НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК АДЕНОВИРУСА СЕРОТИПОВ 3,4,7,14,21 МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК C07H21/04 C12P19/30 C12Q1/68 C12N7/00 

Изобретение относится к наборам для выявления генетического материала (ДНК) аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 в клинических образцах и секционных пробах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств аденовируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.

Аденовирусы человека - это ДНК-содержащие вирусы, принадлежащие семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus [International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), доступно по ссылке: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009&bhcp=1]. В настоящее время выделяют 7 подгрупп (А-G) аденовируса человека, которые в свою очередь включают в себя 51 серотип. Манифестные формы заболевания вызывают главным образом эпидемические серотипы (3, 4, 7, 14, 21) подгрупп В и Е.

Так как аденовирус проявляет выраженную эпителиотропность и токсичность, он в первую очередь поражает эпителий респираторного тракта, кишечника, конъюнктивы, а также лимфоидную ткань, вызывая целый ряд заболеваний человека.

Аденовирус способен вызывает широкий спектр заболеваний человека с самыми разнообразными клиническими проявлениями, а также учитывая возможность применения в ближайшем будущем вирусспецифических препаратов разработка эффективных методов диагностики аденовирусов становится актуальной задачей.

В настоящее время в Российской Федерации разработано несколько наборов для детекции ДНК аденовирусов методом ПЦР. Находящиеся в них праймеры можно рассматривать в качестве прототипов:

1. «АмплиСенс Adenovirus-EPh» (ИнтерЛабСервис) - набор реагентов для амплификации ДНК аденовирусов из клинического материала методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле;

2. «Аденовирус» (ЗАО «БиоХимМак») - ПЦР-тест-система для амплификации ДНК аденовируса с последующей детекцией методом электрофореза.

Однако в сравнении с заявляемым к патентованию набором перечисленные выше разработки имеют ряд существенных недостатков, к самым существенным из которых следует отнести то, что наборы «АмплиСенс Adenovirus-EPh» (ИнтерЛабСервис) и «Аденовирус» (ЗАО «БиоХимМак») предназначены для выявления ДНК аденовируса методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

В качестве аналога также можно рассматривать праймеры и зонд из ПЦР-тест-системы «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» (ИнтерЛабСервис), которая представляет собой набор реагентов для идентификации возбудителей ОРВИ человека, в том числе ДНК аденовирусов групп B, C и E методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.

Однако в связи с видовой вариабельностью генома аденовируса можно предполагать значительную вырожденность используемых в наборе праймеров и зонда, что, несомненно, сказывается на чувствительности и специфичности набора.

Известен патент Японии японских исследователей (JP2004305092, МПК C12Q1/68, опубл. 04.11.2004 г.) для выявления ДНК аденовируса методом количественной ПЦР.

Наиболее близким аналогом (прототипом) являются олигонуклеотиды, праймеры и зонды, предназначенные для осуществления способа детекции и количественного определения нуклеиновых кислот аденовируса (патент РФ №2272845, МПК С121/68, опубл. 27.03.2006 г. ). Заявлены олигонуклеотиды для осуществления способа детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот аденовирусов в биологическом образце, имеющий следующую идентифицированную последовательность №1: 5'-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3', в которой Y означает С или Т и М означает А или С, или последовательность, комплементарную указанной последовательности. Последовательность №2: 5'-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3', в которой S означает G или С и В означает С, G или Т, или последовательность, комплементарную указанной последовательности. Последовательность №3: 5'-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3', в которой S означает G или С и В означает С, G или Т, или последовательность, комплементарную указанной последовательности. Праймеры НЕХ1 и НЕХ2 для осуществления способа детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот аденовирусов в биологическом образце, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере два олигонуклеотида по меньшей мере из 10 последовательных нуклеотидов нижеследующей идентифицированной последовательности №1 или последовательности, обладающей гомологией последовательности по меньшей мере на 80% с вышеуказанной последовательностью 5'-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3', в которой Y означает С или Т и М означает А или С. Зонд HEX включает олигонуклеотид для осуществления способа детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот аденовирусов в биологическом образце, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов нижеследующей идентифицированной последовательности №3 или последовательности, обладающей гомологией последовательности по меньшей мере на 80% с вышеуказанной последовательностью 5'-САС CAG ССА САС CGC GGC GTC АТС GA-3'.

