СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА, УСТОЙЧИВЫХ К АНТРАКНОЗУ, МЕТОДАМИ IN VITRO Российский патент 2013 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к селекции растений, в частности льна, и может быть использовано в практической работе для ускорения создания линий льна.

Известен способ получения линий льна, устойчивых к фузариозу (Fusarium oxysporum

и Fusarium Semitectum) (1), основанный на использовании культурального фильтрата грибов Fusarium; культивировании гипокотильных сегментов на селективной MS-среде, содержащей кинетин в концентрации 1,0 мг/л, IBA - 0,1 мг/л и 2,5 - 5% культурального фильтрата вышеуказанных патогенов; последующем отборе устойчивых каллусных клеток и их переносе в селективные условиия (MS-среда, содержащая кинетин в концентрации 1,0 мг/л, IBA - 0,1 мг/л и 2,5-5% культурального фильтрата гриба Fusarium oxysporum и F. Semitectum); отборе и дальнейшем культивировании морфогенного каллуса на среде без токсинов до получения побегов и регенерантов.

Недостатками этого способа являются низкий выход устойчивых форм и потеря устойчивости к фузариозу уже во втором поколении.

Наиболее близким аналогом является способ получения растений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию, методами in vitro (культура пыльников, клеточная селекция) (2), при котором донорные растения льна-долгунца выращиваются в условиях высокого агрофона с использованием приема декапитации; пыльники культивируют на селективной среде Sh-2+0,5 мг/л фузариевой кислоты; первичный и пересадочный морфогенный каллус культивируют на селективной среде Sh-2+10 мг/л фузариевой кислоты; проводят тестирование на устойчивость к фузариозному увяданию in vivo на искусственном инфекционно-провокационном фоне.

Недостатком данного способа является невозможность выделения чистого токсина из культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini, так как до сир пор не выяснено какой именно токсин является ответственным за проявление его токсического действия; а также невозможно использование пыльников для культивирования на среде, содержащей культуральный фильтрат гриба Colletotrichum lini.

Заявляемое изобретение направлено на устранение вышеотмеченных недостатков известного, и от его использования может быть получен следующий технический результат: позволит повысить частоту регенерации генотипов льна-долгунца в селективных условиях до 35% и получить растения-регенеранты, устойчивые к антракнозу. Применение изобретения обеспечит получение из восприимчивых к антракнозу - устойчивых к патогену - форм льна за 6 месяцев, что сократит время селекции на 2-3 года. Использование исходного материала для создания новых устойчивых к антракнозу сортов льна-долгунца будет способствовать повышению урожайности льнопродукции, улучшению качества волокнистой продукции на 1-2 сортономера, сокращению затрат на закупку и применение химических средств защиты на 1,5-2,0 тысячи рублей на 1 га, благоприятно скажется на экологии.

Указанный технический результат достигается за счет того, что растения льна-долгунца выращивают на высоком агротехническом фоне; получают токсичный культуральный фильтрат гриба Colletotrichum lini; культивируют незрелые 8-9-суточные зародыши льна-долгунца на модифицированной селективной среде MS или Sh-2, содержащей 35,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты; переносят сформированный первичный морфогенный каллус на модифицированную селективную среду MS или Sh-2, содержащую 40,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивируют морфогенный каллус на среде MS или Sh-2, не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза; культивируют морфогенный каллус на модифицированной селективной среде MS или Sh-2, содержащей 60,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и гормоны в составе 1,0 мг/л кинетина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивируют морфогенный каллус на среде, не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза, до формирования побегов; укореняют побеги на среде до получения растений-регенерантов.

Предлагаемый способ получения регенерантов льна-долгунца in vitro, устойчивых к антракнозу, осуществляется следующим образом. Семена перспективных линий, сортов, гибридов F1 и гибридных популяций льна-долгунца, доноров незрелых зародышей, высевают в сосуды Митчерлиха с площадью питания одного растения 25 см. Перед посевом в почву вносят минеральные удобрения из расчета: аммиачная селитра - 1,47 г/сосуд, хлористый калий - 1,58 г/сосуд, суперфосфат двойной - 2,4 г/сосуд. Подкармливают донорные растения, начиная с фазы "елочка", каждые две недели раствором вышеуказанных минеральных удобрений, взятых в половинной дозе. С целью обеспечения оптимальных условий вегетации проводят полив растений, при этом норма расхода воды изменяется в соответствии с фазой роста растений и погодными условиями.

