СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO, ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСОВ И РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ВЗДУТОПЛОДНИКА СИБИРСКОГО (PHLOJODICARPUS SIBIRICUS (STEPH.) К.-POL.), С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ ПЕРВИЧНЫХ ЭКСПЛАНТОВ ВЕГЕТАТИВНЫХ И ГЕНЕРАТИВНЫХ ОРГАНОВ Российский патент 2022 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области введения в культуру invitro, получения каллусных культур и растений-регенерантов на твердых агаризованых средах, с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.). Изобретение представляет собой разработку способа получения асептических первичных эксплантов, каллусных культур и растений-регенерантов, включающих установление оптимальных условий стерилизации эксплантов, определение первичного потенциала каллусообразования различных тканей эксплантов и среды культивирования, способствующей индукции каллусогенеза, морфогенеза и органогенеза. Изобретение может быть использовано для получения культуры каллусных тканей и ускоренного размножения вздутоплодника сибирского.

Вздутоплодник сибирский Phlojodicarpus sibiricus (Fisch. ex Spreng.) Koso-Pol.) - в переводе на якутский бөрө сиир ото [1] или Сибиир хабах aha[2]. Представитель семейства Зонтичные (Сельдерейные) - ApiaceaeLindl. Многолетнее травянистое стержнекорневое растение до 50 см высотой. Листья дважды-трижды рассеченные или перистые, стеблевые листья в числе 1-2. Зонтики щитковидные с 6-16 (28) лучами, обертка из 5-7 голых листочков. Плоды с узкими спинными и широкими крыловидными плоскими белыми краевыми ребрами, голые или негусто опушенные [2, 3]. Данный вид распространен в Якутии, в среднем течении р. Лена, р. Нюя, Вилюй, Токко, Чара, Алдан, Юдома, Амга; р. Яна, Индигирка, юго-западные остроги Верхоянского хр. Вне Якутии, в южной части Красноярского края, Даурия, бассейн р. Амур, Охотское побережье, Сахалин [3]. Встречается на каменистых степях, в частности нителистниковых, часто в привершинных частях сопок, на опушках степных лесов и зарослей кустарников, на щебнистых склонах, реже на песках [4]. По данным О.Д. Васильевой [5] вздутоплодник сибирский в Якутии встречается в высокогорном и горном поясе.

Ввиду разорванности ареала и изреженности ресурсы вздутоплодника на территории Якутии ограничены. Запас корней в Олекминском районе колеблется от 307 до 1369 кг/га [6]. На состояние популяций вида отрицательное воздействие оказывается также хозяйственная деятельность и строительство нефтепровода [3]. В Якутии культивируется с 1977 г. В ботаническом саду ИБПК СО РАН привлечен: Ленские Столбы, берег р. Алдан, в окр. Томмот, хр. Кюнняхтас в 100 км от пос.Депутатский, Олекминский р-н, устье р. Улахан-Сегеляннях [7].

В культуре высокоустойчив, ежегодно цветет и плодоносит, размножается семенами [8, 9]. Ежегодно цветет и плодоносит томмотская популяция, остальные при ежегодном цветении плодоносят нерегулярно и слабо. Все образцы дают самосев разной степени обильности. В отдельные годы повреждается тлей, корневища привлекают мышей-полевок [10]. Имеются сведения о затрудненном прорастании свежесобранных семян вздутоплодника сибирского, которое и после 6 месяцев сухого хранения не снимается. Лабораторная всхожесть у свежесобранных семян достигает до 10 - 20%, после 6 месяцев хранения всхожесть понижается до 6-8% [11]. На затрудненное прорастание свежесобранных семян указывают, и другие авторы по данным Е.В. Тюриной [12] семена вздутоплодника сибирского находятся в состоянии физиологического покоя, обусловленного недоразвитием зародыша. Рентгенографический анализ семян выявил наличие пустых и поврежденных вредителями семянок [11].

