ВЕЩЕСТВО С ПРОТИВОВИРУСНОЙ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ 2,8-ДИТИОКСО-1H-ПИРАНО[2,3-D, 6,5-D`] ДИПИРИМИДИНА И ИХ 10-АЗА-АНАЛОГОВ Российский патент 2005 года по МПК C07D491/147 C07D471/14 A61K31/519 A61P31/00 C07D491/147 C07D239/00 C07D309/00 C07D471/14 C07D239/00 C07D211/00 

Изобретение относится к области органической химии и медицины, конкретно к синтетическим производным пиримидина -2,8-дитиоксо-1Н-пирано[2,3-(1; 6,5-d']дипиримидина и их 10-аза-аналогам, а также их комплексам и солям, обладающим противовирусной и противобактериальной активностью. Изобретение предназначено в основном для использования в медицине и ветеринарии для лечения вирусных заболеваний и заболеваний, вызываемых бактериями, а также в косметологии в качестве добавки для профилактики и лечения инфекций.

Как известно, многие производные пиримидина обладают выраженной биологической активностью и участвуют в процессах жизнедеятельности организмов [1 - Досон Р. и др. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, 544]. Большое значение имеют и синтетические производные пиримидина, из которых широкое использование в медицине приобрели замещенные барбитуровые кислоты, урацилы и др. [2 - Машковский М.Д. Лекарственные средства, 14-е изд., М., "Новая Волна", 2000]. Данные о биологической активности 5-илиденпроизводных барбитуровых кислот суммированы в обзоре [3 - Sans R.G., Chosas M.G. // Pharmazie, 1988, Bd 43, N12, S.827-829], где отмечено антиконвульсантное, антимикробное, спазмолитическое, жаропонижающее, противоопухолевое действие этих веществ. Получены данные о биологической активности некоторых 5-арилиденбарбитуровых кислот Singh А. и др. // Pharmacol. Res., 1989, Vol.21, N1, P.59-64 (Chemical Abstracts, Vol.11, 49906z); Патент Японии No 05213755, опубл. 24.08.1993 (Chemical Abstracts, 1993, Vol.119, 262520 г); Kumar А., и др. // Indian J., Chem. Sect. 1988, Vol.27, N5, P.443-447], 5-аминометиленбарбитуровых кислот [9 -.Kreutzberger А. и др. // Arch. Pharm., 1983, Bd 316, Н. 1, S.6-9], 5-арилкарбамоилбарбитуровых кислот [10, 11 - Minatelli J.A. и др. заявка Германии №3446371, опубл. 27.06.1985; Brewer A.D. Патент США №4920126, опубл. 24.04.1990]. Высокая активность обнаружена также у аннелированных производных пиримидина, например у пиразоло[3,4-d]пиримидинов, [12 -Naka Т. и др. заявка ЕПВ №. 237289 (1987)], 5-деазафлавинов [13, 14-.Kimachi Т. и др. // J. Heterocycl. Chem., 1992, Vol.29, N4, P.763-765; 5-диалкиламинометилуридинов [19 -Motawia M.S. и др. // Monatsh. Chem., 1993, Bd 124, Н. 1, S.55-64] и пиримидо[4,5-с]пиридазинов [20 - Billings B.K. и др. // J. Heterocycl. Chem., 1975, Vol.12, N6, P.1221-1224]. Перечисленные соединения обладают пестицидным, противоопухолевым, антимикробным, иммуносупрессивным, ноотропным, антигипертензионным и антиаллергическим действием.

В то же время многие группы производных пиримидина остаются практически неисследованными, с одной стороны, из-за их синтетической труднодоступности, а с другой стороны, из-за отсутствия объективных критериев, позволяющих заранее ожидать, что они проявят желаемую биологическую активность, и не будут при этом обладать высокой токсичностью и другими побочными эффектами. Поэтому, несмотря на теоретические и практические сложности, синтез новых групп производных пиримидина и изучение их биологической активности, остается актуальным направлением поиска эффективных средств лечения основных болезней человечества. В связи с этим особенно интересен синтез соединений редкой и малоисследованной группы - производных пирано[2,3-d: 6,5-d']дипиримидина. К настоящему времени известно лишь несколько единичных примеров образования пиранодипиримидиновой системы, в частности, при взаимодействии барбитуровых кислот с 3-ацилхромонами [21, 22 - Eiden F. и др. // Chemische Berichte, 1968, Bd 101, N8, S.2894-2898; [21, 22 - Eiden F. и др. // Chemische Berichte, 1968, Bd 101, N 8, S.2894-2898; Eiden F. и др..// Arch. Pharm., 1972, Bd 305, N 3, S. 187-193]. Сведения об их биологической активности отсутствуют.

Наиболее близкими к заявляемым соединениям по химическому строению и назначению являются производные 5Н-пирано[2,3-d:6,5-d']дипиримидина, обладающие антибактериальным, антивирусным и иммуномодулирующим действием [23 - Ашкинази Р.И. PCT/RU97/00371 от 19.11.1997, патент RU 2188201]. Это соединения выбраны нами в качестве прототипа. При этом вещества прототипа обладают ограниченным спектром противовирусного и антибактериального действия: они не активны против вирусов гриппа не или мало активны против ретровирусов.

