Способ получения калиевой соли L-молочной кислоты Советский патент 1989 года по МПК C12P7/56 

1

Изобретение относится к тонкому биотехнологическому синтезу, а имен- но к получению L-молочной кислоты биотрансформацией фумаровой кислоты, которая может быть использована для 5 получения лекарственных препараторов, медицинских полимеров и химических ка тализ а то р ов.

Цель изобретения - улучшение качества целевого продукта и повьшение выхода -Ь-молочной кислоты.

Способ заключается в том, что проводят биотрансформацию фумаровой кислоты в присутствии водного раствора КОН, взятого в эквимолярном отно- шении к фумаровой кислоте, под действием соиммобилизованных в карраги- нановом геле клеток Lactobacillus

casei ВКМ В-536 и Escherichia coli ВКПМ В-4024, причем клетки E.coli предварительно активируют обработкой раствором бромистого цетилпиридиния. Культивирование L. casei BKMJB-536 ведут на Стандартной питательной среде.,

содержащей пептон, глюкозу, дрояоке- вой автолизат, добавки минеральных солей и L-яблочной кислоты, в течение 19 ч при и рН 6,0.

Полученную биомассу отделяют от питательной среды, например, центрифугированием, клетки отмы;- п:от от питательной среды.

Культивирование Е .coli ВКПМ B-AOZA ведут на бульоне Хоттингера, содержащем добавки NaCl, рН 7,0, в течение 24 ч при при перемешивании.

.4 О1 4 ОО 01

4;

31454854

Полученную биомассу отделяют от питательной среды, например, центрифугированием, отмывают от питательной среды и активируют раствором фума- рата калия, содержащим 0,02% бромистого цетилпирнциния, в течение 20ч при . По окончании активации клетки Е.соИ ВКПМ B-402- i отделяют центрифугированием, отмьшают и проводят их соиммобилизацию с L.casei ВКМ В-536 в 5%-ном каррагинановом геле.

Соотношение клеток E.coli ВКПМ В-4024 иЬ.са8е1ВКМ В-536 на единицу объема биокатализатора определяют соотношением активностей исходных компонентов биокатализатора: фума- разной активности.клеток E.coli ВКПМ В-4024 и малолактик-активности клеток L. casei ВКМ В-536. Фумаразную активность клеток E.coli ВКПМ В-4024 определяют спектрофотометрически по убыли фумарата, активность малолак- тик-фермента в L. casei ВКМ В-536 определяют по накоплению L-лактата.

Для выбранных штаммов соотношение удельной активности клеток E.coli ВКПМ В-4024 и L.casei ВКМ В-536 сое

Гель с со1л.1мобилизованнымн клетками обрабатывают водным раствором, содержащим фумаровую кислоту и гидроокись калия в зквимолярном соотношении, при этом часть фумаровой кислоты находится в виде осадка. Количество осадка определяется концентрацией фумаровой кислоты, взятой для

10 биотрансформациис рИ раствора составляет 4,5. В кислой среде происходит полное удаление углекислого газа, образующегося в процессе биотрансформации, накопление которого в раство15 ре при щелочной реакции среды инги- бирует процесс и понижает степень конверсии субстрата. Именно кислая реакция среды обеспечивает необратимость декарбоксилирова 1ия яблочной

20 кислоты в молочную и тем самым способствует сдвигу равновесия гидратации фумаровой кислоты в яблочную в сторону полной конверсии фу - 1аровой кислоты в продукты биотрансформации.

25 Использование меньшего количества КОН приводит к значительному закис- лению реакционной среды вследствие образования молочной кислоты, инактивации биокатализатора и неполной

тавляет 10:1, подсчет клеток осуш;ест- ЗО конверсии субстрата в продукт, Эквн вляют в камере Горяева, 1 мл суспен- молярное соотношение фумаровой кис лоты и гидроокиси калия обеспечивает образование лактата калия с выходом 100% и не содержащего свобод- -,- ной молочной кислоты.

