СПОСОБ ИЗОТОПНОГО ОБОГАЩЕНИЯ КЛЕТОК E.coli Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 

Способ изотопного обогащения клеток E.coli относится к микробиологии, энзимологии для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов.

Известен способ изотопного обогащения (патент РФ №2399409, опубл. 20.09.10), содержащий стадию осуществления изотопного обмена между водным раствором, содержащим, по меньшей мере, два компонента, каждый из которых представлен формулой H₂O-H₂SiF₆·nSiF₄ (где n≥0), и газом, содержащим SiF₄, для обогащения стабильного изотопа Si. Возможно, что SiF₄ растворяют в водном растворе до состояния насыщения, а также, что водный раствор имеет азеотропный состав.

Недостатком данного способа является невозможность его использования для обогащения клеток E.coli, т.к. данный раствор не содержит питательных веществ для бактерий и не имеет pH=6.5-7.5, при котором растут и размножаются клетки.

Техническим результатом заявляемого способа изотопного обогащения клеток E.coli является эффективное замещение природного внутриклеточного магния соответствующим изотопом.

Задача решается тем, что в способе изотопного обогащения клеток E.coli, содержащего стадию изотопного обмена между клетками E.coli и водным раствором, отличающийся тем, что изотопный обмен между клетками E.coli и водным раствором осуществляют в течение 10-16 часов при температуре 37°C, причем в водный раствор, обогащенный по одному из изотопов магния ²⁴Mg, ²⁵Mg, ²⁶Mg, входят NH₄Cl, глюкоза, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl и MgSO₄, при следующем содержании на 1 л дистиллированной воды:

NH₄Cl - 2 г;

MgSO₄ - 200-260 мг;

глюкоза (сухая) - 8-10 г;

Na₂HPO₄ - 11,9-12,1 г;

KH₂PO₄ - 5,95-6,05 г;

NaCl - 0,98-1,02 г.

Способ изотопного обогащения клеток E.coli осуществляли следующим образом.

Музейный штамм Escherichia coli K12TG1 предварительно инкубировался в Lb-бульоне (производства Sigma Aldrich Co.), который содержит природный магний, в течение 24 часов при температуре 37°C. Далее трижды производился посев микроорганизмов исходной концентрации 10⁵ KOE/мл в синтетическую питательную среду М9 - водный раствор с разной концентрацией 6 компонентов на 1 л дистиллированной воды.

Первый водный раствор:

NH₄Cl - 2 г; MgSO₄ - 200 мг; глюкоза (сухая) - 8 г; Na₂HPO₄ - 11,9 г; KH₂PO₄ - 5,95 г; NaCl - 0,98 г.

Второй водный раствор:

NH₄Cl - 2 г; MgSO₄ - 230 мг; глюкоза (сухая) - 9 г; Na₂HPO₄ - 12 г; KH₂PO₄ - 6 г; NaCl - 1 г.

Третий водный раствор:

NH₄Cl - 2 г; MgSO₄ - 260 мг; глюкоза (сухая) - 10 г; Na₂HPO₄ - 12, 1 г; KH₂PO₄ - 6,05 г; NaCl - 1,02 г.

Первые три вещества, NH₄Cl, глюкоза (сухая) и MgSO₄, входят в питательный раствор, необходимый для поддержания жизнеспособности клеточной культуры и ее роста, требуемого для накопления изотопно-обогащенной магнием клеточной биомассы. Последние три вещества, Na₂HPO₄, KH₂PO₄ и NaCl, являются буферным раствором, который поддерживает pH=6.5-7.5 среды. Два раствора готовятся отдельно, стерилизуют в автоклаве 25 минут при давлении 1,5-2 атм. После автоклавирования растворы сливаются; pH контролируют до и после стерилизации. Изотопы магния добавляют в среду в виде сульфата магния MgSO₄, концентрация которого составляет 2.2 мМ/л. Характеристики существующих в природе стабильных изотопов магния и их природное содержание приведены в таблице 1.