Задачей изобретения является получение новых, более эффективных химических соединений с противовирусным и антибактериальным действием.

Поставленная задача решается синтезом новых веществ общей формулы А1*М:

где Х выбран из группы: О, NH, N-Alkyl;

R1 выбран из группы: Н, ОН, Cl, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, NH-Ar, N(Alkyl)₂, SH, S-Alkyl;

R2 выбран из группы: фенилнезамещенный или замещенный, нафтил, тиенил;

R3 выбран из группы: Н, Cl, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, S-дигидроксипиримидинил;

М либо отсутствует, либо выбран из группы: катион Na, К, Li, аммония, или любой другой фармакологически приемлемый катион; либо комплекс фармакологически приемлемого катиона (см. выше) с анионом одного из производных А1 (варианты R1-R3 заданы выше).

В данной серии экспериментов наилучшую активность среди заявленных веществ А1*М (где М отсутствует) проявили следующие производные:

Как видно из вышеприведенных материалов, заявляемые нами производные пирано[2,3-d: 6,5-d']дипиримидина А1*М отличаются от прототипа наличием других функциональных групп в пиримидиновых фрагментах и не могут быть получены по методам, указанным в прототипе. Необходимо отметить, что наличие высокой биологической активности у заявляемых веществ не вытекает из существующего уровня техники, так как пирано[2,3-d;6,5-d']дипиримидины и их 10-аза-аналоги являются сложной и на настоящий момент малоисследованной группой, для новых представителей которой спектр и уровень активности невозможно предсказать заранее. Заявляемые вещества являются новыми, так как они отсутствуют в известных источниках информации. Таким образом, изобретение является новым, неочевидным и обладает преимуществами перед известными на настоящий момент образцами.

Следует отметить, что изобретение распространяется не только на наиболее активные соединения (Ia, Ib, IIа, III-XII) и их комплексные соли (XIII-XV), но также и на все производные А1*М, предусмотренные формулой изобретения. Проведенные нами исследования показали, что все вещества, полученные на основе предложенного нами общего способа синтеза, обладают заявленными видами активности в той или иной степени. Это позволяет заключить, что как для процесса синтеза, так и для биологических свойств заявляемых соединений наиболее существенное значение имеют не частные особенности строения радикалов R1, R2, R3, а их принадлежность к указанным в общей формуле химическим группам.

Сущность изобретения поясняется приведенными далее сведениями:

А) Синтез и анализ заявляемых соединений:

Общий способ синтеза - два этапа.

Примеры синтеза заявленных веществ, где:

Пример 1 - вариант выполнения первого этапа - синтеза промежуточного (и одновременно целевого) продукта, а именно -4-хлор-6-гидрокси-5-арил-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (Iа).

Пример 2 - Вариант выполнения первого этапа -синтеза промежуточного (и одновременно целевого) продукта, а именно-4,6-дихлор-5-арил-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (IIа).

Пример 3 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -4-амино-6-гидрокси-5-арил-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (III).

Пример 4 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -4-хлор-6-амино-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (IV).

Пример 5 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -4,6-диамино-5-арил-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (V).

Пример 6 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -4,5-диамино-10-арил-9,10-дигидро-1Н, 8Н-1, 3, 6, 8, 9-пентаазаантрацен-2,7-дитиона (VI).

Пример 7. - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -4-(4,6-дигидроксипиримидин-2-сульфанил)-6-гидрокси-5-арил-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (X).

Пример 8 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (XI).

Пример 9 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -комплексной соли XIII, в состав которой входят соединения Ib, XII и аммиак {1b (1 моль), XII (1 моль), NH₃ (1 моль)}.

Пример 10 - Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно -комплексной соли XIV, в состав которой входят соединения III, XII и аммиак {III (1 моль), XII (1 моль), NН₃ (1 моль)}.

Физико-химические характеристики - с двумя сводными таблицами:

Таблица 1 - спектры ПМР заявляемых соединений

Таблица 2 - температуры разложения и результаты элементного анализа.

Б) Экспериментальное определение биологических свойств заявленных соединений:

Пример 11 - определение действия на вирус герпеса (с Таблицей 3).

Пример 12 - определение действия на Chlamydia trachomatis (с Таблицей 4).

Пример 13 - определение действия на вирусы гриппа А и Б (с Таблицей 5)

Пример 14 - определение активности против вируса иммунодефицита человека (с Таблицей 6).

Пример 15 - Использование заявляемых соединений совместно с препаратами, применяемыми для лечения СПИДа (с Таблицей 7).

Пример 16 - определение острой токсичности заявляемых веществ.

А. СИНТЕЗ И АНАЛИЗ ЗАЯВЛЯЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Общий способ синтеза заявленных соединений (два этапа).