Однако вышеуказанные патенты-аналоги, в том числе и прототип, разработаны в начале 2000-х годов. За последние десять лет были выделены и секвенированы новые последовательности геномов аденовируса человека. В связи с выше изложенным аналоги и прототип не обладают достаточной гомологией к циркулирующим в настоящее время аденовирусам, что в свою очередь снижает чувствительность набора диагностических праймеров и зондов.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21, который обладал бы более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время аденовирусам, что повышает чувствительность заявляемого набора .

Указанный технический результат достигается тем, что набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда для идентификации ДНК аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14 21 методом гибридизационно-флуоресцентно полимеразной цепной реакции включает олигодезоксирибонуклеотиды, обладающие специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно меченный зонд, имеющие следующую структуру:

внешний праймер 5'→3'

5'-AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT-3'

внутренние праймеры 5'→3'

5'-CCCWTCGATGMTGCCCC-3'

5'-TCMACGGGYACRAAGCGCA-3'

зонд 5'→3'

ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2

Таким образом, рассчитанные и представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд обладают минимальной вырожденностью, а созданный на их основе набор обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Праймеры и зонд позволяют проводить ПЦР в два раунда, что также увеличивает чувствительность ПЦР-анализа. Кроме того, с помощью олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда можно проводить исследование клинического материала методом «полувложенной» ПЦР. Наличие одного «внешнего» праймера позволяет кроме этого сократить стоимость проведения одного анализа. Представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд позволяют выявить в образце ДНК аденовирусов серотипов 3, 4, 7, 14, 21 в режиме реального времени, амплифицировать фрагмент ДНК аденовируса, который может быть использован для секвенирования и определения генетических свойств аденовируса, а также для проведения молекулярно-биологических работ.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами: на фиг. 1 приведен результат ПЦР-анализа в режиме реального времени, полученный с использованием зашифрованной вирусной панели, содержащей аденовирусы человека. В образце № 5 (AdV 7) обнаружен аденовирус 7-го серотипа (канал ROX(585/610 нм). На фиг.2 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР в 2% агарозном геле. На фиг.3 приведены выравненные последовательности гена гексона аденовирусов человека серотипов 3, 4, 7, 14 и 21.

Расчет и конструирование набора диагностических праймеров и флуоресцентно меченного зонда на консервативную область гена гексона аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21

Используемые для расчета праймеров и зонда последовательности геномов аденовируса были получены из международной базы данных GenBank. Для построения элайнментов, анализа и расчетов праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 9.0.0 (Informax, США) и онлайн интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI).

В таблице 1 приведен заявляемый набор праймеров и зонда для детекции аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21.

Таблица 1. Праймеры и зонд для детекции аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21

Позиция в геноме аденовируса^* Структура олигонуклеотидной последовательности праймеров и зонда Т отжига (°С) Размер ампликона 18426-18442 CCCWTCGATGMTGCCCC 53.2 206 п.о. 18472-18449 ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2 58.9 18614-18632 TCMACGGGYACRAAGCGCA 51.8 19377-19354 AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT 52.9 951 п.о.

Примечание. (*) - референс-последовательность базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI) - Human adenovirus 3 type, complete genome (DQ086466.1).

В ходе работы было проанализировано 1393 нуклеотидные последовательности генома аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21, инфицирование которыми наиболее часто приводит к респираторным заболеваниям человека [American cademy of Pediatrics, 2003; Metzgar, 2005; Rubin, 1993; Ryan, 2002; Washington, 2010].