Таблица 1 Изотоп Магнитный момент (µв) Природное содержание, % ²⁴Mg 0 79 ²⁵Mg 0.85 10 ²⁶Mg 0 11

Для приготовления сульфатов использовались изотопно-чистые оксиды ²⁴MgO, ²⁵MgO и ²⁶MgO производства ФГУП «Электрохимприбор» с рекордно высоким изотопным обогащением 99.8, 98.8 и 97.7 атомных процентов, соответственно. Паспортные данные оксидов изотопов магния приведены в таблицах 2-3.

Таблица 2   Содержание изотопа магния, ат.% Изотоп для ²⁴MgO для ²⁶MgO для ²⁵MgO ²⁴Mg 99,88±0,02 97,70±0,20 99,37±0,08 ²⁵Mg 0,07 1,98 0,33 ²⁶Mg 0,05 0,20 0,30

Таблица 3   Содержание примесей, вес.% Элемент для ²⁴MgO для ²⁶MgO для ²⁵MgO K <0,005 <ПО 0,017 Na 0,002 <ПО 0,004 Ca <0,005 0,008 0,34 Fe <0,005 0,019 0,048 Al 0,0011 0,0008 0,031 Si <0,005 <ПО <0,005 Cr - <ПО 0,0030 Ni 0,0001 <0,0002 <0,0001 Cu 0,0029 0,0021 0,0004 Mn 0,0032 0,0021 0,059 Pb <ПО* <ПО 0,0015 Lu <ПО <ПО 0,0003 Pt <ПО 0,0031 0,0002 B <ПО 0,008 0,0026 Ti <ПО <ПО 0,0015 Co <ПО <ПО 0,0011 Sr <ПО <ПО 0,0002 Ba <ПО 0,0003 0,0002 La <ПО <ПО 0,0003 Eu <ПО <ПО 0,0002 Zn 0,0006 0,0005 0,0009 Ru <ПО 0,0001 <ПО Cd <ПО 0,0001 <ПО P <0,005 <ПО <ПО

Контроль соотношения изотопов магния, содержащихся в питательной среде М9, осуществлялся с помощью масс-спектрометрического анализа. Соотношение изотопов магния для сред М9 в % приведено в таблице 4.

Таблица 4 Изотоп Среда М9 с ²⁴Mg Среда М9 с ²⁵Mg Среда М9 с ²⁶Mg ²⁴Mg 99,7 1,4 4,5 ²⁵Mg 0,12 98,1 0,61 ²⁶Mg 0,13 0,5 94,9

В подготовленные таким образом водные растворы производили посев микроорганизмов с начальной концентрацией 10⁵ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл раствора). После этого образцы выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 10, 13 и 16 часов. Контроль накопления клеточной биомассы осуществлялся с помощью стандартных методов измерения оптической плотности суспензии микроорганизмов и измерения колониеобразующих единиц. При достижении бактериями плотности популяции 10⁸-10⁹ КОЕ/мл или 0,6-0.7 отн. ед. оптической плотности клеточная биомасса осаждалась методом центрифугирования на 15 тыс. об. в течение 15 минут. После производился двукратный отмыв клеточной биомассы бактерий E.coli дистиллированной водой с повторным центрифугированием.

Полученная таким образом клеточная биомасса исследовалась на содержание изотопов магния масс-спектральным (PlasmaQuad 2, VG Elemental, Англия) и атомно-эмиссионным методами (ICAP-61, Thermo Jarrell Ash, США). Клеточная биомасса предварительно подвергалась лиофильной сушке и автоклавному разложению. Данные по соотношению изотопов магния в клетках E.coli после цикла культивирования на изотопных средах М9 приведены в таблице 5.

