ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2017 года по МПК A61K31/205 A61P35/00 A61P35/04 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса алканоламмониевых солей ароксиуксусных кислот - 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезан) формулы:

[СН₃N(СН₂СН₂ОН)₂Н]⁺⋅^-ООССН₂ОС₆Н₄-СН₃-2

и может быть использовано в медицине и фармакологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

Несмотря на существование в клинической практике более 60-ти противоопухолевых препаратов эффективность большинства их них недостаточна и спектр онкологических заболеваний, чувствительных к химиотерапии, ограничен. Среди наиболее доступных и применяемых в настоящее время цитостатиков известны такие препараты, как цисплатин и 5-фторурацил, которые используются отдельно или в комплексной терапии рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака печени (гепатомы), меланомы и др. (Противоопухолевая химиотерапия. Справочник / Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1996; Safit J.T., Bonavida В. // Cancer Res., 1992, V. 52, P. 630; Михайлов И.Б. / Настольная книга врача по клинической фармакологии - руководство для врачей. СПб, 2001, С. 615).

Как и большинство препаратов, используемых для лечения злокачественных заболеваний, цисплатин и 5-фторурацил обладают высокой токсичностью - при их применении, как правило, наблюдаются тошнота, рвота, выраженные нарушения функций почек, нарушения функций нервной системы, угнетение кроветворения и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М, 2001, С. 425-428).

Разработка новых, более активных в отношении злокачественных новообразований лекарственных средств, эффективных при опухолях с первичной или приобретенной резистентностью к известным противораковым препаратам, является актуальным направлением научных исследований в области современной фармакологии и онкологии.

Целью изобретения является создание синтетического средства, обладающего высокой противоопухолевой и антиметастатической активностью.

Для достижения цели предлагается использовать новое соединение из класса алканоламмониевых солей ароксиуксусных кислот - 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезан) формулы:

[CH₃N(CH₂CH₂OH)₂H]⁺⋅^-ООССН₂ОС₆Н₄-СН₃-2.

Наиболее близким техническим решением, которое выбрано в качестве прототипа для предлагаемого изобретения, является лекарственный препарат Трекрезан (Крезацин), 2-метилфеноксиацетат трис-(2-гидроксиэтил)аммония формулы

[N(CH₂CH₂OH)₃H]⁺⋅^-ООССН₂ОС₆Н₄-СН₃-2.

Он разрешен к применению МЗ РФ в качестве адаптогена широкого спектра действия, близкий по действию к природным адаптогенам - женьшеню, аралии, золотому корню, элеутерококку (Государственный реестр лекарственных средств, Регистрационный номер ЛСР-008909/09; Регистр лекарственных средств: России, Информхим, Москва, 1995, 487 с).

Трекрезан также проявляет высокую эффективность как модулятор гемо- и иммунопоэза (Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Сухенко Т.Г., Лимонов В.Л., Козлов В.А., Мирскова А.Н., Воронков М.Г. Трекрезан как модулятор гемо- и иммунопоэза // Докл. РАН, 2003, Т. 391, №3, С. 410-412).

Трекрезан используется в комплексной терапии различных заболеваний, в том числе онкологических, как иммуномодулятор для нормализации состава крови, восстановления физической активности и пищеварительных функций (Воронков М.Г., Колесникова О.П., Расулов М.М., Мирскова А.Н. Фармакологические свойства и клинические эффекты трекрезана // Хим.-фарм. журнал, 2007, Т. 4, №5, С. 13-17).

Исследованиями не установлено наличие у Трекрезана прямого ингибирующего действия на опухолевый рост.

Сущность изобретения заключается в том, что была изучена противоопухолевая активность Бикрезана in vitro на клетках опухолевых линий (меланома В16 и гепатома Г27), а также влияние соединения in vivo на линиях мышей, которым перевивали клетки опухолей меланомы В16 и гепатомы Г27, на процесс метастазирования клеток в легкие. В качестве контрольных препаратов для проверки противоопухолевой активности соединения использовались цисплатин и 5-фторурацил.

В результате проведенных исследований установлено, что Бикрезан проявляет выраженные противоопухолевые свойства (in vitro и in vivo).