Процесс биотрансформации ведут при , так как этот температурный режим является оптимальньм для обеих использованных культур микро- 40 ор ганизмов, относящихся к группе мезофилов,

Пример 1 . Культивирование

зии ,L. casei ВКМ В-536- содержит 2 d клетокt 1 мл суспензии Е.coli ВКПМ В-4024 - 1,5-1 о клеток. Для соиммо- билизации,E.coli ВКПМ В-4024 и L. casei ВКМ В-536 берут в соотношении числа клеток (клеточном соотношении), равном 1:1-1,5 при таком соотношении скоростьопределяющей стадией всего процесса является превращение яблочной кислоты в молочную, катализируемое L.casei ВКМ В-536. Уменьшение количества клеток L.casei ВКМ В-536 на единицу объема иммобилизоклеток бактерии Lactobacillus casei ВКМ В-536, полученной из Всесоюзной

JJ J &i СД- .|«-lriJ - - --..-

ванного биокатализатора, которое про- 45 коллекции микроорганизмов и описанисходит при изменении клеточного соотношения E.coli ВКПМ В-4024 и L. casei ВКМ В-536 в сторону увеличения содержания E.coli В-4024 до 7:1, приводит к снижению с-корости всего процесса биотрансформации в целом. При понижении содержания. IE. col i ВКПМ В-4024 до клеточного соотношения 1:20 и ниже скоростьимити- рующей стадией процесса становится гидратация фумаровой кислоты в яблочную, что также приводит к снижению

50

ной как Lactobacillus casei С 37, осуществляют в течение 16 ч при 37 С на стандартной среде, содержаш.ей 5% дрожжевого автолизата, 0,5% L-яб- лочной кислоты, 1% глюкозы, 5% пепто на, 0,3% ацетата натрия, 0,02% сульфата магния, 0,005% сульфата марганца, 0,05% Б,Ь-цистеина, 0,1% TweenSO рН среды доводят гидроокисью калия 55 до 6,0. Клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин. Клетки дважды отмывают

от

НУЮ, что также ПуИЬиДИТ л . -П l М м-, Д,пАг,тскорости общего процесса биотрансфор- питательной среды 0,1 М Na-фосфат

, ным буферным раствором, рН Ь,и и

МЯЦИИ Гель с со1л.1мобилизованнымн клетками обрабатывают водным раствором, содержащим фумаровую кислоту и гидроокись калия в зквимолярном соотношении, при этом часть фумаровой кислоты находится в виде осадка. Количество осадка определяется концентрацией фумаровой кислоты, взятой для

10 биотрансформациис рИ раствора составляет 4,5. В кислой среде происходит полное удаление углекислого газа образующегося в процессе биотрансформации, накопление которого в раство15 ре при щелочной реакции среды инги- бирует процесс и понижает степень конверсии субстрата. Именно кислая реакция среды обеспечивает необратимость декарбоксилирова 1ия яблочной

20 кислоты в молочную и тем самым способствует сдвигу равновесия гидратации фумаровой кислоты в яблочную в сторону полной конверсии фу - 1аровой кислоты в продукты биотрансформации.

25 Использование меньшего количества КОН приводит к значительному закис- лению реакционной среды вследствие образования молочной кислоты, инактивации биокатализатора и неполной

Пример 1 . Культивирование

клеток бактерии Lactobacillus casei ВКМ В-536, полученной из Всесоюзной

45 коллекции микроорганизмов и описан50

ной как Lactobacillus casei С 37, осуществляют в течение 16 ч при 37 С на стандартной среде, содержаш.ей 5% дрожжевого автолизата, 0,5% L-яб- лочной кислоты, 1% глюкозы, 5% пептона, 0,3% ацетата натрия, 0,02% сульфата магния, 0,005% сульфата марганца, 0,05% Б,Ь-цистеина, 0,1% TweenSO рН среды доводят гидроокисью калия 55 до 6,0. Клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин. Клетки дважды отмывают

от

. -П l М м-, Д,пАг,тосаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин. Выход биомассы с 0,5 л питательной среды составляет 3,5-4,2 мл суспензии, содержап ей клеток на 1 мл. Активность клеток L, casei ВКМВ-536 в реакдии яблочно-молочнокислого брожения составляет 10 мкмолей/мин на 1 мл суспензии.

