СРЕДСТВО ТЕРАПИИ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2013 года по МПК C07D243/14 C07D239/50 A61K31/505 A61K31/5513 A61P35/00 

Изобретение относится к созданию новых соединений, обладающих противоопухолевой активностью, которые могут быть использованы в медицинской практике для лечения раковых заболеваний.

Известно, что некоторые пиразоло[3,4-d]пиримидины обладают активностью в отношении ингибирования киназы гликоген-синтазы (GSK-3). Цитотоксические эффекты данных соединений были проверены на клеточных линиях MCF-7 рака молочной железы человека и HEPG2-1 и HELA карциномы печени. Наиболее эффективным оказалось вещество 1,3,7-трифенил-6-[(диметиламино)метилен]-1H-пиразол[3′,4′:4,5]пиримидо[1,6-b][1,2,4]триазепин-5-он со значениями IC₅₀ равными 4,76 мкг/мл для MCF-7, 7,19 мкг/мл для HEPG2-1 и 8,09 мкг/мл для HELA (Sayed M. Riyadh, Thoraya A. Farghaly, and Sobhi M. Gomha. Novel Polyazaheterocyclic Systems: Synthesis, Antitumor, and Antimicrobial Activities // Arch Pharm Res. Vol 33, No 11, 1721-1728, 2010). Сравнения с известными препаратами не производилось.

В отношении клеточной линии MCF-7 рака молочной железы была испытана активность различных серий соединений, включающих, в том числе, производные пиразоло[1,5-а][1,3,5]триазинов in vitro. Сравнение производилось с препаратом doxorubicin (Adriablastina^®). Пять веществ, содержащих сульфамидный фрагмент, показали высокую активность, IC₅₀ оказалась на уровне 1,88-3,02 мкг/мл, что оказалось даже больше, чем у препарата doxorubicin (Hala M. Aly. Novel pyrrolidinone and pyrazolo[1,5-a][1,3,5]triazine derivatives bearing a biologically active sulfamoyl moiety as a new class of antitumor agents // Monatsh Chem. Published Online 08 June 2011).

Наиболее близкие по структуре соединения, являющиеся новым типом веществ среди ингибиторов циклин-зависимых киназ, являются описанные 4-арилазо-3,5-диамино-1H-пиразолы (4-Arylazo-3,5-diamino-1H-pyrazole CDK Inhibitors: SAR Study, Crystal Structure in Complex with CDK2, Selectivity, and Cellular Effects / Vladimir Krystof, Petr Cankar, Iveta Frysova, Jan Slouka, George Kontopidis, Petr Dzubak, Marian Hajduch, Josef Srovnal, Walter F. de Azevedo Jr., Martin Orsag, Martina Paprskarova, Jakub Rolcik, Ales Latr, Peter M. Fischer and Miroslav Strnad // J. Med. Chem. 2006, 49, 6500-6509). Некоторые из них показали хорошую активность CDK2.

Изобретение решает задачу создания противоопухолевого средства.

Технический результат заключается в уменьшении или полном прекращении роста клеток опухолевых тканей путем нарушения клеточного деления на уровне ингибирования ферментов.

Сущность изобретения заключается в создании на основе легкодоступных исходных соединений ряда противоопухолевых средств, включающих фрагменты, близких по структуре к новым АТФ антагонистам, ингибиторам циклин-зависимых киназ (CDK), нарушающих нормальный цикл деления клеток, в первую очередь быстро делящихся атипичных и раковых клеток для лечения онкологических заболеваний. Средство терапии раковых заболеваний представляет собой вещество в свободном виде, либо в виде фармацевтически приемлемых солей, имеющее одну из структур

где Ar представляет собой Ph или 4-NO₂-С₆Н₄.

За основу были взяты ароматические амины, динитрил малоновой кислоты, а также различные бинуклеофилы - неароматические (мочевина) и ароматические (1,2-фенилендиамин (Acros Organics, Belgium). На первой стадии получают азосоединения, которые на второй стадии вводятся в реакцию с бинуклеофилами.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» означает стандартные кислотно-аддитивные соли или основно-аддитивные соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению и образуются из пригодных нетоксичных органических или неорганических кислот или органических или неорганических оснований. Примеры кислотно-аддитивных солей включают соли неорганических кислот, таких как соляная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кислота, фосфорная кислота и азотная кислота, а также соли органических кислот, таких как n-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота и т.п.

Получение новых соединений и их лабораторные испытания противоопухолевой активности иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Двухстадийный синтез 4,6-диамино-5-(фенилдиазенил)пиримидин-2(5H)-она (соединение 1).