В работе использовали клеточные опухолевые линии (меланомы В16, гепатомы Г27) и здоровых половозрелых животных - мыши С57В 1/6 и СВА обоего пола, 8-10-недельного возраста, массой тела 18-20 г (разброс в группах животных по исходной массе тела не превышал ±10%). Контрольные и опытные животные одного возраста были получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей в одной клетке) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром).

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими примерами:

Пример 1

Синтез 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезан):

К спиртовому (метанол, этанол, изопропанол) раствору 2-метилфеноксиуксусной кислоты (2-СН₃-С₆Н₄ОСН₂СООН) 16.62 г (0.1 моль) при перемешивании прикапывали спиртовый раствор 11.92 г (0.1 моль) метилдиэтаноламина СН₃N(СН₂СН₂ОН)₂. Нагревали до кипения 1 час. Реакционную смесь охлаждали до 5°С. Выпавший осадок отфильтровывали, многократно промывали эфиром и высушивали в вакууме. Выход 27.07 (95%). Порошок розового цвета с т.пл. 45-47°С, хорошо растворимый в воде, спиртах, ацетоне и нерастворимый в эфире, гексане, гептане.

Спектр ЯМР ¹Н (метанол-D4, δ, м.д.): 7.10-6.72 (м, 4Н, С₆Н₄), 4.43 (с, 2Н, СН₂СОО), 3.87 (т, 4Н, ОСН₂), 3.27 (т, 4Н, NCH₂), 2.89 (NCH₃), 2.25 (с, 3Н, СН₃).

Спектр ЯМР ¹³С (метанол-D4, δ, м.д.): 175.20 (С=О), 155.62 (С₆Н₄O), 129.77-112.07 (С₆Н₄), 67.37(СН₂СОО), 57.59 (ОСН₂), 55.38 (NCH₂), 40.12 (NCH₃), 15.14 (СН₃).

Спектр ЯМР ¹⁵N (метанол-D4, δ, м.д., отн. CH₃NO₂): - 338.10.

ИК-спектр, v/см^-1: 1609 (С=О), 2486-2870 (N⁺H), 3275 (ОН).

Найдено (%): С, 59.15; Н, 8.00; N, 4.90. C₁₄H₂₃NO₅. Вычислено (%): С, 58.93; Н, 8.12; N, 4.90.

Пример 2. Оценка противоопухолевых свойств in vitro (табл. 1)

Оценка противоопухолевых свойств Бикрезана проводилась ³Н тимидиновым методом на клетках меланомы В16 и гепатомы Г27. Клетки засевали в концентрации 10×10³/лунку, инкубировали с соединением в течение 24 часов, за 6 часов до конца инкубации вносили 1 мкКи Н³-тимидина. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ('Titertek'). Результаты выражали в имп./мин включенного тимидина на 10×10³ клеток (средние данные по триплету). Степень подавления роста опухолевых клеток под влиянием тестируемых соединений вычисляли по формуле: N=(опыт/контроль)×100%. В таблице 1 представлены данные по ингибиции пролиферативной активности опухолевых клеток под действием тестируемых соединений относительно контрольных значений пролиферативной активности этих клеток.

Бикрезан испытывался в дозах 5, 25, 50 мкг/мл. В качестве контрольных противоопухолевых препаратов использовали 5-фторурацил в дозе 5, 25 и 50 мкг/мл.

В таблице 1 представлены данные по цитотоксическому (ингибирующему) эффекту Бикрезана in vitro на опухолевые клетки различного генеза.

Как видно из представленных в табл.1 данных, Бикрезан проявляет выраженные дозозависимые противоопухолевые свойства в системе in vitro, причем его противоопухолевый (ингибирующий рост раковых клеток) эффект значительно превышает аналогичный эффект известного препарата 5-фторурацила в сравнимых дозах.

Пример 3. Влияние Бикрезана на метастазирование клеток гепатомы Г27 in vivo. (табл. 2)

Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки гепатомы Г27 в дозе 100×10³/мл. Учет метастазов в легких проводили на 14 день после перевивки опухоли. Бикрезан в дозе 2, 20, 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно ежедневно 5 дней подряд (начиная с первого дня после перевивки гепатомы). В контроле и опыте использовали по 15 мышей. В качестве контрольного противоопухолевого препарата использовали цисплатин в дозе 5 мг/кг.