Культивирование клеток бактерии Escherichia coli ВКПМ 5-4024, полученной из коллекции культур кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ и описанной как Esche- richia coli 85, осуществляют на гид- ролизате бульона Хоттингера, содержащем 0,5% хлористого натрия (рН среды равен 7,0) в течение 24 ч при и непрерывном перемешивании на качалке со скоростью 60 об/мин, Ютетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в О,9%-ном растворе хлористого натрия и центрифугируют повторно в тех же условиях. Выход биомассы с 0,5 л питательной среды составляет 4 мл суспензии с концентрацией клеток 1,510 на мл. Фу- маразная активность клеток E.coli БКПМ В-4024 составляет 100 мкмоль/ми на 1 мл суспензии клеток.

К 1 мл суспензии клеток E.coli ВКПМ В-4024 добавляют 25 мл 0,1 М раствора фумарата натрия и 0,25 мл 2%-ного раствора бромистого цетил- пиридиния. Полученную смесь инкубируют при в течение 5 ч при слабом перемешивании. По окончании инкубации клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, промывают 0,1 М Na-фос- фатным буферным раствором, рН среды 6,0 и повторно центрифугируют.

1,5 мл суспензии клеток E.coli ВКПМ В-4024, предварительно обработанных 0,02%-ным раствором бромистого цетилпиридиния, как описано вьппе и L.casei ВКМ В-536, взятых в клеточном соотношении 1:1 (влияние клеточного соотношения на выход продукта представлено в таблице), содержащей приблизительно 6-10 клток, вносят в 5,5 мл 6%-ного раствора

546

каррагшшна в 0,1 М Na-фосфатном бу-, фере ( рН 6,0 и перемешива1(1Т. После охлаждения гель заливают 70 нл охлажденного 0,1 М К-фосфатного буфера, рИ 6,0. Сформировавшийся гель измельчают и в течение 1 сут отмывают 0,1 М К-фосфатным буфером, рН 6,0.

Соиммобилизованные клетки (7 мл геля) заливают 20 мл реакционной смеси, содержащей 2 ммоль фумаровой кислоты и 2 ммоль гидроокиси калия. Клетки инкубируют в реакционной сре37°С

де в течение 24 ч при 37 С при слабом перемешивании. Выход молочной кислоты составляет 100%, продуктивность иммобилизованных клеток

1,1 мг/ч на 1 мл биокатализатора.

Пример 2. Выращивание и со- иммобилизацию клеток E.coli ВКПМ В-4024 и L. casei ВКМ В-536 осуществляют как в примере 1. В качестве

реакционной смеси используют 20 мл водного раствора, содержащего 10 ммоль фумаровой кислоты и 10 ммоль гидрооксида калия. 7 мл соиммобили- зованных клеток заливают реакционной

смесью и инкубируют 72 ч при 37 С. Выход молочной кислоты 100%, продуктивность иммобилизованных клеток 1,8 мг/ч с 1 мл биокатализатора.

Формула изобретения

Способ получения калиевой соли

L-молочной кислоты путем биотрансформации нерастворимого в воде субстрата с помощью двух культур микроорганизмен, о тл ич ающийс я тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта и повышения выхода, в качестве культур микроорганизмов используют штамм Escherichia coli

ВКПМ В-4024, активированный бромистым цетилпиридинием, и штамм Lactobacil- lus casei ВКМ В-536, соиммобилизо- ванные в каррагинатовый гель в кле- точном соотношении 1:1-1,5, а в качестве субстрата - фумаровую кислоту, при этом биотрансформацию ведут в присутствии гидроокиси калия, добавляемой в эквимолярном соотношении к фумаровой кислоте.

Выход молочной кислоты,

%54

100

100

Изобретение относится к тонкому биотехнологическому синтезу, а именно к получению L-молочной кислоты, которая может быть использована для получения лекарственных препаратов, медицинских полимеров и химических катализаторов. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта и повышение выхода L-молочной кислоты. Способ заключается в том, что проводят биотрапсформа- цию фумаровой кислоты в присутствии водного раствора КОН под действием соиммобилизованных в каррагинаповом геле клеток Lactobacillus casei БКМ В-536 и Escherichia coli ВК1ШВ-4024, причем клетки E.coli предварительно активируют обработкой раствором бромистого цетилпиридиния. 1 табл. SS

Продуктивность, мг/ч

на I мл биокатализатора 0,6 1,1 I,