрагменты, на основании которых может быть детектирована гибридизация между ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК последовательностями.

Как уже упоминалось, комплекс рутения формулы (Ι), в силу наличия ароматических колец лиганда (L), предпочтительно встраивается между спаренными основаниями иммобилизованной на поверхности электрода двухцепочечной нуклеиновой кислоты, образованной при гибридизации между иммобилизированной последовательностью зонда и последовательностью-мишенью, присутствующей в растворе.

Когда к упомянутому электроду прикладывается подходящий потенциал, окисление окислительно-восстановительного центра рутения вызывает увеличение фарадеевского тока, напрямую связанное с явлением гибридизации. Это позволяет детектировать специфические последовательности нуклеиновых кислот (последовательности-мишени).

Более того, интенсивность фарадеевского тока возрастает пропорционально степени гибридизации, что позволяет количественно определять последовательности нуклеиновых кислот.

Наконец, чувствительность и специфичность, достигаемые при помощи этого способа в результате применения RuL-соединения в качестве индикатора гибридизации, позволяют определять нарушение комплементарности в единичном основании определенной последовательности, а также положение этих нарушений в данной последовательности.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновые кислоты - как зонд, так и последовательность-мишень, представляют собой ДНК.

Электрод, примененный в описанном методе, может быть различного типа (углеродный, золотой и так далее). В данном варианте осуществления использовался электрод, сделанный из золота.

Внедрение комплекса рутения (RuL) в двойную цепь было осуществлено посредством развертки потенциала, что придает методу более высокую чувствительность в сравнении с методами, осуществляющими внедрение при открытой цепи, в которых окончание внедрения материала не контролируется.

В предпочтительном варианте осуществления циклическая развертка потенциала применяется 200 раз между -0,5 и 0,1 В.

Гибридизация была детектирована через изменение электроактивности RuL-комплекса при применении дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV). Детекция гибридизации происходит при потенциале приблизительно -0,30 В, что делает этот комплекс особенно эффективным в связи с его низким окислительно-восстановительным потенциалом, предотвращающим возможное вмешательство окисления других соединений.

В другом предпочтительном варианте осуществления электрохимическая детекция проводится при частоте развертки 10 Мв/с, амплитуде импульса в 50 мВ и длительности импульса в 0,2 с.

И, наконец, другой основной аспект изобретения предполагает применение RuL-соединения формулы (Ι) в качестве индикатора гибридизации между последовательностями нуклеиновых кислот.

В конкретном варианте осуществления применение RuL-соединения позволяет количественное определение последовательностей нуклеиновых кислот.

В другом конкретном варианте осуществления применение RuL-соединения позволяет определять неспаренную пару оснований в последовательности нуклеиновой кислоты.

В другом конкретном варианте осуществления применение RuL-соединения позволяет определять положение неспаренного основания в последовательности нуклеиновой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

Следующие ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение, однако не должны рассматриваться как ограничивающие его основные цели, так как они располагаются далее в разделе этого описания.

Пример 1

Синтез RuL-комплекса

80 мкл 2 мМ Ru (NH₃)₅(H₂О) напрямую смешали в растворе с 80 мкл 2 мМ лиганда, (L=3-(2-фенантрен-9-ил-винил)пиридин). Лиганд 3-(2-фенантрен-9-ил-винил)-пиридин синтезировали согласно следующей процедуре: 15 мл N,N,N',N'-тетрааминфенантрен продували очищенным сухим азотом, после чего добавляли 1,3 мл 4-винилпиридина, 24,2 мг ацетата палладия и 0,1118 мг трифенилфосфина, и смесь продувалась очищенным сухим азотом в течение 15 минут. Смесь осушали в течение 40 часов предварительно очищенным азотом с применением обратного холодильника. Затем к смеси добавляли 250 мл 0,1 M HCl, появился яркий желтый осадок. Осадок отфильтровали и промыли EtOH c CH₂CL₂. Основную форму (светло-бежевый цвет) лиганда получили после нейтрализации осадка H₂О/0,1M NaOH. Ru(NH₃)₅(H₂О) синтезировали, следуя процедуре, описанной C.G.Kehuen and H.Taube (Kuehn, C.C.; Taube, H.Journal of the American Chemical Society, 1976, 98(3), 689-702).