Для введения в культуру in vitro отбирают коробочки и семена от хорошо развитых, типичных растений без признаков поражения вредителями и болезнями. Коробочки с незрелыми зародышами и семенами стерилизуют при мягком режиме, используя этанол в концентрации 70% с экспозицией 30 секунд. После чего коробочки, семена переносят в 1%-ный раствор Хлорамина "Б" и выдерживают в нем 2-5 минут. По окончании экспозиции проводят многократную промывку материала стерильной дистиллированной водой.

Антракноз в стерильных условиях выделяют в чистую культуру, изучают по культурально-морфологическим признакам, патогенности и вирулентности и культивируют на сусло-агаровой питательной среде в термостате при температуре +2+9°С.

Перед тем как приступить к получению культурального фильтрата гриба, определяют жизнеспособность патогена по следующим критериям: линейный рост конидий, интенсивность образования макро-, микроконидий, плотность конидий в 1 см, количество проросших спор. Интенсивность спорообразования и жизнеспособность спор определяют в капле дистиллированной воды с помощью камеры Горяева под микроскопом МБИ-6. Количество спор в 1 см³ рассчитывают по формуле

N/20×10⁶,

где N - количество конидий в поле зрения микроскопа в камере Горяева.

Жизнеспособность считается высокой при прорастании 75-85% спор патогена.

Для получения токсических метаболитов гриба в жидкую питательную среду Sh-2, не содержащую аминокислоты, витамины, фитогормоны, агар, в объеме, равном 500 мл на повторность, помещают кусочек колонии гриба размером 1,0×1,0 см, содержащий около 10⁶ спор, перемешивают содержимое колбы для диспергирования сгустков конидий и инкубируют в течение 40 суток при 26°С в условиях термостата. После чего мицелий отфильтровывают через фильтровальную бумагу. Фитотоксические свойства полученного культурального фильтрата определяют путем замачивания в нем семян льна в течение 24 часов. Для этого в чашки Петри, выложенные фильтровальной бумагой, наливают фильтрат в количестве 10 мл, раскладывают предварительно простерилизованные по вышеуказанной методике семена льна по 10-15 шт. на 1 чашку. Учет проводят визуально на 5-е сутки. Культуральный фильтрат считается токсичным, если отмечено угнетение и гибель более 40% проростков устойчивого к антранозу сорта Леона. Подготовленный культуральный фильтрат хранят в условиях морозильной камеры. При использовании его размораживают и вносят в среду в качестве селективного агента в определенных концентрациях.

Незрелые 8-9-суточные зародыши льна-долгунца изолируют в стерильных условиях ламинарного бокса и культивируют на модифицированной селективной среде (MS или Sh-2), содержащей 35,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты. В 1 биологическую пробирку помещают зародыши, находящиеся в одной коробочке (обычно 5-10 шт.). Для достижения оптимальных результатов изолируют 50 незрелых зародышей каждого генотипа, включенного в процесс селекции in vitro.

Сформированный первичный морфогенный каллус переносят на модифицированную селективную среду (MS или Sh-2), содержащую 40,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Морфогенный каллус отбирают и культивируют на среде (MS или Sh-2), не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза. Пересадочный морфогенный каллус переносят на модифицированную селективную среду (MS или Sh-2), содержащую 60,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и гормоны в составе 1,0 мг/л кинетина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Морфогенный каллус культивируют на среде (MS или Sh-2), не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза, до формирования побегов. Укоренение побегов осуществляется на среде (MS или Sh-2), содержащей питательные вещества по прописи в концентрации 50% и регуляторы роста в составе 0,02 мг/л 6-бензиламинопурина +0,001 мг/л α-нафтилуксусной кислоты, до получения растений-регенерантов. Регенеранты извлекают из культивационного сосуда, промывают от остатков среды, высаживают в грунт и адаптируют к обычным условиям выращивания.

Тестирование регенерантов по устойчивости к антракнозу осуществляют на искусственном инфекционно-провокационном фоне в полевых условиях. Для его создания составляют искусственную популяцию патогена, состоящую из 45-50% сильновирулентных и 50-55% средневирулентных штаммов возбудителя антракноза, вносят ее в почву и проводят посев семян и выращивание растений. Перед уборкой проводят оценку растений на устойчивость к болезни. Определяют количество пораженных растений и степень развития болезни. Сорта и селекционные номера льна по степени устойчивости классифицируют по следующим показателям: со степенью развития антракноза до 30% - устойчивые; 31-50% - средневосприимчивые; 51-75% - восприимчивые; свыше 75% - сильновосприимчивые.

