СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ E.COLI Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано в фармацевтической промышленности.

Известен способ повышения продуктивности микроорганизмов, осуществляемый следующим образом (патент РФ №2208049, опубл. 10.07.2003 г.). Суспензию микроорганизмов приготовляют известным способом и инкубируют в известных условиях до достижения необходимой стадии развития, определяемой эмпирически. Затем суспензию подвергают воздействию оптического излучения в пределах известных спектральных полос поглощения растворенного молекулярного кислорода дозой D=P·t, где Р - мощность излучения, t - время экспозиции, производя перемешивание суспензии одним из известных способов в процессе облучения, либо непосредственно после него одним из известных способов, например, магнитной мешалкой или циркуляцией. Величину дозы определяют по формуле: D=D₀x_β/f(λ), где D₀=D(λ₀) - оптимальная доза облучения суспензии в центре λ₀ выбранной полосы поглощения молекулярного кислорода, вероятность поглощения фотона молекулой кислорода в выбранном объеме суспензии, рассчитываемая по спектру поглощения суспензии, f(λ) - приведенный контур полосы поглощения растворенного молекулярного кислорода, причем f(f(λ₀)=1).

При этом роль первичного фоторецептора выполняет свободно диффундирующий в клеточной суспензии молекулярный кислород. Продуктом оптического возбуждения является молекула синглетного кислорода, имеющая, как давно установлено, высокую биологическую активность. Светокислородный эффект наблюдается при оптическом возбуждении молекулярного кислорода во всех полосах его поглощения, причем наиболее эффективная длина волны находится в ближнем ИК диапазоне (1264 нм), где в клетках отсутствуют конкурирующие фотоактивные молекулы. Механизм светокислородного эффекта аналогичен известному фотодинамическому эффекту.

Недостатком способа повышения продуктивности микроорганизмов, является снижение эффективности стимуляции клеток микроорганизмов за счет использования фоторецепторов, специфичных для каждого вида микроорганизмов. Отвечающие за фотостимуляцию фоторецепторы могут быть связаны с различными клеточными структурами, из-за чего спектр их поглощения в микроорганизмах разных видов будет меняться, приводя к спектральному сдвигу максимума возбуждения и требуя соответствующего изменения длины волны возбуждающего излучения. Чтобы достичь одинаковой степени стимуляции всех клеток в суспензии, необходимо создать для них условия равномерного облучения, что может быть выполнено только в оптически тонких слоях. Следовательно, при облучении суспензий приходится использовать либо тонкие кюветы, либо малые концентрации клеток, и это резко ограничивает количество стимулируемых клеток. Более того, в случае наличия источника излучения с длиной волны, несколько отличной от рекомендуемой, невозможно рассчитать, насколько надо изменить дозу облучения, чтобы получить тот же эффект.

Техническим результатом заявляемого способа повышения продуктивности микроорганизмов E.coli является увеличение стимуляции роста клеток микроорганизмов.

Задача решается тем, что в способе повышения продуктивности микроорганизмов E.coli, заключающийся в том, что готовят суспензию микроорганизмов, которую перемешивают в процессе культивирования, перемешивание производят в присутствии магнитного изотопа магния ²⁵Mg в количестве 2,2 ммоль/л.

На фиг.1 представлены ростовые кривые для клеток E.coli, культивируемых при постоянном перемешивании в присутствии магнитного ²⁵Mg и немагнитных изотопов магния ^24,26Mg, на фиг.2 - колониеобразующая способность для клеток E.coli, культивируемых при постоянном перемешивании в присутствии магнитного ²⁵Mg, немагнитных изотопов магния ^24,26Mg и природном магнии *Mg в течение 8 часов, на фиг.3 - колониеобразующая способность для клеток E.coli, культивируемых при постоянном перемешивании в присутствии магнитного ²⁵Mg, немагнитных изотопов магния ^24,26Mg и природном магнии *Mg (4, 8 и 12 часов культивирования слева направо), на фиг.4 - данные по измерению колониеобразующих единиц в соответствии с репродуктивным потенциалом бактерий.

Способ повышения продуктивности микроорганизмов E.coli осуществляли следующим образом.

Для выявления влияния изотопов магния на рост и развитие микроорганизмов параллельно проводили 2 серии эксперимента на штаммах бактерий E.coli. Для этого готовили суспензию микроорганизмов Escherichia coli 10⁵ КОЕ/мл в среде М9, которую постоянно перемешивают в процессе культивирования, перемешивание производят в присутствии магнитного изотопа магния ²⁵Mg в количестве 2,2 ммоль/л.