Предлагаемый нами синтез включает в себя два основных этапа:

Первый этап: Синтезируют 5-арилпроизводные 4-хлор-6-гидрокси-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (Ia, b) или 4,6-дихлор-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (IIа) из соответствующих ароматических альдегидов и 2-тиобарбитуровой кислоты с последующей обработкой РОСl₃ или другими хлорирующими и водоотнимающими агентами. Полученные при этом промежуточные соединения (Ia, b IIа и их аналоги) являются одновременно и целевыми, так как обладают достаточно высоким уровнем заявляемой биологической активности.

Второй этап.Синтезируют целевые соединения (III-V, VIII-XII и их аналоги, где Х=О, R1=ОН, незамещенная или замещенная аминогруппа, R2=незамещенное или замещенное бензольное кольцо, R3 -незамещенная или замещенная аминогруппа, или алкоксигруппа, незамещенная или замещенная меркаптогруппа) из полученных на первом этапе промежуточных веществ (I и II) путем замещения одного или двух атомов хлора в трициклической 1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитионовой системе на NH₂-, алкиламино-или диалкиламиногруппу, алкоксигруппу, SH-, алкилтио-, арилтио-или гетарилтиогруппу с помощью обработки соответствующими нуклеофильными реагентами (аминами, алкоголятами или тиолятами);

- Синтезируют целевые соединения (VI, VII и их аналоги, где X=NH или N-Alkyl, R1=ОН, незамещенная или замещенная аминогруппа, R2 -незамещенное или замещенное бензольное кольцо, R3 - незамещенная или замещенная аминогруппа) из полученных на первом этапе промежуточных веществ (Ia, b и IIа) путем замещения одного или двух атомов хлора в трициклической 1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитионовой системе на NH₂ или алкиламиногруппу, с одновременным обменом пиранового атома кислорода (O10) на аминогруппу;

- Синтезируют целевые соединения (XI и его аналоги, где R2 - незамещенное или замещенное бензольное кольцо) из полученного на первом этапе промежуточного вещества (Iа) путем его восстановительного дегалогенирования;

- Синтезируют целевые соединения (комплексные соли XIII-XV) путем растворения эквимольных количеств соединений III и ХII или XI и XII, или Ib и XII в избытке аммиака и с дальнейшим подкислением раствора.

Пример 1. Вариант выполнения первого этапа - синтеза промежуточного (и одновременно целевого) продукта, а именно 4-хлор-6-гидрокси-5-фенил-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (Iа).

Растворяют 0.1 моль 2-тиобарбитуровой кислоты (XVI) в 50 мл диметилацетамида. К этому раствору при перемешивании прибавляют смесь 0.05 моль бензальдегида * и 0.05 моль основания (триэтиламина) в растворе диметилацетамида. Через несколько часов разбавляют эфиром, осадок промывают эфиром и сушат триэтиламмониевую соль XVII.

К полученной соли XVII (27 г) приливают 0.3 моль РОСl₃, 100 мл хлороформа и кипятят 3 ч. Затем растворитель отгоняют, к остатку прибавляют воду и отделяют твердое вещество, промывают его водой и сушат. Получают продукт Iа с выходом 81%.

*Примечание. 4-Хлор-6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитион (Ib) и 4-хлор-6-гидрокси-5-(4-хлорфенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитион (Iс) получают по аналогичной методике (выход 84 и 77%) при использовании п-нитробензальдегида или п-хлорбензальдегида вместо бензальдегида соответственно.

Аналогично при использовании других ароматических альдегидов получаются соответствующие 5-арилпроизводные 4-хлор-6-гидрокси-5,9-дигидро-1Н-пирано [2,3-d; 6,5-d']дипиpимидин-2,8-дитиoнa (см. общую формулу, Х=О, R1=ОН, R2=Aryl, R3=Cl, M - нет). Соответственно получены производные Id-Li (расшифровка радикалов - см. общую формулу):

n-метилбензальдегида - Id (R1=OH, R2=n-толил, R3=С1);

из n-фторбензальдегида - Ie (R1=OH, R2=C₆H₄-F(p), R3=C1);

из n-этоксибензальдегида - If(R1=OН, R2=C₆H₄-OEt(p), R3=C1);

из 3,4-диметоксибензальдегида - Ig (R1=OH, R2=C₆H₃-3,4-(OMe)2, R3=C1);

из 1-нафтальдегида- Ih (R1=OH, R2=1-Нафтил, R3=C1);

из тиофен-2-альдегида - Ii (R1=OH, R2=2-Tиeнил, R3=C1).

Мы не перечисляем все эти варианты, ограничиваясь наиболее активными представителями (Iа, Ib), приведенными в таблице 1.

Пример 2. Вариант выполнения первого этапа - синтеза промежуточного (и одновременно целевого) продукта, а именно 4,6-дихлор-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (IIа).

К 0.1 моль 2-тиобарбитуровой кислоты (XII) в 50 мл пиридина прибавляют 0.05 моль п-нитробензальдегида и нагревают смесь до полного растворения. Через несколько часов разбавляют эфиром, осадок промывают эфиром и сушат пиридиниевую соль (XVIII).