Зависимость морфогенетического потенциала льна-долгунца от гормонального состава селективной среды в 4 пассаже Генотип Концентрация КФ*, мл/л Наименование и концентрация регуляторов роста, мг/л Количество сформированных морфогенных каллусов, % ±Sp Сформировано побегов, устойчивых к КФ шт. % шт./1 каллус Среднее по генотипам 60,0 1,0 Ва** + 0,05Naa*** (К) 14,0±3,5 2 - 0,027 1,0 Ва + 0,05 2,4Д**** 17,0±4,2 1 50 0,013 1,0 Kin***** + 0,05 Naa 19,3±3,1 4 200 0,053 1,0 Kin + 0,05 2,4Д 39,8±2,6 6 300 0,08 Примечание: КФ* - культуральный фильтрат; Ва** - 6-бензиламинопурин; Naa*** - α-нафтилуксусная кислота; 2,4Д**** - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; Kin***** - кинетин.

Характеристика линий льна-долгунца, полученных в результате селекции in vitro на устойчивость к антракнозу Генотип Устойчивость к антракнозу, % 2008 г. 2009 г. 2010 г. НЛ-40р2 57,5 46,4 62,5 Л 1506-8-6, исх* 35,0 32,7 38,2 % к исх** +22,5 +13,7 +24,3 НЛ-40р1 52,8 47,7 57,2 Л 1506-8-6, исх 35,0 32,7 38,2 % к исх +17,8 +15,0 +19,0 НЛ-29р2 64,7 47,7 52,3 Л 957-8-4, исх 56,8 47,3 37,5 % к исх +7,9 +0,4 +14,8 НО-65 70,0 50,0 64,1 Славный 82, исх 53,0 29,1 38,2 % к исх +17,0 +20,9 +25,9 Примечание: исх* - исходный генотип, включенный в процесс селекции, взятый за 100%; % к исх** - %-ное увеличение по отношению к исходному генотипу

Источники информации

1. Курчакова Л.Н. Методика получения культуральных фильтратов гриба Fusarium oxysporum и F.Semitectum и их применение в культуре in vitro для получения фузариозоустойчивых форм льна-долгунца. Сб. трудов ВНИИЛ, 1994, вып.28-29, с.125-130.

2. Пролетова Н.В., Лошакова Н.И., Поляков А.В. Получение растений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к фузариозному увяданию, методами in vitro (культура пыльников, клеточная селекция): Метод. рекомендации. - Торжок, 2008. - 20 с.

Изобретение относится к селекции растений, в частности льна, и может быть использовано в практической работе для ускорения создания линий льна, устойчивых к антракнозу, путем использования незрелых зародышей и культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini. Для этого незрелые 8-9-суточные зародыши льна-долгунца культивируют на модифицированной селективной среде (MS или Sh-2), содержащей 35,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты. Сформированный первичный морфогенный каллус переносят на модифицированную селективную среду (MS или Sh-2), содержащую 40,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Далее культивируют морфогенный каллус на модифицированной селективной среде (MS или Sh-2), содержащей 60,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и гормоны в составе 1,0 мг/л кинетина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Затем культивируют морфогенный каллус на среде, не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза, до формирования побегов и укореняют побеги на среде до получения растений-регенерантов. Изобретение позволяет повысить частоту регенерации генотипов льна-долгунца в селективных условиях до 35% и ускорить создание линий льна, устойчивых к антракнозу.

Способ получения регенерантов льна-долгунца, устойчивых к антракнозу in vitro, включающий выращивание растений льна-долгунца на высоком агротехническом фоне; получение токсичного культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini; культивирование незрелых 8-9-суточных зародышей льна-долгунца на модифицированной селективной среде (MS или Sh-2), содержащей 35,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты; перенос сформированного первичного морфогенного каллуса на модифицированную селективную среду (MS или Sh-2), содержащую 40,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и регуляторы роста в составе 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивирование морфогенного каллуса на среде MS или Sh-2, не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза; культивирование морфогенного каллуса на модифицированной селективной среде MS или Sh-2, содержащей 60,0 мл/л культурального фильтрата гриба Colletotrichum lini и гормоны в составе 1,0 мг/л кинетина +0,05 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивирование морфогенного каллуса на среде, не содержащей токсические метаболиты гриба-возбудителя антракноза, до формирования побегов; укоренение побегов на среде до получения растений-регенерантов.