Способ повышения продуктивности микроорганизмов E.coli осуществляли следующим образом.

Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.) в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее производился посев микроорганизмов в синтетическую питательную среду М9, содержащую магнитный изотоп магния ²⁵Mg в виде сульфата концентрации 2,2 ммоль/л.

Таблица 1 Стабильные изотопы магния Изотоп Спин Магнитный момент (µ_B) Природное содержание, % ²⁴Mg 0 0 79 ²⁵Mg 5/2 0.85 10 ²⁶Mg 0 0 11

Подготовленную таким образом суспензию микроорганизмов E.coli культивировали при постоянном перемешивании 200 об/мин в течение 14 часов (температура 37°C).

Для сравнения продуктивности микроорганизмов E.coli с бактериями, культивируемыми на двух других, немагнитных изотопах магния и природном магнии проводились параллельные эксперименты при аналогичных условиях.

Таблица 2 Паспортные данные оксидов изотопов магния   Содержание изотопа магния, ат.% Изотоп для ²⁴MgO для ²⁶MgO для ²⁵МgО ²⁴Mg 99,88±0,02 97,70±0,20 99,37±0,08 ²⁵Mg 0,07 1,98 0,33 ²⁶Mg 0,05 0,20 0,30   Содержание примесей, вес.% Элемент для ²⁴MgO для ²⁶МgО для ²⁵МgО K <0,005 <ПО 0,017 Na 0,002 <ПО 0,004 Ca <0,005 0,008 0,34 Fe <0,005 0,019 0,048 Al 0,0011 0,0008 0,031 Si <0,005 <ПО <0,005 Cr - <ПО 0,0030 Ni 0,0001 <0,0002 <0,0001 Cu 0,0029 0,0021 0,0004 Mn 0,0032 0,0021 0,059 Pb <ПО* <ПО 0,0015 Lu <ПО <ПО 0,0003 Pt <ПО 0,0031 0,0002 B <ПО 0,008 0,0026 Ti <ПО <ПО 0,0015 Co <ПО <ПО 0,0011 Sr <ПО <ПО 0,0002 Ba <ПО 0,0003 0,0002 La <ПО <ПО 0,0003 Eu <ПО <ПО 0,0002 Zn 0,0006 0,0005 0,0009 Ru <ПО 0,0001 <ПО Cd <ПО 0,0001 <ПО P <0,005 <ПО <ПО

Растворы изотопов магния в виде сульфатов готовились отдельно из оксидов магния MgO (паспортные данные магний-изотопных реактивов приведены в таблице 2) и 30% серной кислоты H₂SO₄, а потом добавлялись в среду М9, стерилизуемую при температуре 120°C 20 минут. Для всех четырех различных сред (с магнитным Mg, двумя немагнитными изотопами ^24,26Mg и природным магнием) строго контролировался pH 7,00±0,42. Под природным магнием подразумевается смесь изотопов в природном соотношении (78,60(²⁴MgSO⁴):10,11(²⁵MgSO₄):11,29(²⁶MgSO₄)).

Продуктивность микроорганизмов E.coli оценивалась в 20 независимых экспериментах по трем параметрам:

1. Скорость роста, оцениваемая как показатель экспоненциальной аппроксимирующей функции начального участка ростовых кривых (0-6 часов). Ростовые кривые (зависимости оптической плотности супензий от времени культивирования) получались турбодиметрическим методом с помощью измерения оптической плотности суспензий каждый час на спектрофлуориметре «SOLAR 2203».

2. Колониеобразующая способность, оцениваемая с помощью метода серийных разведении и посева на агар (использовался Lb-агар производства Sigma Aldrich Co.) в трех контрольных точках - 4, 8 и 12 часов культивирования.

3. Репродуктивный потенциал бактерий, оцениваемый с помощью пересева клеток E.coli (выращенных в изотопных средах в течение 14 часов) на аналогичные питательные среды М9 с концентрацией ионов магния в среде 0 ммоль/л и измерения колониеобразующих единиц в течение 72 часов культивирования при температуре 37°C.

Ростовые кривые, полученные в соответствии с пунктом 1, представлены на фиг.1.

Значения для скорости роста, вычисленные при аппроксимации приведенных кривых, представлены в таблице 3.