К полученной соли XVIII (26,5 г) приливают 0,5 моль POCl₃* и нагревают с обратным холодильником около 1 ч до растворения осадка. Затем избыток POCl₃ отгоняют, к остатку прибавляют воду и отделяют твердое вещество, промывают его водой и сушат. К этому веществу вновь прибавляют 0,5 моль РОСl₃ и повторяют вышеописанную процедуру. После промывки и сушки получают продукт IIа с выходом 77%.

*Примечание. По аналогичной методике, при использовании вместо РОСl₃ трифторуксусного ангидрида, получают 4,6-дигидрокси-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитион XII и его аналоги (см. общую формулу, Х=О, R1=R3=ОН, R2=Aryl, M отсутствует)

Пример 3. Вариант выполнения второго этапа -синтеза целевого продукта, а именно 4-амино-6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (III).

0.01 моль соединения Iб при перемешивании порциями растворяют в 30 мл 25%-ного аммиака *. Нерастворенное вещество отделяют, а раствор выдерживают сутки при комнатной температуре, затем разбавляют водой и подкисляют до рН 5-6. Выделившийся осадок отделяют, промывают водой, спиртом и сушат. Получают продукт III с выходом 71%.

*Примечание. По аналогичной методике, при использовании метиламина вместо аммиака, получают 4-метиламино-6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитион (VIII), выход 78% и 4-диметиламино-6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитион (IX), выход 73%. Методика, приведенная в примере 3, является общей и позволяет аналогично, исходя из других 5-арилпроизводных 4-хлор-6-гидрокси-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона, замещением атом хлора в реакции с аммиаком (или алкиламинами) на аминогруппу, получать соответствующие 5-арил-4-аминопроизводные 6-гидрокси-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (см. общую формулу, где Х=О, R1=ОН, R2=незамещенный или замещенный фенил или др. арил, R3=NH₂ или NHAlk, или NAlk₂, M отсутствует). Мы не перечисляем все эти варианты, ограничиваясь наиболее активными представителями (III, VIII, IX), приведенными в таблице 1.

Пример 4. Вариант выполнения второго этапа - синтеза целевого продукта, а именно 4-хлор-6-амино-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (IV).

К 0.01 моль соединения IIa приливают 10 мл спирта, содержащего 0.02 моль NH₄OH, и перемешивают. Смесь выдерживают сутки при комнатной температуре, затем разбавляют водой и подкисляют до рН 5-6. Выделившийся осадок отделяют, промывают водой и сушат. Получают продукт IV с выходом 54%.

Пример 5. Вариант выполнения второго этапа синтеза и получения целевого продукта, а именно 4,6-диамино-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (V).*

0.01 моль соединения IIa при перемешивании порциями растворяют в 30 мл 25%-ного аммиака. Нерастворенное вещество отделяют, а раствор выдерживают сутки при комнатной температуре, затем разбавляют водой и подкисляют до рН 5-6. Выделившийся осадок отделяют, промывают водой, спиртом и сушат. Получают продукт V с выходом 66%.

*Примечание. Методика, приведенная в примере 5, является общей и позволяет аналогично, исходя из других 5-арилпроизводных 4,6-дихлор-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона, замещать атомы хлора в реакции с аммиаком (или алкиламинами) на аминогруппы и получать соответствующие 5-арил-4,6-диаминопроизводные 5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (см. общую формулу, где Х=О, R1, R3=NH₂ или NHAlk, или NAlk₂, R2=незамещенный или замещенный фенил или др. арил, М отсутствует). Мы не перечисляем все эти варианты, ограничиваясь наиболее активными представителями (III, VIII, IX), приведенными в таблице 1.

Пример 6. Вариант выполнения второго этапа синтеза и получения целевого продукта, а именно 4,5-диамино-10-(4-нитрофенил)-9,10-дигидро-1Н, 8Н-1, 3, 6, 8, 9-пентаазаантрацен-2,7-дитиона(VI).

0.01 моль соединения IIа растворяют в 80 мл 25%-ного аммиака. Раствор фильтруют от нерастворенных частиц и нагревают сутки с обратным холодильником. Затем упаривают до 40 мл, охлаждают, выпавший осадок промывают водой, спиртом и сушат. Получают продукт VI с выходом 31%.

Примечание. По аналогичной методике, из соединения Iс (см. Пример 1) получают 4-гидрокси-5-амино-10-(4-хлорфенил)-9,10-дигидро-1Н, 8Н-1, 3, 6, 8, 9 -пентаазаантрацен-2,7-дитион(VII).

Пример 7. Вариант выполнения второго этапа -синтеза целевого продукта, а именно 4-(4,6-дигидроксипиримидин-2-сульфанил)-6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро 1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин 2,8-дитиона (X).

0.015 моль 2-тиобарбитуровой кислоты (XVI) при перемешивании растворяют в 20 мл воды, содержащей 0.03 моль NaOH. К полученному раствору приливают 20 мл диметилсульфоксида, затем добавляют раствор 0.01 моль соединения Ib в диметилсульфоксиде и перемешивают несколько часов при комнатной температуре. Раствор разбавляют водой, подкисляют до рН 5-6, выпавший осадок отделяют, промывают его водой, спиртом и сушат. Получают продукт Х с выходом 42%.