Конструирование (био)сенсора

Биосенсор подготавливали посредством иммобилизации последовательности ДНК зонда на золотом электроде прямой адсорбцией в течение одного часа при комнатной температуре. Модифицированный электрод погружали на 30 минут в дистиллированную воду для устранения неабсорбированных остатков ДНК. До иммобилизации электрод отполировывали и стандартизировали согласно ранее описанной процедуре (Widrig, C.A.; Chung, C.; Porter, M.D.J. Electroanal. Chem. 1991, 310, 335-359).

Гибридизация и интеркаляция комплекса

Электрод, сделанный из золота, модифицированный ДНК зондом, инкубировали 1 час при 40°С с комплементарной, некомплементарной и неполностью комплементарной последовательностями ДНК, каждая из которых подготавливалась в гибридизационном буфере (10 мМ фосфат, pH 7,0, c 0,4 M NaCl). При гибридизации электроды погружали в 20 мкМ раствор RuL в 5 Мм KNO₃, и 200 раз проводили циклическую развертку потенциала между -0,5 и 0,1 В. Перед применением электроды промывали дистиллированной водой.

Электрохимические измерения

Трехэлектродная электрохимическая ячейка собственного производства со вспомогательным платиновым электродом и каломельным электродом, насыщенным NaCl, также собственного производства, использовалась как контрольный электрод. Раствор очищали N₂ перед каждым электрохимическим измерением, и поддерживали атмосферу азота в течение всего измерения. KNO₃ использовали как поддерживающий электролит. Измеренные параметры дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV) были: частота развертки 10 Мв/с; амплитуда импульса: 50 мВ; длительность импульса: 0,2 с.

Результаты: новое применение изобретения

Разработанная система, служащая в качестве прототипа для детекции какой-либо последовательности, применялась для детекции определенной последовательности Helicobacter pylori. 25-ти нуклеотидная тиолированная синтетическая последовательность этой бактерии (SEQ ID NO. 1) иммобилизировалась на золотом электроде (плотность нанесения: 9,0 пикамоль/см²) через тиольные группы. При первом анализе гибридизации в качестве последовательностей-мишеней использовали комплементарную (SEQ ID NO. 2) и некомплементарную (SEQ ID NO. 3) последовательности. Иммобилизация пробной последовательности (SEQ ID NO. 1), гибридизация и текущие измерения проводили согласно ранее описанным процедурам и положениям. На фигуре 1 изображена дифференциальная импульсная вольтамперограмма (DPV) 20 мкМ RuL, аккумулированного в электроде, модифицированном последовательностью (SEQ ID NO. 1), взятой до (2) и при гибридизации с комплементарной (SEQ ID NO. 2) (1) и некомплементарной цепью (SEQ ID NO. 3) (3).

Наблюдали, что при гибридизации на поверхности биосенсора последовательности (SEQ ID NO. 1) с комплементарной цепью (SEQ ID NO. 2) в результате окисления рутения, входящего в комплекс, заключенный в двойную цепь, на вольтамперограмме увеличивается пик силы тока. На основании коэффициента поверхностного покрытия по возможной оценке в каждые 25 пар оснований были заключены по 5 молекул комплекса рутения. Впрочем, после проведения гибридизации с некомплементарной последовательностью (SEQ ID NO. 3) никаких изменений в силе тока не наблюдалось (сравните кривую 2 и кривую 3 на Фигуре 1). Таким образом, изменения, вызванные в пиковом значении тока и в потенциале, указывают, что комплекс (RuL) представляет собой электрохимический индикатор для определения процесса гибридизации между Helicobacter pylori ДНК-фрагментами и, следовательно, распознавания определенных фрагментов, присутствующих в зонде. Более того, при значении силы тока в -0,260 В ее увеличение идет пропорционально продолжительности гибридизации, то есть увеличению количества последовательности, иммобилизированной на электроде (зонде). Различия между электродами могут быть исправлены посредством графического представления нормированного тока (i-i0/i0) по отношению к количеству зонда, в котором i0 и i представляют ток до и после гибридизации для определенного количества комплементарной SEQ ID NO. 2. Нормированный ток, измеренный при -0,260 В, продемонстрировал прекрасную линейную корреляцию (коэффициент линейной корреляции, r=0,995) с увеличением количества комплементарной последовательности SEQ ID NO. 2 в области от 106 до 708 пикамоль. Предел детекции, вычисляемый как сигнал, соответствующий пробной последовательности (SEQ ID NO. 1) плюс трехкратное среднее квадратическое отклонение, равнялся 92±4 пикамоль комплементарной последовательности (SEQ ID NO. 2), и воспроизводимость определения равнялась 94%.