Стадия 1. Получение 2-(фенилдиазенил)малононитрила на основе динитрила малоновой кислоты и анилина. Приготовление диазокомпоненты: к 0,5 г (3,8 ммоль) солянокислого анилина прибавляют 1-2 мл концентрированной серной кислоты, 0,5 мл воды, перемешивают до образования прозрачного раствора, охлаждают на льду. В отдельной стеклянной емкости растворяют 0,27 г (3,8 ммоль) нитрита натрия, раствор охлаждают на льду, затем при постоянном перемешивании добавляют в один прием к ранее приготовленному раствору. Полученный раствор соли диазония оставляют стоять на льду в течение 10-15 минут, затем избыток образовавшейся азотистой кислоты нейтрализуется подходящим количеством мочевины или ацетата натрия (до исчезновения синего окрашивания иод-крахмальной бумаги). Приготовление азокомпоненты: 0,25 г (3,8 ммоль) динитрила малоновой кислоты растворяют в воде. Азосочетание: раствор диазокомпоненты при постоянном перемешивании на холоде приливают к раствору азокомпоненты, оставляют перемешиваться в течение 2-3 часов, выпавший осадок азосоединения отфильтровывают, промывают водой и сушат. Выход 0,49 г (75%), зеленовато-желтые кристаллы, т.пл. 142-144°С.

Стадия 2. Получение 4,6-диамино-5-(фенилдиазенил)пиримидин-2(5H)-она. 0,5 г (2,9 ммоль) 2-(фенилдиазенил)малононитрила, 0,52 г (8,7 ммоль) мочевины и каталитические количества MeONa помещают в круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, приливают 25-30 мл пропанола-2 и нагревают в течение 4-5 часов. После реакционная смесь подкисляется раствором соляной кислоты, органическое вещество экстрагируется хлороформом, экстракт упаривается, полученное кристаллическое вещество перекристаллизовывают из петролейного эфира или гексана. Выход 0,52 г (78%), оранжевые кристаллы, т.пл. 175-178°С (гексан). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 1,52 (1Н, с, СН), 7,47-8,35 (4Н, м, аром.), 9,93 (4Н, с, NH₂). Найдено, %: С 51,67; Н 4,84; N 36,19. C₁₆H₁₄N₂O. Вычислено, %: С 52,17; Н 4,35; N 36,52.

Пример 2. Двухстадийный синтез 4,6-диамино-5-((4-нитрофенил)диазенил)пиримидин-2(5H)-она (соединение 2).

Стадия 1. Получение 2-((4-нитрофенил)диазенил)малононитрила на основе динитрила малоновой кислоты и n-нитроанилина. Синтез аналогичен вышеописанному. Для реакции берут 0,48 г (3,5 ммоль) n-нитроанилина, 1-2 мл концентрированной серной кислоты, 0,24 г (3,5 ммоль) нитрита натрия и 0,23 г (3,5 ммоль) малононитрила. Выход 0,60 г (78%), желтые кристаллы, т.пл. 197-200°С.

Стадия 2. Получение 4,6-диамино-5-((4-нитрофенил)диазенил)пиримидин-2(5H)-она. Для реакции берут 0,22 г 2-((4-нитрофенил)диазенил)малононитрила (1 ммоль), 0,18 г мочевины (3 ммоль) и получают 0,19 г вещества (кристаллы красного цвета). Выход (68%), т.пл. 118-119°С (гексан). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 1,55 (1Н, с, СН), 7,48, 8,33 (4Н, д.д, J=8,0 Гц, 4-NO₂-С₆Н₄), 9.95 (4Н, с, NH₂). Найдено, %: С 43,83; Н 3,15; N 35,43. C₁₀H₉N₇O₃. Вычислено, %: С 43,64; Н 3,30; N 35,62.

Пример 3. Двухстадийный синтез 3-(фенилдиазенил)-3H-бензо[b][1,4]диазепин-2,4-диамина (соединение 3).

Стадия 1. Аналогично описанному синтезу в примере 1, стадии 1.

Стадия 2. Для реакции берут 0,17 г 2-(фенилдиазенил)малононитрила (1 ммоль), 0,32 г 1,2-фенилендиамина (3 ммоль) и получают 0,21 г вещества (кристаллы красного цвета). Выход (75%), т.пл. 264-266°С (гексан). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 1,55 (1Н, с, СН), 7,49-7,65 (5Н, м, Ph), 8,12 (4Н, с, NH₂). Найдено, %: С 64,32; Н 5,13; N 30,55. C₁₅H₁₄N₅. Вычислено, %: С 64,73; Н 5,07; N 30,20.