Пример 8. Вариант выполнения второго этапа -синтеза целевого продукта, а именно -6-гидрокси-5-(4-нитрофенил)-5,9-дигидро-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидин-2,8-дитиона (XI).

0.01 моль соединения Ib растворяют в 25 мл ледяной уксусной кислоты. К этому раствору в течение 0.5 ч при перемешивании прибавляют небольшими порциями 0.02 моль NaBH₄, поддерживая температуру не выше 30°С. Перемешивают еще 4 ч и выливают смесь в воду, выпавший осадок отделяют, промывают водой, спиртом и перекристаллизовывают из диметилформамида. Получают продукт XI с выходом 36%.

Пример 9 - Вариант выполнения второго этапа -синтеза целевого продукта, а именно комплексной соли XIII, в состав которой входят следующие вещества: соединение Ib (1 моль), соединение XII (1 моль) и NH₃ (1 моль).

0.01 моль соединения Ib * и 0.01 моль соединения XII растворяют при перемешивании без нагревания в 200 мл 0.5% аммиака. Нерастворившийся остаток отделяют и обрабатывают новой порцией 50 мл 0.5% аммиака. Объединенный прозрачный раствор подкисляют уксусной кислотой и выдерживают несколько часов при комнатной температуре. Выпавший осадок отделяют, промывают его водой, спиртом и сушат. Получают 6.9 г комплексной соли XIII, выход 80%.

*Примечание 1. По аналогичной методике, при использовании вместо Ib других соединений (III или XI) получают соответственно комплексные соли XIV и XV.

Пример 10 - Вариант выполнения второго этапа синтеза и получения целевого продукта, а именно комплексной соли XIV, в состав которой входят следующие вещества: III (1 моль), XII (1 моль) и NН₃ (1 моль).

К 0.01 моль пиридиниевой соли XVIII (см. Пример 2) приливают 12 мл РОСl₃ и нагревают с обратным холодильником около 40-50 мин до тех пор, пока подавляющая часть осадка не перейдет в раствор. Декантируют раствор от осадка и отгоняют 5 мл РОСl₃, выливают в лед и после гидролиза отделяют твердое вещество и промывают его водой. К полученному продукту прибавляют 40 мл воды и 10 мл конц. аммиака и перемешивают 4 часа без нагревания, при этом подавляющая часть осадка растворяется. Раствор фильтруют от нерастворенных частиц и подкисляют уксусной кислотой. Через несколько часов фильтруют выпавший осадок, промывают водой и сушат. Получают продукт XIV с выходом 71%.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗАЯВЛЯЕМЫХ ВЕЩЕСТВ

Таблица 1.
Спектры ПМР заявляемых веществ (ДМСО-d₆, δ, м.д., J, Гц)№С(5)Н 1Н,с*ArNH (ОН) уш.сNH₂ (NMe) уш.сla5.026.79 (1Н, т), 7.16 (2Н, т), 7.33 (2Н, д) J 8.011.05 (1 Н), 12.44 (1 Н), 13.55 (1 Н)-Ib5.037.54 (2Н, д) 8.02 (2Н, д), J 8.411.18(1Н),12.35(1Н),13.40(1Н)-Ic5.017.14 (2Н,д) 7.45 (2Н, д), J 8.411.11 (1Н), 12.20 (1Н), 13.35 (1Н)-IIа5.397.56 (2Н, д) 8.04 (2Н, д), J 8.312.91 (2Н)-III4.947.50 (2Н, д) 7.92 (2Н, д), J 8.311.80(2Н),12.84(1Н)11.96 (21-1)IV5.107.52 (2Н, д) 8.00 (2Н, д), J 8.012.70(2Н)12.25 (2Н)V4.997.48 (2Н, д) 7.89 (2Н, д), J 8.212.84(2Н)11.90 (41-1)VI4.547.52 (2Н, д) 8.00 (2Н, д), J 8.412.90(3Н)11.66 (41-1)VII4.667.16 (2Н,д) 7.33 (2H, д),J 8,011.15(1Н), 12.91 (2Н)12.34 (2Н)VIII4.857.52 (2Н, д) 8.04 (2Н, д), J 8.411.20(1Н), 12.45(3Н)3.59 (3Н, с)IX4.95+5.197.65 (2Н, д), 7.86 (4Н, м), 8.07 (2Н, д), J 8.011.10(2Н), 12.85 (3Н)-Х4.92с5.28 (1Н, с), 7.56 (2Н, д) 8.04 (2Н, Д), J 8.111.23(1Н), 12.35 (4Н)-XI5.027.55 (2Н, д) 7.97 (2Н, д), 8.31 (1Н, с)11.14(1Н), 12.80 (2Н)-XII4.757.65(2Н, д)8.11 (2Н, д),и8.012.55 (2Н), 13.9 (2Н, уш)-XIII4.80 уш7.55 (4Н, уш) 8.10 (4Н, уш)9.11 (1Н уш), 11.05 (2Н, уш); 12.457.25 (4Н уш) 5.25 уш (2Н, уш) XIV4.95 уш7.53 (4Н, уш) 8.12 (4Н, уш)10.00-13.50 (5Н, уш)7.24 (4Н уш) 5.13 уш   XV4.95 уш7.50 (4Н, уш) 8.07 (4Н, уш); 8.35 (1Н, уш)9.70-13.40 (5Н, уш)7.25 (4Н уш) 5.13 уш   *с - синглет, уш. с.- уширенный синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет

Таблица 2.
Температуры разложения и данные элементного анализа заявляемых веществIa23047.902.479.3314.5517.19C₁₅H₉ClN₄O₂S₂47.812.419.4114.8717.02Ib23042.561.988.2316.3215.14C₁₅H₈ClN₅O₄S₂42.711.918.4016.6015.20Ic24543.651.9917.0813.4615.43C₁₅H₈ClN₄O₂S₂43.811.9617.2413.6215.59Id24043.651.9917.0813.4615.43C₁₆H₁₁ClN₄O₂S₂49.172.849.0714.3316.41Ie24545.631.9917.0813.4615.43C₁₆H₈ClFN₄O₂S₂45.632.048.9814.1916.24If23543.651.9917.0813.4615.43C₁₇H₁₃ClN₄O₃S₂48.513.118.4213.3115.24Ig23543.651.9917.0813.4615.43C₁₇H₁₃ClN₄O₄S₂46.743.008.1112.8214.68Ih23043.651.9917.0813.4615.43C₁₉H₁₁ClN₄O₂S₂53.462.608.3013.1215.02Ii23043.651.9917.0813.4615.43C_l3H₇ClN₄O₂S₃40.781.849.268.3625.12IIa24040.711.5515.9215.8814.34C₁₅H₇Cl₂N₅O₃S₂40.921.6016.1015.9114.56III29044.492.56-20.7315.67С₁₅Н₁₀N₆O₄S₂44.772.50-20.8815.94IV22043.312.248.3019.6415.04С₁₅Н₉СlN₆O₃S₂42.812.168.4219.9715.24V30044.992.90-24.4815.56C₁₅H₁₁N₇O₃S₂44.882.76-24.4215.97VI30045.233.14-27.9015.89C₁₅H₁₂N₈O₂S₂44.993.02-27.9816.01VII30045.672.688.9417.7516.22C₁₅H₁₀ClN₅O₂S₂45.982.579.0517.8716.37VIII30046.022.95-20.0315.24C₁₆H₁₂N₆O₄S₂46.152.90-20.1815.40IX26547.903.41-19.4314.69C_l7H₁₄N₆O₄S₂47.433.28-19,5214.90X26042.872.16-18.3317.95С₁₉Н₁₁N₇O₆S₃43.102.09-18.5218,17XI29046.132.51-17.7716.29C₁₅H₉N₅O₄S₂46.512.34-18.0816.55XII30044.282.49-17.0415.61C₁₅H₉N₅O₅S₂44.662.25-17.3615.90XIII23042.222.874.0418.0114.87C₃₀H₂₂ClN₁₁O₉S₄42.682.634.2018.2515.19XIV23043.143.16-20.1515.33С₃₀Н₂₄N₁₂O₉S₄43.682.93-20.3815.55XV23044.362.99-18.9315.68С₃₀Н₂₃N₁₁O₉S₄44.492.86-19.0315.84

Б. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЗАЯВЛЯЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ.

Пример 11. Определение действия на вирус простого герпеса.

Антивирусную активность изучали по отношению к вирусу герпеса I типа (ВПГ - I/ Ленинград/248/88) по общепринятому методу [24 - Gentry G.A. и др. J. of Clinical Microbiology, 1985, 22, 2, P.I 99-204]. Вирусы выращивали на перевиваемой культуре клеток Vero, полученной из банка клеточных культур Института цитологии Российской Академии Наук.

Таблица 3.
Действие заявляемых соединений на вирус простого герпеса.NNСоединение100*Число клеток 50:10*1Ацикловир**-9600***(80%)****2DMCO1000010000100003Контроль клеток1000010000100004la10800(90%)9600(80%)7200(60%)5lib12000(100%)10800(90%)8400(70%)6III12000(100%)9600(80%)8400(70%)7IV9600(80%)8400(70%)6000(50%)8V10800(90%)9600(80%)7200(60%)9VI12000(100%)10800(90%)8400(70%)10VII8400(70%)6000(50%)4000(30%)11VII9600(80%)8400(70%)6000(50%)12IX9600(80%)8400(70%)6000(50%)13X10800 (90%)9600 (80%)7200 (60%)14XI9600 (80%)8400 (70%)6000 (50%)15XII6000 (50%)3600 (30%)1200(10%)16XIV9600 (80%)8400 (70%)6000 (50%)* Концентрация заявляемых соединений (мг/л)
** - препарат в данной концентрации не исследовали.
*** - число клеток в 100 полях зрения,
**** процент защиты клеток от инфекции

Полученные результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что заявляемые соединения обладают активностью против вируса герпеса.