У народов Сибири и Якутии к числу особо ценных растений относят Phlojodicarpus sibiricus, используемого в качестве пищевого и лекарственного растения. В этномедицине народов Якутии его применяли при ожирении, туберкулезе легких, заболеваниях щитовидной железы, сердца, желудка и пищевода, включая раковые опухоли, а также ревматизме [13]. В официальной фармацевтике Ph.sibiricus, как источник кумаринов, использовался при производстве препаратов спазмолитического действия димидина и фловерина, и препарата сердечнососудистого действия сафинора, производство которых на сегодняшний день приостановлено по причине сокращения численности популяций и, соответственно, отсутствия сырья [14-17]. В работе [18] показано, что общее содержание кумаринов варьировало от 36,16 мг / г травы до 98,24 мг / г корней.

Внесен в списки редких растений [3, 19-21]. Вид, численность популяции которого сокращается в результате чрезмерного хозяйственно-полезного использования (категория 2б) [3].

Наряду с традиционными способами сохранения редких и исчезающих видов все чаще используются альтернативные биотехнологические методы [22-24]. Эффективные методы культивирования invitro разработаны в отношении значительного числа редких и исчезающих видов растений, а также хозяйственно значимых видов растений, что обусловлено сохранением генетических ресурсов, пищевой и лекарственной ценностью [24, 25-28]. Для введения различных видов растений в культуру in vitro в качестве эксплантов используют надземные и подземные органы, фрагменты их ткани и семена. На первом этапе это реализуется введением в культуру in vitro тканей различных органов растений. Данный процесс может сопровождаться значительным грибковым и бактериальным инфицированием и всегда требует подбора условий стерилизации эксплантов, включающих определение типа антисептика и времени воздействия. Успех дальнейшего культивирования на питательных средах во многом зависит от типа ткани, подбора оптимальной среды культивирования с определенным составом микро- и макроэлементов, регуляторов роста и т.д. [29-32].

Известны способы получения каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) использующих в качестве первичных эксплантов асептические проростки из семян для получения суспензионных культур (см. RU №2723043, кл. C12N 5/00, опубл. 08.06.2020) и адвентивных корней в условиях in vitro (см. RU №2666920, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.09.2018)[33, 34].

Авторами не установлены данные о получении каллусов и растений-регенерантов in vitro из обертки соцветий, собственно соцветий и цветов, а также корней вздутоплодника сибирского.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа введения в культуру in vitro, получения каллусов и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) из вегетативных и генеративных органов материнского растения для получения каллусных культур и ускоренного размножения редкого, лекарственного вида вне зависимости от сезонности.

Поставленная задача решена тем, что установлены оптимальные условия стерилизации эксплантов, определены участки тканей вегетативных и генеративных органов, обладающих высоким уровнем способности к дедиференцировки и каллусогенезу, установлены концентрации ауксинов и цитокининов способствующих морфогенезу и органогенезу для получения асептических растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна»,каллусы и растения-регенеранты вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) впервые получены в условиях in vitro с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов материнского растения из коллекционного питомника Ботанического сада Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу введения в культуру in vitro, в качестве первичных эксплантов взяты вегетативные и генеративные органы вздутоплодника сибирского, определены ткани, обладающие высоким потенциалом к каллусогенезу, которые помещают на агаризованную питательную среду соответствующего гормонального состава для получения каллусов и затем растений-регенерантов.

Изобретение может быть реализовано следующим образом.

(1)Поверхностная стерилизация органов вздутоплодника сибирского.

Для получения асептических эксплантов из соцветий, заключенных в оберточный лист - промыть в течение 1 минуты в асептической воде, затем в 70% этиловом спирте в течение 1 минуты и 0,1% растворе сулемы 3 мин, далее ополоснуть в стерильной воде.

Для корней в диаметре, не превышающем 1 см - тщательно промыть и почистить под струей водопроводной воды, трижды ополоснуть дистиллированной водой, затем 30 сек в 70% этиловом спирте, 5 мин в 0,1% растворе сулемы, трехкратно ополоснуть стерильной водой (суммарно около 20 мин).

