СПОСОБ ЗАЩИТЫ БАКТЕРИЙ ОТ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПОВЫШЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам защиты микроорганизмов от теплового воздействия при получении бактериальных препаратов.

Известно большое количество защитных сред, введение которых в культуральную жидкость позволяет снизить гибель бактерий в ходе технологических операций, связанных с обезвоживанием жидкостей, содержащих микроорганизмы, с использованием теплового воздействия
Как правило, защитные среды включают значительное количество компонентов, природа которых не связана с жизнедеятельностью бактерий (тальк, крахмал и т.п.), что снижает эффективность получаемого биопрепарата. (J.Corry in "Water relation of food", London-New-York-San Francisco, Acad. Press, 1971, p.325; H.C.Пушкарь и др. Криопротекторы. Киев, Наукова думка, 1978).

Прототипом заявляемого изобретения является способ защиты бактерий от теплового воздействия путем введения в бактериальную суспензию перед воздействием высокой температуры аминобензгидразида в концентрации 0,00001-0,00005 М. (Авт. св. СССР 1214754, 1986, кл C 12 N 1/00).

Недостатками способа является чужеродность вводимой защитной добавки, что исключает ее применение в ряде процессов, в частности для получения биомассы для некоторых генно-инженерных процессов.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание технологии защиты микроорганизмов от воздействия повышенной температуры без использования посторонних веществ.

Указанная задача решалась путем введения в культуральную жидкость (КЖ) по крайней мере на 5 минут перед термошоком тяжелой воды (окись дейтерия) до конечной концентрации 20-60% масс.

Использование меньшей концентрации малоэффективно, применение больших количеств тяжелой воды экономически нецелесообразно.

Оптимальное время выдержки составляет 20-60 мин, однако выбор оптимальной концентрации зависит от особенностей защищаемого микроорганизма.

Промышленная применимость метода иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.

Клетки Е. coli М-17 выращивались на глюкозоминеральной среде следующего состава, г/л: Na₂HPO₄ 1, КН₂РO₄ 1, NaCl 5, Nа₂СО₃ 2, MgSO₄•7H₂O 0,123, цитрат аммония 45, глюкоза 3, никотиновая кислота 0,005, рН 7,0. Исходная плотность клеток составляла 3,3-3,5•10⁹ кл/мл по ОП₅₄₀.

Культивирование проводили в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды, на качалке (180 об/мин) при 37^oС. Клетки в стационарной фазе роста отделяли от среды культивирования центрифугированием при 4500 об/мин в течение 20 минут, промывали и суспендировали в физиологическом растворе до концентрации 5•10⁹кл/мл по ОП₅₄₀.

В КЖ вводили различные количества тяжелой воды фирмы "Изотоп" и выдерживали смесь на шуттеле в течение 30 минут, после чего смесь подвергали термообработке в течение 15 минут при 55^oС. Защитное действие тяжелой воды оценивалось по сохранению колониеобразующей способности (КОЕ) клеток E.coli при повышенной температуре. Число жизнеспособных клеток определяли по высеву на плотной питательной среде Эндо без удаления D₂О.

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Пример 2.

Клетки E.coli C-600 выращивались на глюкозоминеральной среде следующего состава, г/л: Na₂HPO₄ 1, КН₂PO₄ 1, NaCl 5, Na₂СО₃ 2, MgSO₄•7H₂O 0,123, цитрат аммония 45, глюкоза 3, никотиновая кислота 0,005, дрожжевой автолизат 4, рН 7,0. Исходная плотность клеток составляла 3,3-3,5•10⁹ кл/мл по ОП₅₄₀.

Культивирование проводили в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды, на качалке (180 об/мин) при 37^oС. Клетки в стационарной фазе роста отделяли от среды культивирования центрифугированием при 4500 об/мин в течение 20 минут, промывали и суспендировали в физиологическом растворе до концентрации 5•10⁹кл/мл по ОП₅₄₀.

В КЖ вводили различные количества тяжелой воды фирмы "Изотоп" и выдерживали смесь на шуттеле в течение 30 минут, после чего смесь подвергали термообработке в течение 15 минут при 55^oC.

Защитное действие тяжелой воды оценивалось по сохранению колониеобразующей способности (КОЕ) клеток E.coli при повышенной температуре. Число жизнеспособных клеток определяли по высеву на плотной питательной среде Эндо без удаления D₂O.

Полученные результаты приведены в табл. 2.

При использовании в том же опыте вместо тяжелой воды фирмы "Изотоп" аналогичный препарат фирмы "Sigma" в дозе 40% KOE•10⁸=3,5±0,1, т.е. полученные результаты эквивалентны (при существенно более высокой стоимости препарата фирмы "Sigma"), и, следовательно, существенным является концентрация тяжелой воды, а не выбор конкретного препарата, ее содержащего.

Пример 3.

Клетки Bac. thuringiensis. -98 (Bac.th.) выращивали на среде следующего состава, г/л: белково-витаминный концентрат 24, кукурузная мука 20, MgSО₄•7H₂О 0,5, (NH₄)₂HPО₄ 5, СаСl₂•2Н₂O 1,5, рН 6,8-7,2. Культивирование проводили в колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды на качалке (160-200 об/мин), при температуре 30^oС. Вегетативные клетки отделяли от среды культивирования центрифугированием при 4500 об/мин в течение 20 минут, промывали и ресуспендировали в физиологическом растворе. Исходная плотность клеток составляла 3,3-3,5•10⁷ кл/мл по результатам подсчета при высеве на плотную питательную среду.

В КЖ вводили различные количества тяжелой воды фирмы "Изотоп" и выдерживали смесь на шуттеле в течение 30 минут, после чего смесь подвергали термообработке в течение 15 минут при 55^oС.

Защитное действие тяжелой воды оценивалось по сохранению колониеобразующей способности (КОЕ) клеток E.coli при повышенной температуре. Число жизнеспособных клеток определяли по высеву на плотной питательной среде агаре "Д" без удаления D₂O.

Полученные результаты приведены в табл. 3
Пример 4.

В условиях примера 1 проводили опыты по определению воздействия времени контакта бактериальных клеток на величину защитного эффекта. Полученные результаты приведены в табл. 4.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что использование тяжелой воды позволяет повысить титр получаемого после термического воздействия биопрепарата в среднем в 1,5-3 раза в зависимости от условий проведения процесса.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам защиты микроорганизмов от теплового воздействия при получении бактериальных препаратов. Способ защиты бактерий от воздействия повышенной температуры включает введение в бактериальную суспензию не менее чем за 5 мин до воздействия повышенной температуры тяжелой воды до концентрации в конечном продукте 10-60%. Способ позволяет повысить титр жизнеспособных микроорганизмов получаемого после термического воздействия биопрепарата в среднем в 1,5-3 раза. 4 табл.

Способ защиты бактерий от воздействия повышенной температуры путем введения в бактериальную суспензию защитных добавок до воздействия повышенной температуры, отличающийся тем, что в бактериальную суспензию не менее чем за 5 мин до воздействия повышенной температуры в качестве защитной добавки вводят тяжелую воду до концентрации в конечном продукте 10-60 мас. %.