Таблица 5 Изотоп Исход-ная куль тура Выдержка в термоста-те, час. Клетки, выращенные на среде М9 с ²⁴Mg Клетки, выращенные на среде М9 с ²⁵Mg Клетки, выращенные на среде М9 с ²⁶Mg 1-й водный р-р 2-й водный р-р 3-й водный р-р 1-й водный р-р 2-й водный р-р 3-й водный р-р 1-й водный р-р 2-й водный р-р 3-й водный р-р ²⁴Mg 87,8 10 90,8 94,5 95,1 5,9 6,3 6,1 12,5 9,8 9,8 13 91,1 99,5 99,4 6,0 6,6 6,5 10,4 10,0 9,9 16 93,5 99,5 99,5 6,2 6,6 6,5 9,7 10,0 10,0 ²⁵Mg 5,9 10 6,2 3,5 3,4 90,2 91,9 91,3 2,1 3,3 3,7 13 5,8 0,23 0,22 91,9 92,5 92,1 2,0 1,6 2,6 16 4,7 0,24 0,23 92,3 92,5 92,4 2,2 1,6 1,7 ²⁶Mg 6,3 10 3,0 2,0 1,4 3,9 1,8 2,6 85,4 86,9 86,5 13 3,1 0,23 1,5 2,1 0,87 1,4 87,6 88,4 87,5 16 1,8 0,22 0,22 1,5 0,87 1,1 88,1 88,4 88,3 * Погрешность определения от 1.2% отн. для 95%; до 15% для 0.5%

После 10-16 часов культивирования на магний-изотопных средах, в течение которых происходил изотопный обмен между клетками и водным раствором, бактерии были обогащены по соответствующему изотопу магния до 99,5 по сравнению с исходной бактериальной культурой, выращенной на питательном бульоне Lb, как видно из второго столбца данных таблицы 5. Цикл культивирования бактерий на питательных средах М9, содержащих изотопы магния, приводит к практически полному замещению внутриклеточного магния на конкретный изотоп.

Используемый способ изотопного обогащения микроорганизмов в присутствии магнитного и немагнитных изотопов магния оказался уникальным и применяется впервые. Данный способ может использоваться для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов, который найдет свое применение в различных исследовательских работах в микробиологии, энзимологии. Кроме того, он может использоваться в различных медицинских и биотехнологических приложениях как простой и нетрудоемкий способ получения изотопно-обогащенных биомолекул (АТФ, ДНК и т.д.), клеточных подструктур и самих клеток. Немаловажно, что подобные выделенные молекулы и клеточные подструктуры нерадиоактивны, так как для изотопного обогащения используются только стабильные изотопы. Данный способ может быть модифицирован для других стабильных изотопов жизненно важных химических элементов, а также для других микроорганизмов.

Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ изотопного обогащения клеток E.coli позволяет эффективно проводить до 90% изотопный обмен между природным магнием, изначально содержащимся в клетках, и изотопом магния из водного раствора.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения изотопно-меченых клеток микроорганизмов. Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния предусматривает культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния ²⁴Mg или ²⁵Mg, или ²⁶Mg. Водный раствор включает NH₄Cl, глюкозу, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl и MgSO₄ при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды: NH₄Cl - 2 г, MgSO₄ - 200-260 мг, глюкоза (сухая) - 8-10 г, Na₂HPO₄ - 11,9-12,1 г, KH₂PO₄ - 5,95-6,05 г, NaCl - 0,98-1,02 г. Изобретение обеспечивает эффективное замещение природного внутриклеточного магния клеток E.coli соответствующим изотопом. 5 табл.

Способ обогащения клеток E.coli изотопами магния, предусматривающий культивирование клеток E.coli в течение 10-16 ч при температуре 37°C в водном растворе, обогащенном изотопом магния ²⁴Mg, или ²⁵Mg, или ²⁶Mg, включающем NH₄Cl, глюкозу, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl и MgSO₄, при следующем содержании компонентов на 1 л дистиллированной воды:
NH₄Cl 2 г MgSO₄ 200-260 мг глюкоза (сухая) 8-10 г Na₂HPO₄ 11,9-12,1 г KH₄PO₄ 5,95-6,05 г NaCl 0,98-1,02 г