(2) Получение первичной каллусной культуры и последующие пассажи

При получении первичной каллусной культуры из соцветий и оберточного листа (Фиг. 1. (1-4)), с учетом наилучшего потенциала в порядке уменьшения, используют основание оберточного листа (1), разделенное на кусочки размером около 4 мм, листочки обертки (2), одиночные зачаточные цветы с участком цветоножки (3), а также зонтики зачаточных цветов с небольшой частью луча первого порядка (4). Для получения каллусов из корней используют фрагменты корня (5) размером 3х3 мм (Фиг. 1).

Подготовленные вышеописанным способом экспланты помещают для дальнейшего культивирования в чашки Петри на агаризованную (5-6% агара, 30% сахарозы) питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга [32], дополненную нафтилуксусной кислотой (НУК) и 6-бензиламинопурином (БАП) в диапазоне концентраций 0.2-2.0 и 0.25-0.5 мг/л, соответственно. Проведение культивирования в свето-культуральной комнате при 24±1°С, 16-часовом фотопериоде, освещенности 3000 люкс (или в темноте) и 70% влажности. Дальнейшее пассирование для получения наибольшей фитомассы каллусных культур на аналогичных средах. Цвет каллуса имел различную окраску светло-желтый, светло-зеленый, светло-зеленый с фиолетовыми вкраплениями, фиолетовый (Фиг. 2а).

По консистенции морфогенные каллусные культуры формируются рыхлыми, плотными, глобулярными(Фиг. 2б). По мере отмирания каллус приобретает коричневую окраску, а в результате длительного пассирования каллус фиолетового окраса видоизменяется на светло-зеленый. Время жизни каллусов вне зависимости от первичного типа экспланта составляет около 45 суток (Фиг. 3).

3) Получение растений-регенерантов из морфогенного каллуса.

Дальнейшее микроразмножение осуществляют разделением морфогенного каллуса, содержащего эмбриоиды, и культивированием в биологических пробирках на аналогичной среде, дополненной ауксинами и цитокининами. Наилучший органогенез наблюдается на средах с широким диапазоном концентраций (0.1-2 мг/мл) различных фитогормонов (НУК, 2,4-Д, ИУК, ИМК) и их сочетаний, кроме БАП, который вызывает индукцию каллусогенеза. Укоренение побегов проводят с использованием среды содержащей ИМК 0.5-2.0 мг/л на которой формируются растения-регенеранты (Фиг. 4). Длительность пассажей составляет около 60 дней.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает получение каллусных культур и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.), относящегося к редким лекарственным видам растений, с целью сохранения и воспроизводства как в природе, так и питомниках, а также для дальнейшего использования каллусов в качестве ценного источника вторичных метаболитов.

Литература

1. Атлас лекарственных растений Якутии. Т1: Лекарственные растения, используемые в научной медицине/ Сост. Л.В. Кузнецова, В.И. Захарова, А.А. Егорова и др.; Отв. ред. Б.И. Иванов. - Якутск: ЯФ Изд-ва СО РАН, 2003. - 194 с.

2. Определитель высших растений Якутии / Е.А. Афанасьева, К.С. Байков, А.А. Бобров и др. - 2-е изд., перераб. и доп. - Москва: Товарищество научных изданий КМК; Новосибирск: Наука, 2020. - 896 с.

3. Красная книга Республики Саха (Якутия). Т. 1: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды растений и грибов / Отв. ред. Н. С. Данилова. - Москва: Реарт, 2017. - 412 с.

4. Пименов М.Г. Семейство Apiaceae, или Umbelliferae - Сельдерейные или Зонтичные // Флора Сибири. - Т. 10. Geraniaceae - Comaceae. - Новосибирск, 1996. - С.123-194.

5. Васильева О.Д. Вздутоплодник сибирский Phlojodicarpussibiricus (Steph. ExSpreng.) K.-Pol. В Якутии (Биология, интродукция, охрана): автореф. Дис.На соиск. учен. степ.канд. биол. наук: 03.00.05 / Ольга Дмитриевна Васильева - Якутск, 2005. - 20 с.

6. Макаров А.А. Биологически активные вещества в растениях Якутии. - Якутск: ЯНЦ СО РАН, 1989. - 156 с.