Пример 12. Определение действия на Chlamydia trachomatis

Антимикробную активность заявляемых соединений изучали по отношению к С.trachomatis D323 -стандартному штамму из коллекции кафедры микробиологии Санкт-Петербургского Государственного Медицинского университета им. ак. И.П.Павлова. Данный штамм, выделенный от больного с хламидийным уретритом, имеет морфологию и физиологическую активность характерную для представителей данного вида, чувствителен к действию препаратов, используемых для лечения хламидийной инфекции.

Эффективность действия препаратов оценивали по защите клеток МсСоу и L929, при инфицировании хламидиями в концентрации 1·10⁶ кл/мл [25, 26 - Judson В.А. и др. J. of Clinical Microbiology, 1988, vol.26, N12, р.2657-2658; Fenelon L.E. и др. J, of Antiimcrobial Chemotherapy, 1990, 26, р.763-767]. Оценку результатов проводили путем выявления хламидийных цитоплазматических включений методом иммунофлюоресценции (MicroTrac Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test) и хламидийных антигенов методом CylaMonoScreen (Russian-British Joint Venture 66 Regent's Pare Road London NW1 7SX) [26 - Fenelon L.E. и др. J. of Antimicrobial Chemotherapy, 1990, 26, р.763-767].

Эффект действия препарата определяли, анализируя состояние монослоя и число клеток с ЦПВ по сравнению с контролем (культура клеток, зараженная C.trachomatis D323), при этом учитывали число неизмененных клеток в 100 полях зрения, полученных при использовании специальной сетки окуляра микроскопа.

Таблица 4.
Действие заявляемых соединений на C.trachomatis.NNСоединениеПроцент защиты клеток от хламидий, %  100*30*1.Ib80602.Iia90703.III100704.IV80505V80506VI80507VII90508VIII90709IX805010X1006011XI905012XII604013.XIII8060* Концентрация заявляемых соединений (мг/л)

Полученные данные свидетельствуют, что исследованные заявляемые соединения могут быть применены для лечения заболеваний, вызванных хламидиями.

Пример 13. Активность против вирусов гриппа.

Определение противовирусной активности соединений в отношении вируса гриппа проводили на модели хорион аллантоисной оболочки (ХАО).

Соединения в исследуемых концентрациях растворяли в среде для ХАО и вносили в лунки панелей с фрагментами ХАО, куда затем добавляли вирус, и инкубировали при температуре 33-34°С в течение 48 (для гриппа типа А) и 72 (для гриппа типа В) часов. Вирусингибирующее действие исследуемых соединений оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) при добавлении 1% куриных эритроцитов в культуральную жидкость.

Эффективность соединений оценивали по снижению инфекционной активности вируса в опыте по сравнению с контролем - индекс нейтрализации (ИН). При значении ИН до 1,0 препарат считали неактивным, при ИН от 1,0 до 2,0, при ИН выше 2,0 - активным.

Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Мэнча.

Таблица 5.
Активность заявляемых препаратов против вирусов гриппа.СоединениеИндекс нейтрализацииВирус гриппа АВирус гриппа ВIв0.50,5Iia1,51,5III0.51,0IV2,01,5V1,01,5VI201,5VII2,01,5VIII2,01,5IX2,01,5X1,51,0XI1,51,5

Таким образом, заявляемые соединения обладают активностью против вирусов гриппа А и В.

Пример 14. Активность против вируса иммунодефицита человека. Активность по отношению к вирусу иммунодефицита человека определяли по защите Т лимфобластоидных клеток МТ4 при инфицировании вируссодержащей жидкостью культуры HTHIV27. Клетки, инфицированные вирусом, анализировали методами 1) непрямой иммунофлюоресценции (ИФА) с поликлональной пулированной антисывороткой от ВИЧ-инфицированных и больных СПИД (титр антител в ИФА равен 1:1000000). В тестах использовали разведение 1:40. 2) В конкурентном ИФА с моноклональными антителами (МоnАb) к р24 ВИЧ и поликлональной подложкой. В качестве контроля использован азидотимидин (AZT) (Sigma).

Таблица 6.
Анти-ВИЧ активность заявленных соединений.ВеществоКонцентрацияУровень угнетения репродукции вируса (в %)1Ь100 мг/л10050 мг/л905 мг/л70III100 мг/л10050 мг/л905 мг/л70V100 мг/л10050 мг/л1005 мг/л90XIV100 мг/л10050 мг/л1005 мг/л100XV100 мг/л10050 мг/л1005 мг/л90Контроль (AZT)100 мг/л10050 мг/л1005 мг/л100

Таким образом, испытанные образцы угнетают репродукцию вируса иммунодефицита 1.

Пример 15. Использование заявляемых соединений совместно с препаратами, применяемыми для лечения СПИДа.

Совместное действие оценивали по защите клеток при одновременном добавлении испытуемых веществ и азидотимидина. Активность определяли по защите Т лимфобластоидных клеток МТ4 при инфицировании вируссодержащей жидкостью культуры HTHIV27. Клетки, инфицированные вирусом, анализировали методами 1) непрямой иммунофлюоресценции (ИФА) с поликлональной пулированной антисывороткой от ВИЧ-инфицированных и больных СПИД (титр антител

в ИФА равен 1:1000000). В тестах использовали разведение 1:40. 2) В конкурентном ИФА с моноклональными антителами (МоnАb) к р24 ВИЧ и поликлональной подложкой.