Как видно из данных таблицы 2, введение Бикрезана от момента введения клеток опухоли вызывает дозозависимый антиметастатический эффект, а доза 200 мг/кг приводит к достоверному уменьшению количества метастазов в легких на 58%.

Для сравнения: торможение роста опухоли гепатомы Г27 in vivo при введении цисплатина (в дозе 5 мг/кг) составляет 23.5%.

Пример 4. Влияние Бикрезана на метастазирование клеток меланомы В16 in vivo (табл. 3)

Мышам линии СВА внутривенно вводили клетки меланомы В16 в дозе 100×10³/мл. Бикрезан в дозе 200 мг/кг вводили внутрибрюшинно ежедневно от момента введения клеток опухоли с продолжением введения соединения 5 дней подряд (начиная с первого дня после перевивки меланомы). Учет метастазов в легких проводили на 14 день после перевивки опухоли. В качестве контрольного противоопухолевого препарата использовали цисплатин в дозе 5 мг/кг. В контроле и опыте использовали по 15 мышей.

В последующих опытах соединение в меньших дозах вводили за 5 дней до перевивки опухоли и продолжали вводить после перевивки клеток опухоли В16 в течение 5 дней (табл. 4).

Для сравнения: уменьшение количества метастазов меланомы В16 в легкие in vivo при введении цисплатина (в дозе 5 мг/кг) составляет 49.4%.

Как видно из данных таблиц 2 и 4, антиметастатический эффект нетоксичного Бикрезана in vivo на меланоме В16 (-81-93%) и на гепатоме Г27 (-58%) превышает эффект используемого в медицине лекарственного препарата цисплатина. Противоопухолевый эффект Бикрезана in vivo более выражен на меланоме, чем на гепатоме.

При определение острой токсичности Бикрезана на мышах установлено, что LD₅₀=2500 мг/кг. Это позволяет отнести Бикрезан к IV классу опасности, к безопасному веществу как потенциальному лекарственному средству. Патологических изменений, связанных с токсическим действием препарата, не выявлено.

Таким образом, проведенные нами исследования позволяют констатировать наличие у Бикрезана в системах in vitro и эксперименте на животных выраженной противоопухолевой и антиметастатической активности в сочетании с отсутствием токсических свойств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Противоопухолевая химиотерапия. Справочник / Под ред. Н.И. Переводчиковой. М., 1996.

2. Safit J.T., Bonavida В. // Cancer Res., 1992, V. 52, P. 630.

3. Михайлов И.Б. / Настольная книга врача по клинической фармакологии - руководство для врачей. СПб, 2001, С. 615.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2001, С. 425-428.

5. Государственный реестр лекарственных средств, Регистрационный номер ЛСР-008909/09.

6. Регистр лекарственных средств: России, Информхим, Москва, 1995, 487 с.

7. Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Сухенко Т.Г., Лимонов В.Л., Козлов В.А., Мирскова А.Н., Воронков М.Г. Трекрезан как модулятор гемо- и иммунопоэза // Докл. РАН, 2003, Т. 391, №3, С. 410-412.

8. Воронков М.Г., Колесникова О.П., Расулов М.М., Мирскова А.Н. Фармакологические свойства и клинические эффекты трекрезана // Хим.-фарм. журнал, 2007, Т. 4, №5, С. 13-17.

Изобретение относится к биологии, медицине и фармакологии. Предложено: применение 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезана) формулы [СН₃N(СН₂СН₂OН)₂Н]⁺⋅^-ООССН₂ОС₆Н₄-СН₃-2 в качестве противоопухолевого и антиметастатического средства. Технический результат: противоопухолевый эффект Бикрезана показан in vivo на примере меланомы и гепатомы; антиметастатический эффект Бикрезана превышает эффект цисплатина, при этом Бикрезан безопасен – у него отсутствуют токсические свойства. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения, превышая терапевтический эффект других противораковых препаратов. 4 табл., 4 пр.

Применение 2-метилфеноксиацетата N-метил-бис-(2-гидроксиэтил)аммония (Бикрезана) в качестве противоопухолевого и антиметастатического средства.