7. Интродукция растений природной флоры Сибири/науч. Ред. А.Н.Куприянов, Е.В. Банаев; Рос.акад. Наук, Сиб. отд-ние, Центрально-сибирский ботанический сад; Кузбасский ботанический сад ФИЦ угля и углехимии СО РАН. - Новосибирск: Академическое изд-во «Гео», 2017. - 495 с.

8. Данилова Н.С.Интродукция многолетних травянистых растений Якутии. Якутск: ЯНЦ СО РАН, 1993. С.144.

9. Данилова Н.С., Борисова С.З., Иванова Н.С.Декоративные растения Якутии: Атлас-определитель.: ЗАО «Фитон+», 2012. 248 с.

10. Кадастр интродуцентов Якутии: Растения природной флоры Якутии / Н.С.Данилова, С.З Борисова, А.Ю. Романова и др. - М.: МАИК «Наука / Интрепериодика», 2001. - 167 с.

11. Андросова Д.Н. Эколого-биологические особенности прорастания семян травянистых растений природной флоры Якутии при интродукции: диссертация на соиск. учен. степ. канд. биол. наук: 03.02.08. / Дария Николаевна Андросова - Якутск, 2021. - 181 с.

12. Тюрина Е. В. Интродукция зонтичных в Сибири / Е. В. Тюрина. - Новосибирск: Наука, 1978. - 239 с.

13. Kuznetsova, L.V.; Mikhaleva, L.G.; Zakharova, V.I. (Eds.) Atlas of Medical Plants of Yakutia. Medical Plants Used in Ethnomedicine. Yakutsk: Yakutian Scientific Center. 2005. V. 2. Р. 2-163.

14. Пименов М.Г., Бабилев Ф.В., Никонов Г.К. Phlojodicarpus Turcz. И Libanotis L. Как источники получения кумаринов со спазмолитической активностью // Растительные ресурсы. 1968. Т.4. №4. С. 486 - 491.

15. Громакова А.И., Исайкина А.П., Кривут Б.А., Вандышев В.В. Изучение содержания виснадина и дигидросамидина в сырье вздутоплодника сибирского // Хим. -фарм. журн. 1982. Т. 16. №4. С. 60-66.

16. Кабанов B.C., Громакова А.И., Перельсон М.Е. Газохроматографический метод количественного определения суммы виснадина и дигидросамидина в сырье вздутоплодника сибирского // Хим.-фарм. журн., 1982. №4. - С.444 - 550.

17. Пузанова H.A., Бурова А.Е., Громакова А.И. Принципы отбора исходного материала Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) К.- Ро1.для интродукции // Растительные ресурсы. Выпуск 1, 1991. С.113 - 117.

18. DaniilN. Olennikov, InnokentiiA. Fedorov,NinaI. Kashchenko, NadezhdaK. Chirikova, CecileVennos. Khellactone Derivatives and Other Phenolics of Phlojodicarpus sibiricus(Apiaceae): HPLC-DAD-ESI-QQQ-MS/MS and HPLC-UV Profile, and Antiobesity Potential of Dihydrosamidin. Molecules. 2019 Jun; 24(12): 2286.

19. Красная книга Амурской области: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных, растений и грибов: официальный справочник / Упр. по охране животного мира Амур. обл.; Дальневост.гос.аграр. ун-т; Благовещенский гос.пед. ун-т; Амур. филил. Бот.сада-ин-та ДВО РАН; гл. ред. А. В. Сенчик; науч. ред. Е. И. Маликова. - Благовещенск: Изд-во Дальневост.гос.аграр. ун-та, 2019. - 499 с.

20. Красная книга Читинской области и Агинского Бурятского автономного округа: Растения / редколлегия А.П. Островский и др. - Чита: Стиль, 2002. - 280 с.

21. Красная книга Забайкальского края, 2016 (Постановление от 16 февраля 2010 года N 52 об утверждении перечня объектов растительного мира, занесенных в Красную книгу Забайкальского края (в редакции Постановлений Правительства Забайкальского края от 04.02.2014 N 20, от 27.05.2014 N 290, от 25.08.2015 N 428, от 24.08.2016 N 362).