Пример 4. Двухстадийный синтез 3-((4-нитрофенил)фенилдиазенил)-3H-бензо[b][1,4]диазепин-2,4-диамина (соединение 4).

Стадия 1. Аналогично описанному синтезу в примере 2, стадии 1.

Стадия 2. Для реакции берут 0,22 г 2-((4-нитрофенил)диазенил)малононитрила (1 ммоль), 0,32 г 1,2-фенилендиамина (3 ммоль) и получают 0,25 г вещества (кристаллы красного цвета). Выход (78%), т.пл. 186-188°С (гексан). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д.: 1,54 (1Н, с, СН), 7,39, 7,49 (4Н, м, Ar) 7,52, 8,32 (4Н, д.д, J=8.0 Гц, 4-NO₂-С₆Н₄), 9.95 (4Н, с, NH₂). Найдено, %: С 55,37; Н 4,15; N 30,21. C₁₆H₁₃N₃O₂. Вычислено, %: С 55,72; Н 4,05; N 30,33.

Пример 5. Лабораторные биологические испытания заявленных противоопухолевых средств.

1×10⁶ Раковых клеток карциномы Эрлиха были имплантированы подкожно в области левой лопатки женских особей мышей линии Balb/c. Через десять дней после имплантации опухоли животным 1-й группы вводили внутривенно соединение 1 в дозе 14 мг/кг, животным 2-й группы вводили внутривенно соединение 2 в дозе 16 мг/кг, животным 3-й группы вводили внутривенно соединение 3 в дозе 14 мг/кг, животным 4-й группы вводили внутривенно соединение 4 в дозе 16 мг/кг. Для сравнения, мышам из контрольной группы вводили внутривенно физиологический раствор однократно.

Процент подавления роста опухоли рассчитывался, основываясь на расчете размера опухоли в каждой группе в сопоставлении с размером опухоли в день введения исследуемых веществ и физиологического раствора в контроле. Размер опухоли определялся три раза в неделю до гибели животного. Задержка роста опухолей в 1-й группе составила 7-10 дней, во 2-й группе 10-14 дней, в 3-й группе 6-9 дней, в 4-й группе 14-20 дней. Эти данные свидетельствуют, что вещества 2 и 4 проявляют наилучший противоопухолевый эффект.

1×10⁶ Раковых клеток асцитной формы карциномы Эрлиха были имплантированы в брюшную полость женских особей SCID мышей (15 мышей на каждую группу). Через семь дней после имплантации в 1 г животных вводили внутривенно соединение 1 в дозе 14 мг/кг, животным 2ой группы вводили внутривенно соединение 2 в дозе 16 мг/кг, животным 3ей группы вводили внутривенно соединение 3 в дозе 14 мг/кг, животным 4ой группы вводили внутривенно соединение 4 в дозе 16 мг/кг. Для сравнения, мышам из контрольной группы вводили внутривенно физиологический раствор однократно. Продление времени жизни с помощью соединений 1-4 оценивалось, потому что эта модель, использующая асцитную форму карциномы Эрлиха, была моделью со смертельным исходом. Как показано в таблице 1, применение соединений 2 и 4 значительно продлевает время жизни в сравнении с 1, 3 веществами и контролем.

Таблица 1.   Контроль Соединение 1 Соединение 2 Соединение 3 Соединение 4 Дни смерти последней особи 22 25 43 27 41 Средняя продолжи-тельность жизни (дни) 17 21 32 21 34 Коэффициент выживаемости (%) при 14 днях после введения (20 дней после имплантации) 13 26 66 33 73 Коэффициент выживаемости (%) при 34 днях после введения (40 дней после имплантации) 0 0 20 0 13

Изобретение относится к новым соединениям, соответствующим общим формулам, указанным ниже, в свободном виде либо в виде фармацевтически приемлемых солей, которые обладают противоопухолевой активностью и могут быть использованы в медицинской практике как терапевтическое средство для лечения раковых заболеваний. Предлагаемые соединения позволяют уменьшить или полностью прекратить рост клеток опухолевых тканей путем нарушения клеточного деления на уровне ингибирования ферментов. Соединения настоящего изобретения соответствуют одной из структурных формул:

где Аr представляет собой Ph или 4-NO₂-С₆Н₄. 1 табл., 5 пр.

Средство терапии раковых заболеваний, представляющее собой вещество в свободном виде либо в виде фармацевтически приемлемых солей, имеющее одну из структур
или
где Аr представляет собой Ph или 4-NO₂-C₆H₄.