Праймеры и зонд для детекции аденовируса были подобраны внутри гена, кодирующего белок гексона (hexon gene). Заявляемый набор праймеров и флуоресцентных зондов был получен при выравнивании как полных, так и фрагментов геномов всех доступных в международной базе данных аденовирусов

серотипов 3, 4, 7, 14 и 21 (фиг.3). Выравненные последовательности обладают гомологичными участками для всех 5 серотипов вируса, что позволяет рассчитать диагностические олигонуклеотиды для этой группы вирусов в этом регионе генома.

Проведенный глубокий анализ полученных выравненных последовательностей показал, что в гене белка гексона (hexon gene) присутствуют участки с единичными нуклеотидными заменами. Выявленные участки были использованы для дизайна олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов. В местах единичных нуклеотидных отличий геномов пяти серотипов аденовирусов человека были введены вырожденные нуклеотиды, что исключает возможность отсутствия гибридизации полученных олигонуклеотидов с целевой ДНК в ПЦР.

На этапе расчетов с использованием онлайн интернет-ресурсов базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI) была оценена специфичность выбранных олигонуклеотидов. Выбранные праймеры и зонд не обнаруживают гомологии к человеческой ДНК, а также вирусным и бактериальным патогенами, которые встречаются в клинических образцах, исследуемых на наличие агентов ОРВИ (коронавирусы человека видов 229E, NL63, OC43, HKU1, коронавирусом, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом, вирусом герпеса человека типов 1 и 2, цитомегаловирусом, вирусом парагриппа человека типов 1-4, метапневмовирусом человека, риновирусом человека видов A-C, энтеровирусом человека видов A-D, бактериями рода Streptococcus, бактериями вида Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumonia, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila).

Конструирование положительных контролей и оценка специфичности праймеров и зондов в реакции ПЦР

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифического ДНК-дуплекса в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США). Затем полученными плазмидными конструкциями, несущими вирусспецифическую вставку, трансформировали компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США). Наличие вирусспецифической к гену гексона аденовируса ДНК-вставки подтверждали секвенированием. В ходе проделанной работы была получена рекомбинантная плазмида - pHAdV.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния (Mg²⁺), концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. С использованием полученной плазмидной конструкции были подобраны оптимальные концентрации ионов Mg²⁺ (2.5 мМ MgCl₂), прямого и обратного праймеров (300 нМ), флуоресцентного ДНК-зонда (100 нМ). Важно отметить, что все этапы оптимизации проведения ОТ-ПЦР были осуществлены с использованием коммерческих реагентов и приборов для амплификации, являясь коммерчески доступными, они предназначены для массового применения в диагностических лабораториях России. Это позволяет широко применять данное изобретение в лабораторной практике.

ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей:

§ 1×Taq буфер для амплификации (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»);

§ 2,5 мМ MgCl₂ (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»);

§ 0,17 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»);

§ 1,5 активные единицы Smart Taq ДНК-полимеразы (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»).

§ 300 нМ прямого и обратного праймеров;

§ 100 нМ флуоресцентно меченного ДНК-зонда.

30 мкл смеси для ПЦР имеет следующий состав (из расчета на одну пробирку):

Компонент смеси Объем, мкл ПЦР-буфер×10 3,0 дНТФ (5 мМ) 1,0 MgCl₂ (50 мМ) 1,5 Hot Start Taq ДНК-полимераза 0,3 Праймер F-HAdV (0.15 мМ) 2,0 Праймер R-HAdV (0.15 мМ) 2,0 ДНК-зонд Z-HAdV (0.2 мМ) 0,5 Образец 3,0 H₂O 16,7

ПЦР проводили согласно температурно-временному профилю:

1 Предварительный прогрев 95 °C - 5 минут 2 Параметры циклов ПЦР
(10 циклов) 95 °C - 20 секунд
51 °C - 20 секунд
72 °C - 20 секунд 3 Параметры циклов ПЦР
(30 циклов) 95 °C - 20 секунд
51 °C - 20 секунд (детекция)
72 °C - 20 секунд 4 Остановка реакции 72 °C - 5 минут

Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу Orange 585/610 нм (краситель ROX). Измерение интенсивности флюоресценции проводили на приборах “Rotor Gene 6000” (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг. 1).