Таблица 7.
Угнетение репродукции вируса иммунодефицитаВеществоКонцентрация, мг/лУровень угнетения репродукции вируса (в %)1b5.0700,520AZT5.01000,0550Ib+AZT0,5+0,05100XIV51000.560Ib+AZT0,5+0,05100

Полученные результаты показывают, что заявляемые соединения могут быть использованы совместно со стандартным препаратом - азидотимидином, применяемым для лечения СПИДа.

Пример 16. Определение острой токсичности заявляемых соединений Испытуемые соединения вводили через рот с помощью желудочного зонда (1000 мг/кг) или внутрибрюшинно (200 мг/кг) белым нелинейным мышам массой 20-25 г (по 5 самцов и 5 самок в каждой из испытуемых групп), после чего наблюдали за их состоянием на протяжении 14 дней. Отсутствие симптоматики, свойственной токсическим эффектам, и отсутствие гибели животных в течение указанного времени позволяет сделать вывод, что в пределах исследованных доз вещества не проявляют острой токсичности в использованной модели.

Промышленная применимость

Примеры 1-8 практического синтеза и химико-физический анализ заявляемых соединений, приведенный в таблицах 1 и 2, подтверждают возможность лабораторного и промышленного синтеза всех заявляемых соединений средствами, освоенными современной фармацевтической промышленностью, а также их четкую идентификацию общепринятыми методами контроля.

Серия приведенных экспериментов по определению биологических свойств показала, что заявляемые соединения обладают биологической активностью по отношению к различным микроорганизмам и прежде всего вирусам иммунодефицита, герпеса, гриппа А и В), что указывает на возможность их использования при лечении различных вирусных инфекций, вызванных ДНК содержащими вирусами (вирус простого герпеса) и РНК содержащими (вирусы гриппа и иммунодефицита), а также и некоторых бактериальных заболеваний, вызванных хламидиями. На основе полученных веществ могут быть созданы фармацевтически приемлемые композиции и модификации с совместимыми лекарственными препаратами, а также системами доставки лекарств, обеспечивающими максимальную системную циркуляцию действующего компонента в плазме крови. Основной путь введения - внутривенный. Однако могут быть использованы другие методы введения, обеспечивающие поступление действующего компонента в системную циркуляцию - подкожный, внутримышечный, ингаляционный, внутрибрюшинный и др. Дозы и режимы введения при этом определяются природой используемого активного ингредиента, зависят от пути введения.

Полученные результаты свидетельствуют о достижении задач, поставленных изобретением - синтезированы производные 2,8-дитиоксо-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидина и их 10-аза-аналоги. Для синтеза заявляемых соединений использованы новые технологии, описанные в заявке. Таким образом, по нашему мнению, заявляемые средства (новые вещества) удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к изобретению: они новы, неочевидны и промышленно применимы.

Изобретение относится к новому веществу, обладающему антивирусной и антибактериальной активностью на основе производных 2,8-дитиоксо-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидина и их 10-аза-аналогов, отличающееся тем, что включает производное указанной группы общей формулы А1 * М:

где Х выбран из группы: О, NH, N-Alkyl;

R1 выбран из группы: Н, ОН, Cl, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, NH-Ar, N(Alkyl)₂, SH, S-Alkyl;

R2 выбран из группы: фенилнезамещенный или замещенный, нафтил,тиенил;

R3 выбран из группы: Н, Cl, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, S-

дигидроксипиримидинил;

М либо отсутствует, либо выбран из группы: катион Na, К, Li,

аммония, или любой другой фармакологически приемлемый катион; либо комплекс фармакологически приемлемого катиона (см. выше) с анионом одного из производных А1 (варианты R1-R3 заданы выше).

Технический результат - получение новых соединений, обладающих противовирусной и антибактериальной активностью. 1 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Вещество, обладающее антивирусной и антибактериальной активностью на основе производных 2,8-дитиоксо-1Н-пирано[2,3-d; 6,5-d']дипиримидина и их 10-аза-аналогов, отличающееся тем, что включает 5 производное указанной группы общей формулы А1 ^*М:

где Х выбран из группы: О, NH, N-Alkyl;

R1 выбран из группы: Н, ОН, Cl, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, NH-Ar. N(Alkyl)₂, SH, S-Alkyl, S-Ar, S-Hetaryl;

R2 выбран из группы: C₆H₅, Aryl;

R3 выбран из группы: Н, Cl, O-Alkyl, NH₂, NH-Alkyl, NH-Ar, S-Hetaryl;

М либо отсутствует, либо выбран из группы: катион Na, К, Li, аммония, или любой другой фармакологически приемлемый катион; либо комплекс фармакологически приемлемого катиона (см. выше) с анионом одного из производных А1 (варианты R1-R3 заданы выше).