СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ОЛЬХИ ЧЕРНОЙ IN VITRO Российский патент 2014 года по МПК A01H4/00 A01G7/00 A01G23/00 

Изобретение относится к области биотехнологии растений.

Ольха черная (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) перспективна для лесного хозяйства страны, она способна выдерживать длительное затопление и произрастать на переувлажненных экотопах там, где другие древесные породы расти не могут, способна произрастать на бедных и бесплодных сухих почвах (гравий, песок) с близко залегающими грунтовыми водами, способна обогащать почву азотом через опад и корневые выделения (до 780 кг/га за 5 лет). Благодаря этому качеству черная ольха при совместных посадках с более ценными породами оказывает на них положительное влияние. Уникальна биосферная роль ольхи черной в болотной экосистеме, что делает ее привлекательной для экологов, лесоводов, селекционеров. Незаменима она при разработке моделей устойчивого и ускоренного повышения продуктивности насаждений, при плантационном лесоводстве для ускоренного получения древесины.

В связи с важностью выращивания селекционных форм и сортов ольхи черной существует необходимость получения посадочного материала с высокими наследственными свойствами. В уровне техники не выявлен способ решения поставленной задачи.

Предлагаемое изобретение решает задачу создания наиболее эффективного способа размножения ольхи черной - микроклональное размножение in vitro.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro включает культивирование каллусных культур из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков, используя базовые питательные среды Мурасиге-Скуга (MS), Вуди Плант Медиум (WPM) с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,2÷1,5 мг/л, α-нафтилуксусная кислота (НУК) - 0,2÷0,5 мг/л, индолилмасляная кислота (ИМК) - 2 мг/л, и дальнейшей адаптацией при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице, и получением посадочного материала для лесных культур.

Осуществляют способ следующим образом.

Для каллусных культур эксплантами служат стеблевые сегменты без почек, листья, листовые черешки.

В качестве базовых сред используют MS или WPM и их модификации с различным содержанием и соотношением регуляторов роста (6-БАП, ИУК, НУК, ИМК). При прямой регенерации используют 6-БАП (0,2-1,5 мг/л), индукции множества почек и побегов - 6-БАП в сочетании с НУК (0,2-0,5 мг/л). Каллусные культуры получают с помощью ИМК (2 мг/л) в сочетании с 6-БАП (0,2-0,5 мг/л). Исключение ИМК в дальнейшем и увеличение концентрации 6-БАП до 1 мг/л используют для получения морфогенных каллусных культур. Для пролиферации каллуса ольхи черной в питательную среду вносят ИМК (2 мг/л) в сочетании с 6-БАП (0,2-0,5 мг/л). Развитие, удлинение побегов достигается согласно следующим приемам: солевой состав питательной среды разбавляют в 2-3 раза, дополняют ее активированным углем (10-20 г/л), обрабатывают базальные концы побегов раствором ИМК (25 мг/л в течение 10-15 минут).

Адаптационный этап развития регенерированного материала предусматривает следующие варианты:

1 - лабораторный (открытые пробирки в течение 3-5 дней, затем высаживают в грунт стаканчики, доращивают в микротеплице с последующей высадкой в открытый грунт).

2 - прямая высадка в открытый грунт с использованием временного укрытия (пленочные микротеплицы).

В первом варианте экологические условия контролируемые (t 25-26°C, освещенность 2000 люкс при 16-часовом фотопериоде); во втором - естественные условия освещения и температуры. Повышенная влажность достигается поливом и пленочным укрытием.

Эффективность каллусогенеза разных органов ольхи на питательной среде MS+ИМК (2 мг/л) отражена в таблице 1.

Таблица 1 Экспланты Эффективность каллусогенеза Количество культур Темп каллусогенеза (сутки) Объем ткани (см³) общее С каллусом, % Ольха черная стеблевые сегменты 15 100 21 1,5-2 черешки 10 40,0 30 следы листья 11 9,9 30 следы

В таблице 2 отражена эффективность морфогенеза у культур различного происхождения (каллусные, стеблевые сегменты) на среде WPM в зависимости от содержания БАП мг/мм:

Таблица 2 БАП мг/мм Ольха черная каллусная культура почки общее количество   общее количество   0,1 5 - 10 - 0,2 5 - 10 - 0,5 6 1/16,6 10 4/40,0 0,6 5 2/40,0 10 7/70,0 1,0 5 - 10 2/20,0 1,5 5 - 10 - 2,0 - - 10 -

Продолжительность жизни морфогенных культур ольхи по сравнению с другими лиственными (береза) значительно ниже и ограничена 2-3 неделями.

Для их сохранения необходимо повторное рекультивирование. В противном случае независимо от происхождения в культурах отмечен интенсивный рост каллусной ткани, как правило, подавляющий развитие побега.

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к микроклональному размножению in vitro. В способе культивируют каллусные культуры из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков. Используют базовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Вуди Плант Медиум с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин - 0,2-1,5 мг/л, α-нафтилуксусная кислота - 0,2-0,5 мг/л, индолилмасляная кислота - 2 мг/л. Далее проводят адаптацию при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице с получением посадочного материала для лесных культур. Способ позволяет получать посадочный материал с высокими наследственными свойствами. 2 табл.

Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro, включающий культивирование каллусных культур из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков, используя базовые питательные среды Мурасиге-Скуга, Вуди Плант Медиум с содержанием и соотношением регуляторов роста: 6-бензиламинопурин - 0,2-1,5 мг/л, α-нафтилуксусная кислота - 0,2-0,5 мг/л, индолилмасляная кислота - 2 мг/л, и дальнейшей адаптацией при освещенности 2000 люкс и питательном режиме регенерантов в теплице, и получением посадочного материала для лесных культур.