Дополнительно проводили электрофорез продуктов ПЦР в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Результаты оценивали по наличию флуоресцирующих полос, соответствующих фрагментам ДНК в 720 п.о. (К+), 951 п.о. (Ι раунд ПЦР), 206 п.о. (ΙΙ раунд ПЦР) (фиг. 2).

Полосы флуоресценции в геле соответствовали полученным в реакции амплификации участкам плазмидной и вирусной ДНК.

Для определения аналитической чувствительности метода были приготовлены последовательные 10-кратные разведения плазмидной ДНК (pHCoV). Концентрацию плазмидной ДНК определяли при помощи коммерческого набора реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США). Аналитическая чувствительность разработанного метода с использованием внутренних праймеров для аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 составила 10²10³ геномных эквивалентов (ГЭ). При постановке ПЦР в два раунда аналитическая чувствительность составила 10-10² ГЭ.

В таблице 1 представлено сравнение разработанной лабораторной ПЦР-РВ (заявляемое техническое решение) с «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» для детекции аденовируса человека в образцах от 164 больных ОРВИ, собранные в эпидемический сезон 2011-2012 гг. в г.Новосибирске и Новосибирской области.

Таблица 1 Сравнительные данные разработанной лабораторной ПЦР-РВ (заявляемое техническое решение) с «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» Агент «АмплиСенс» Лабораторная ПЦР-РВ Соотношение Абсолютное число % Абсолютное число % Абсолютное число % Аденовирусы 1 0,6 6 3,7 -5 -3

У амплифицированных фрагментов ДНК аденовируса, полученных при исследовании клинических образцов от больных ОРВИ, были определены нуклеотидные последовательности. При последующем исследовании полученных нуклеотидных последовательностей было установлено наличие:

- 3 серотипа аденовируса человека в одном образце;

- 7 серотипов - в двух образцах;

- 14 серотипов - в 1 образце;

- 21 серотип аденовируса человека в двух образцах.

Сравнительные данные показали, что ПЦР-РВ (заявленное решение) по чувствительности превосходит «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» на 3%.

Кроме того, с помощью олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда можно проводить исследование клинического материала методом «полувложенной» ПЦР. Наличие одного «внешнего» праймера позволяет кроме этого сократить стоимость проведения одного анализа. Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд позволяют выявить в образце ДНК аденовирусов серотипов 3, 4, 7, 14, 21 в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК длиной в 951 пару оснований (п.о.), что позволяет секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойства аденовируса.

Таким образом, рассчитанные и представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд обладают минимальной вырожденностью, а созданный на их основе набор обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Повышению чувствительности способствует и то, что предлагаемые к патентованию праймеры позволяют проводить двухраундовый ПЦР.

Разработанный набор позволяет выявить до 1000 копий молекулы ДНК при постановке ПЦР в один раунд и до 100 копий молекулы ДНК при постановке ПЦР в два раунда.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора, включающего олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченный зонд для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Представленные праймеры и зонд имеют следующую структуру:

внешний праймер 5'→3'

5'-AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT-3'

внутренние праймеры 5'→3'

5'-CCCWTCGATGMTGCCCC-3'

5'-TCMACGGGYACRAAGCGCA-3'

зонд 5'→3'

ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2.

Изобретение обладает более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время аденовирусам и позволяет идентифицировать ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21. 3 ил., 1 табл.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда для детекции ДНК аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в клинических образцах, которые имеют следующую структуру:
внешний праймер 5'→3'
5'-AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT-3'
внутренние праймеры 5'→3'
5'-CCCWTCGATGMTGCCCC-3'
5'-TCMACGGGYACRAAGCGCA-3'
зонд 5'→3'
ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2