Детекция последовательностей, содержащих неспаренные основания

Селективность биосенсоров была оценена посредством анализа последовательностей, содержащих единичные неспаренные основания в различных положениях: в середине (SEQ ID NO. 4) и на концах (SEQ ID NO. 5) и (SEQ ID NO. 6), как указано на схеме Фигуры 2, при таких же условиях гибридизации, как те, что использовались для полностью комплементарной последовательности (SEQ ID NO. 2). Искаженные двойные спирали, образовавшиеся при гибридизации зонда (SEQ ID NO. 1) с последовательностями, содержащими неспаренное основание, накопили меньшее количество RuL, и в результате сила тока, полученная после его окисления, была меньше полученной при гибридизации с полностью комплементарной последовательностью (SEQ ID NO. 2). Фигура 2 (кривые 2, 3 и 4) демонстрирует дифференциальные импульсные вольтамперограммы (DPV), полученные при гибридизации, произошедшей на золотом электроде, модифицированном зондом (SEQ ID NO. 1), с различными последовательностями с неспаренными основаниями в различных положениях, с применением RuL в качестве электрохимического индикатора. Во всех случаях было значительное снижение пика тока в сравнении его с полученным в случае гибридизации зонда SEQ ID NO. 1 с полностью комплементарной последовательностью (SEQ ID NO. 2) (Фигура 1, кривая 1). Более того, ток, полученный в случае, когда некомплементарный нуклеотид находился в середине последовательности, был ниже (смотреть кривую 2, Фигура 2) полученного в случае нахождения неспаренного основания на конце (Фигура 2, кривые 3 и 4, соответственно) и выше (50%) полученного в случае полностью некомплементарной последовательности (смотреть кривую 1 Фигуры 2). Это позволяет точно определять наличие неспаренного основания в определенной последовательности и также его положение.

В заключение, результаты отчетливо демонстрируют применимость разработанной системы, основанной на применении комплекса рутения (RuL) в качестве индикатора гибридизации в электрохимических биосенсорах для детекции последовательностей ДНК, их количественного определения и детекции неспаренного основания и также его положения.

Изобретение относится к соединению формулы (I):

Также предложены способ детекции гибридизации и применение соединения формулы (I) в качестве электрохимического индикатора гибридизации. Изобретение позволяет улучшить чувствительность электрохимической детекции последовательностей нуклеиновых кислот в результате применения нового комплекса рутения. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Соединение формулы (I)

2. Способ детекции гибридизации между зондом нуклеиновой кислоты и последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
a. иммобилизация зонда нуклеиновой кислоты на поверхности электрода,
b. инкубация электрода, модифицированного зондом нуклеиновой кислоты в растворе, содержащем последовательность-мишень, для того, чтобы произошла гибридизация между зондом нуклеиновой кислоты и последовательностью-мишенью,
c. погружение электрода после инкубации на стадии b) в раствор, содержащий соединение по п.1,
d. применение циклической развертки потенциала для внедрения указанного соединения в двойную цепь нуклеиновой кислоты, получаемую при гибридизации,
е. электрохимическая детекция гибридизации между зондом и последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени,
где детекция гибридизации позволяет детектировать последовательность нуклеиновой кислоты, количественно определять последовательности нуклеиновых кислот, детектировать неспаренное основание в последовательности нуклеиновой кислоты или определять положение указанного неспаренного основания.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота зонда и последовательности-мишени представляет собой ДНК.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что используемый электрод сделан из золота.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что циклическая развертка потенциала применяется 200 раз между -0,5 и 0,1 В.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что электрохимическая детекция проводится посредством дифференциальной импульсной вольтамперометрии с частотой развертки 10 Мв/с, амплитудой импульса 50 мВ и длиной импульса 0,2 с.

7. Применение соединения по п.1 в качестве электрохимического индикатора гибридизации между последовательностями нуклеиновой кислоты.

8. Применение соединения по п.7 для детекции последовательности нуклеиновой кислоты.

9. Применение соединения по п.7 для количественного определения последовательностей нуклеиновой кислоты.

10. Применение соединения по п.7 для детекции неспаренного основания в последовательности нуклеиновой кислоты.

11. Применение соединения по п.7 для детекции положения неспаренного основания в последовательности нуклеиновой кислоты.

12. Применение соединения по любому из пп.7-11, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.