22. Bakhshaie M., Khosravi S., Azadi P., Bagheri H., TuylJ.M. Biotechnological advances in Lilium // Plant Cell Rep.2016. Vol.35. №9. P. 1799-1826.

23.Мурасева Д.С., НовиковаТ.И. Индукция культуры in vitro редкого вида Fritillaria meleagroides Patrin ex Schult. et Schult. fil. (Liliaceae) с использованием незрелых семян // Вестник томского государственного университета. Биология. 2018. №44. С.172-187.

24. Ветчинкина Е.М., Ширнина И.В., Ширнин С.Ю., Молканова О.И. Сохранение редких видов растений в генетических коллекциях invitro // Вестник Балтийского федерального университета им. И.Канта. Естественные и медицинские науки. 2012. Вып.7. С.109-118.

25. Браткова Л.Г., Цаценко Н.Н., Мащенко М.Н., Макаров К.А. Введение в культуру in vitro меристемных эксплантов яблони разного генетического происхождения // Сельскохозяйственный журнал. 2020. №1(13). С 12-18.

26. Маляровская В.И., Рахмангулов Р.С., Конинская Н.Г. Введение в культуру invitroOsmundaregalisL. // Субтропическое и декоративное садоводство. 2020. №72. С.86-93.

27. Гвасалия М.В., Маляровская В.И., Рахмангулов Р.С. Влияние регуляторов роста на индукцию каллусогенеза in vitro растений чая (Camelliasinensis (L.) O. Kuntze) // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. 2020. №2(61). С.51-56.

28. Дарханова В.Г., Строева Н.С., Барашкова Н.В. Об особенностях начального этапа клонального микроразмножения бадана толстолистного (BergeniacrassifoliaL.) invitro в Якутии // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского аграрного университета. 2016. №121. С.860-868.

29. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М: Наука, 1964. 272 с.

30. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Науковадумка. 1980. 320 с.

31. Gambourg O.L., Elevegh D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of weat and parleys // Can. J. Biochem. 1968. Vol.46. P. 417-421.

32. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. Vol.15. P. 473-476.

33. Ханды М.Т., Томилова С. В., Кочкин Д.В., Носов А.М. Штамм каллусных культур клеток вздутоплодника сибирского Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. для получения биомассы клеток. Патент RU №2723043, кл. C12N5/00, опубл. 08.06.2020.

34. Ханды М.Т., Алексеева С.И., Кучарова Е.В. Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro. Патент RU №2666920, кл. А01Н 4/00, опубл. 13.09.2018.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области введения в культуру in vitro, получения каллусных культур и растений-регенерантов на твердых агаризованых средах, с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. Изобретение представляет собой способ, включающий установление оптимальных условий стерилизации первичных эксплантов, определение потенциала каллусообразования различных органов и тканей в зависимости от типа эксплантов и среды культивирования, способствующей индукции каллусогенеза, морфогенеза и органогенеза. Время жизни каллусов вне зависимости от первичного типа экспланта составляет около 45 суток. Цвет каллуса имеет различную окраску: светло-желтый, светло-зеленый, светло-зеленый с фиолетовыми вкраплениями, фиолетовый. По мере отмирания каллус приобретает коричневую окраску. По консистенции морфогенные каллусные культуры рыхлые, плотные, глобулярные. Органогенез наблюдается на средах Мурасиге-Скуга с широким диапазоном концентраций (0.1–2.0 мг/мл) фитогормонов и их сочетаний (нафтилуксусная кислота, 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота, индолилуксусная кислота, индоли-3-масляная кислота (ИМК), кроме 6-бензиламинопурина, добавление которого вызывает индукцию каллусогенеза. Укоренение побегов целесообразно проводить с использованием среды, содержащей ИМК, ускоренного размножения вздутоплодника сибирского в условиях in vitro. Изобретение позволяет использовать в качестве эксплантов соцветия, оберточные листы, корень, позволяющие вне зависимости от сезона года получать растения-регенеранты редкого лекарственного вида. 4 ил.

Способ микроклонального размножения in vitro вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) осуществляется на питательной среде Мурасиге-Скуга из соцветий, оберточного листа и корня материнского растения.