Таблица 3 Скорость роста клеток микроорганизмов E.coli, культивируемых при постоянном перемешивании в присутствии магнитного ²⁵Mg и немагнитных изотопов магния ^24,26Mg Содержание изотопа в среде М9 Скорость роста, ч^{-1 24}Mg 0,55±0,02 ²⁵Mg 0,83±0,05 ²⁶Mg 0,61±0,04

Значения для всех трех показателей, как видно из приведенных графиков и таблиц, оказались выше для клеток, культивируемых в присутствии магнитного изотопа магния ²⁵Mg. Это свидетельствует о повышении их продуктивности за счет влияния магнитного момента ядра изотопа магния ⁵Mg на ход внутренних метаболических процессов, изменения скорости ферментативных реакций, а соответственно, увеличения выхода продукта, в том числе аденозинтрифосфорной кислоты.

Подбор оптимальной концентрации сульфата магния в среде проводился с помощью измерения КОЕ.

Методика эксперимента: 100 мкл инокулята вносилось в 5 мл питательной среды М9 со следующими концентрациями сульфата магния: 0, 2.2, 7, 10, 15, 20, 25, 30 ммоль/л. Концентрация 2.2 ммоль/л является стандартной для среды М9. Пробирки с культурой инкубировались в течение 48 часов при температуре 37°C. Через 24 часа и 48 часов производился бактериологический высев для подсчета КОЕ. Параллельно на стационарной фазе измерялась оптическая плотность на спектрофлуориметре SOLAR CM 2203 на длинах волн 450 нм, 492 нм и 620 нм. При бактериологическом высеве для подсчета КОЕ применялся метод серийных разведении: использовались три разведения среды, содержащей клетки микроорганизмов E.coli, в физиологическом растворе (0,85% водный раствор NaCl) в следующих концентрациях: 10^-3, 10^-4, 10^-5.

При подсчете КОЕ были получены результаты, представленные в таблице 4.

Таблица 4 Результаты измерения КОЕ при подборе оптимальной концентрации сульфата магния Концентрация MgSO₄, мМ/л КОЕ/мл, 10⁵ 24 часа инкубирования КОЕ/мл, 10⁴ 48 часов инкубирования Опт. плотность стационара, отн.ед. 0 1,24±0,02 0,28±0,02 0,308±0,041 2.2 4,04±0,02 2,00±0,02 0,499±0,032 7 1,94±0,05 1,40±0,05 0,332±0,018 10 1,55±0,02 0,51±0,02 0,143±0,017 15 3,09±0,02 0,21±0,02 0,045±0,013 20 3,44±0,06 1,10±0,06 0,149±0,030 25 4,17±0,01 0,91±0,01 0,338±0,022 30 1,80±0,03 0,80±0,03 0,267±0,034

Анализируя полученные экспериментальные данные по измерению КОЕ бактериальных клеток E.coli, растущих на синтетической питательной среде М9 с различным содержанием ионов магния Mg²⁺, можно сделать следующие выводы:

- жизнеспособность бактерий на протяжении 48 часов инкубации при росте на среде с концентрацией сульфата магния 2,2 мМ/л выше, чем на других концентрациях;

- на средах с большими концентрациями сульфата магния (10 мМ/л и выше) отмирание микроорганизмов происходит быстрее, чем на концентрациях 2,2 и 7 мМ/л;

- концентрация сульфата магния 15 мМ/л является для клеток микроорганизмов E.coli минимальной токсической. Это может быть связано с тем, что при дальнейшем увеличении концентрации ионов магния в питательной среде включаются другие пути метаболизма, а данная концентрация является граничной. И именно с этой концентрации размер колоний, формируемых бактериями, резко уменьшается, т.е. эта концентрация (и более высокие тоже) не является оптимальной средой обитания для E.coli. Таким образом, оптимальная концентрация сульфата магния в питательной среде - 2.2 ммоль/л.

Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ повышения продуктивности микроорганизмов E.coli увеличивает стимуляцию роста клеток микроорганизмов, т.е. в среде, обогащенной изотопами Mg²⁵, рост бактерий происходит быстрее, чем в среде с природным содержанием Mg. Эффективному действию магнитного изотопа на рост культуры клеток E.coli способствует влияние магнитного момента ²⁵Mg на ферментативное фосфорилирование и, соответственно, на последующие процессы, происходящие при участии АТФ.

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Способ повышения продуктивности бактерий E.coli заключается в подготовке суспензии микроорганизмов, перемешивании ее в процессе культивирования в присутствии сульфата магнитного изотопа магния ²⁵Mg в количестве 2,2 ммоль/л. Изобретение обеспечивает увеличение стимуляции роста клеток бактерий E.coli. 4 ил., 4 табл.

Способ повышения продуктивности микроорганизмов E.coli, заключающийся в том, что готовят суспензию микроорганизмов, которую перемешивают в процессе культивирования, отличающийся тем, что перемешивание производят в присутствии сульфата магнитного изотопа магния ²⁵Mg в количестве 2,2 ммоль/л.